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    實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)痰及血液中結(jié)核桿菌的臨床應(yīng)用研究

    2021-11-28 11:49:54易瓊英王甜恬
    保健文匯 2021年4期
    關(guān)鍵詞:涂片外周血定量

    文 /易瓊英,王甜恬

    肺結(jié)核疾病的致病菌為結(jié)核桿菌。結(jié)核桿菌在傳播過(guò)程中,受體細(xì)胞的免疫功能降低,同時(shí),還會(huì)對(duì)患者多處器官造成損傷。據(jù)有關(guān)統(tǒng)計(jì)表明:國(guó)內(nèi)肺結(jié)核的發(fā)病率相對(duì)較高,且逐年提升。所以,肺結(jié)核需要做好早期診斷,才能夠有效控制傳染,還可以對(duì)患者的預(yù)后效果產(chǎn)生良好的改善作用。由此可見(jiàn),通過(guò)有效的診斷方法對(duì)結(jié)核病患者的病情進(jìn)行準(zhǔn)確判斷,意義重大[1]。因此,作者抽取我院于2019年08月至2020年12月期間收治的結(jié)核病患者508例作為研究對(duì)象,分析實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)法的檢測(cè)效果,現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

    1 資料與方法

    1.1 一般資料

    我院于2019年08月至2020年12月期間收治的結(jié)核病患者508例作為研究對(duì)象,其中269例女性患者,239例男性患者,年齡范圍在23-64歲之間,平均年齡為(52.21±5.76)歲,病程范圍在2個(gè)月到12年之間,平均病程為(8.46±3.46)年。通過(guò)CT以及X線檢查,患者的雙肺紋理增多,并且變粗,部分患者還會(huì)出現(xiàn)胸痛、胸悶等情況。

    1.2 方法

    一方面,于清晨,采集患者的痰標(biāo)本,將患者的痰標(biāo)本和健康人群的痰標(biāo)本進(jìn)行對(duì)比。首先需要使用雙氧水漱口,防止檢測(cè)受到影響?;颊哂昧人?,采集第二次痰液,使用無(wú)菌器皿裝好送檢,連續(xù)三天獲取痰標(biāo)本做檢測(cè),通過(guò)鏡檢,對(duì)結(jié)核桿菌的陽(yáng)性率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。余下的痰液用三倍量的4%濃度的NaOH混相混合,然后進(jìn)行室溫液化,持續(xù)20分鐘,之后離心5分鐘,獲取上清液,然后震蕩處理,再以15000r/min的速度進(jìn)行離心,持續(xù)十分鐘,進(jìn)行至少兩次的去離子水沉淀;另一方面:采集外周血。于清晨,抽取患者空腹?fàn)顟B(tài)下5ml靜脈血,將血液標(biāo)本和EDTA凝膠相混合,做抗凝處理,然后棄置血漿,紅細(xì)胞被滅菌高純水溶解之后,再次離心十分鐘,除去上清液,在沉淀標(biāo)本中加入50μL DNA提取液震蕩,然后離心5s,然后進(jìn)行沸水浴,持續(xù)10分鐘,之后將其放入4℃的水中半小時(shí),之后轉(zhuǎn)入100℃的水浴中做離心處理,保存上清液備用,裂解物在-20℃的環(huán)境下密閉保存,然后使用紫外分光光度計(jì)對(duì)RNA的濃度以及純度進(jìn)行測(cè)定。

    實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù):結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群核酸檢測(cè)試劑盒,嚴(yán)格按照試劑盒上的說(shuō)明書(shū)操作。使用25μl反應(yīng)指標(biāo)作為檢測(cè)樣本的判定標(biāo)準(zhǔn)。β-actin反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)為:72℃延伸三十秒,94℃變形三十秒,94℃預(yù)變性?xún)煞昼姡?3℃退火三十秒,共36個(gè)循環(huán),然后以擴(kuò)增條件為檢驗(yàn),72℃延伸三十秒,94℃變形30s,94℃預(yù)變性2分鐘,64℃退火30s,共42個(gè)循環(huán)。

    1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

    采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示,采用t檢驗(yàn),計(jì)數(shù)資料以率(%)表示,采用x2檢驗(yàn),以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    PCR痰定量陽(yáng)性率為46.26%(235/508),痰涂片陽(yáng)性率為14.96%(76/508),PCR外周血定量陽(yáng)性率為59.84%(304/508),外周血定量陽(yáng)性率和痰定量陽(yáng)性率要高于痰涂片陽(yáng)性率,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

    3 討論

    肺結(jié)核患者的病理診斷需要將觀察到的典型結(jié)核結(jié)節(jié)作為診斷依據(jù),對(duì)于已經(jīng)滲出的病變類(lèi)型,典型結(jié)核結(jié)節(jié)并不常見(jiàn),所以,臨床中準(zhǔn)確診斷的難度較大,具有一定的局限性。隨著PCR技術(shù)逐漸發(fā)展,檢測(cè)效率大大提升。通過(guò)熒光定量PCR檢測(cè)法,可以對(duì)靶基因序列有效鑒別,通過(guò)熒光標(biāo)記寡核苷酸探針擴(kuò)增,對(duì)特異性熒光進(jìn)行探測(cè),然后通過(guò)對(duì)熒光值的增加情況進(jìn)行檢測(cè),進(jìn)而提高臨床確診率[2]。

    熒光定量PCR檢測(cè)法的原理是通過(guò)利用結(jié)核分枝桿菌的特異性,以及其熒光反應(yīng),判定結(jié)核桿菌。通分析PCR反應(yīng)液和耐熱DNA聚合酶的變化情況,然后和4種核苷酸單體相結(jié)合,作出判斷。通過(guò)體外擴(kuò)增法檢測(cè)時(shí),對(duì)于結(jié)合分枝桿菌基因的判斷率顯著提升。但是,該方法還尚不成熟,除此之外,對(duì)標(biāo)本中的結(jié)核桿菌含量進(jìn)行動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè),其不會(huì)被細(xì)胞表型的內(nèi)在所影響,特異性以及靈敏度較高,結(jié)核桿菌的測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確率以及實(shí)效性明顯提升[3]。

    本次研究結(jié)果表明:PCR痰定量陽(yáng)性率為46.26%(235/508),痰涂片陽(yáng)性率為14.96%(76/508),PCR外周血定量陽(yáng)性率為59.84%(304/508),外周血定量陽(yáng)性率和痰定量陽(yáng)性率要高于痰涂片陽(yáng)性率。

    綜上所述,通過(guò)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)痰液和外周血中的結(jié)核桿菌來(lái)診斷肺結(jié)核,其陽(yáng)性率明顯提升,臨床診斷精準(zhǔn)度較高,值得推廣。

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