• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    核桃蛋白的組成分析及分離提取工藝的優(yōu)化

    2019-05-18 06:55:58毛曉英朱新榮萬銀松田洪磊王丹丹
    中國食品學報 2019年3期
    關(guān)鍵詞:脂粉谷蛋白核桃

    毛曉英 朱新榮 萬銀松 田洪磊 詹 萍 王丹丹

    (石河子大學食品學院 新疆石河子832000)

    核桃除部分出口和國內(nèi)鮮食銷售外,加工成核桃油、核桃粉、核桃乳等產(chǎn)品比較普遍。蛋白質(zhì)不僅是核桃油生產(chǎn)副產(chǎn)物——脫脂粕的主要成分,也是加工核桃粉和核桃乳產(chǎn)品良好的原料。隨著我國人民生活水平的提高及人們對具有醫(yī)療保健功能的核桃食品認識的提高,研究工作主要集中在核桃提油后的脫脂粕的研究。全面了解核桃蛋白質(zhì)組成是有效利用核桃脫脂粕這一核桃加工副產(chǎn)物的前提和基礎(chǔ)。

    核桃蛋白質(zhì),不僅是核桃油生產(chǎn)副產(chǎn)物——脫脂粕的主要成分,也是加工核桃粉和核桃乳產(chǎn)品良好的原料。由于各地核桃提油方法的不同,所以造成脫脂粕的成分復雜,蛋白質(zhì)功能性差異比較大,致核桃蛋白質(zhì)很難廣泛地應用到食品加工中。對核桃蛋白的分離提取研究,不僅有利于進一步了解核桃蛋白質(zhì)的性質(zhì),也能得到制備高純度蛋白的方法。

    根據(jù)核桃蛋白組成和性質(zhì)的研究報道[1-6],核桃蛋白分離提取的方法普遍采用堿溶酸沉的方法制備核桃分離蛋白[7-9]。采用的不同核桃原料和處理方法,提取堿溶蛋白時的pH 值有一定差異,酸沉點有差異,使核桃分離蛋白的純度有一定差異,產(chǎn)品的功能性也有差異。本文研究獲得較高純度的核桃分離蛋白的最優(yōu)提取工藝,為進一步研究核桃蛋白質(zhì)的功能性奠定基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    核桃(Juglans Legia L.)購于新疆石河子市農(nóng)貿(mào)市場,屬新疆和田薄皮核桃。正己烷,氫氧化鈉,鹽酸,95%乙醇,85%磷酸等購于上?;瘜W試劑公司??捡R斯亮藍G-250,牛血清白蛋白購于上海生化試劑公司。氫氧化鈉,氫氧化鈣,碳酸鈉,均為國產(chǎn)化學純試劑。

    1.2 儀器與設備

    DS-1 高速組織搗碎機,上海標本模型廠;J6大容量冷凍離心機,美國貝克曼公司;UV-2100紫外可見分光光度計,尤尼科上海有限公司;CR21G 高速冷凍離心機,日本日立公司;90-1 恒溫磁力攪拌器,上海滬西分析儀器廠;HH-S 數(shù)顯恒溫水浴鍋,江蘇金壇市醫(yī)療儀器廠;WH-1 微型漩渦混合儀,上海滬西分析儀器廠;PHS 一3C pH計,上海精密科學儀器有限公司。

    1.3 試驗方法

    1.3.1 核桃仁及脫脂粉基本成分的測定 蛋白質(zhì)含量的測定參照AOAC 950.48 的方法[10],采用微量凱式定氮法測定,核桃蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)換系數(shù)為5.30。脂肪含量的測定參照AOAC 984.22 的方法測定[11],樣品置于索氏提取器中,用石油醚來提取脂肪。灰分含量的測定參照AOAC 920.15 的方法[12]測定,將樣品置于525 ℃下煅燒4 h,稱量殘渣的質(zhì)量。水分含量的測定參照AOAC 925.40[13]的方法測定,將樣品在105 ℃±1 ℃的烘箱中干燥至恒重。碳水化合物含量的測定參照Zhu[14]的方法測定,碳水化合物含量的計算按照100%減去樣品的水分含量,灰分含量,脂肪含量及蛋白質(zhì)含量的總合。

    1.3.2 蛋白質(zhì)氮溶解指數(shù)(NSI)的測定 將一定量的核桃蛋白樣品分散于去離子水中,于室溫下磁力攪拌1 h 后離心(10 000 g,30 min)。收集上清液,上清液中可溶解氮含量用微量凱氏定氮法[10]測定,以可溶解氮與樣品中總氮的百分比表示溶解度。

    1.3.3 蛋白質(zhì)非蛋白氮(NPN)的測定 參考Wolf[15]和Wolf 等人[16]的方法,略改。稱取1.0 g 核桃脫脂粉,加入15 mL 10%(w/v)三氯乙酸溶液,在室溫下進行磁力攪拌1 h,然后在室溫下于15 000 g 離心30 min。收集上清液,用微量凱氏定氮法測定上清液中的氮含量。NPN 含量用上清液含氮量與脫脂粉中總氮含量之比(百分數(shù))表示。

    1.3.4 蛋白質(zhì)在不同溶劑中可溶解蛋白含量的測定 參考Venkatachalam[4]的方法,略改。稱取核桃脫脂粉1.0 g,加入溶劑10 mL,在室溫下磁力攪拌1 h。溶劑(最終提取液的pH)分別為:去離子水(pH 6.50),1.0 mol/L NaCl(pH 6.31),0.1 mol/L 磷酸鈉緩沖液 (pH 7.52),0.1 mol/L NaOH(pH 12.56),70%(V/V)乙醇溶液 (pH 6.28)0.1 mol/L Tris-HCl(pH 8.02)。不同溶劑提取后離心(15 000 g,30 min,室溫),收集上清液用微量凱氏定氮法[10]測定溶解蛋白質(zhì)的含量,不同溶劑溶解蛋白的含量單位為mg 蛋白質(zhì)/100 mg 脫脂粉。

    1.3.5 核桃脫脂粉的制備 參照Sze-Tao 的方法[1],略改。核桃仁用2% NaOH 浸泡4min(之前將核桃仁浸泡在水中0.5 h)的方法去除核桃仁皮后進行烘干(45~48 ℃)、粉碎等工序,采用正己烷以1∶5(w/v)的料液比提取1 h,然后進行抽濾,收集殘渣再進行提取,以濾液為無色透明時,收集殘渣,置于通風櫥揮干溶劑。將殘渣用粉碎機粉碎后過150 目篩,即為核桃脫脂粉,置于冰箱4 ℃冷藏備用。

    1.3.6 核桃蛋白組分的分離提取 參考Osborne[17]關(guān)于植物蛋白4 種蛋白的分離方法,以及參照Sze-Tao[1]關(guān)于核桃蛋白組分的分離方法,略改。以核桃脫脂粉為原料,按照圖1的流程進行清蛋白、球蛋白、谷蛋白、醇溶蛋白的分離提取,每步提取重復2 次,以利于蛋白組分的充分提取,收集不同組分的上清液,在4 ℃下透析48 h 后凍干,置于冰箱4 ℃冷藏備用。

    圖1 核桃蛋白組分分離提取工藝流程圖Fig.1 Flow chart of walnut protein fractionation

    1.3.7 蛋白質(zhì)提取率的計算

    蛋白質(zhì)提取率%=

    1.3.8 核桃蛋白分離提取工藝的優(yōu)化

    1)pH 對核桃蛋白質(zhì)提取效果的影響 以溶出蛋白質(zhì)為指標,稱取1.0 g 脫脂粉,加入20 mL的去離子水(即料液比為1∶20,w/v),在室溫下進行磁力攪拌,分別調(diào)節(jié)溶液的pH 為1~12,待溶液的pH 恒定后再進行磁力攪拌浸提1 h,然后在室溫下以10 000 g 離心10 min,取一定量的上清液用考馬斯亮藍法測定提取液的蛋白質(zhì)含量,計算不同pH 條件下蛋白質(zhì)的提取率,確定最佳提取pH。

    2)提取時間對核桃蛋白質(zhì)提取效果的影響以溶出蛋白質(zhì)為指標,稱取1.0 g 脫脂粉,加入20 mL 的去離子水(即料液比為1∶20,w/v),在室溫下進行磁力攪拌,調(diào)節(jié)溶液的pH 為11.0,待溶液的pH 恒定后分別進行磁力攪拌0.5,1,1.5,2,2.5,3,3.5 h,然后在室溫下以10 000 g 離心10 min,取一定量的上清液用考馬斯亮藍法測定提取液的蛋白質(zhì)含量,計算不同提取時間下蛋白質(zhì)的提取率,確定最佳提取時間。

    3)料液比對核桃蛋白質(zhì)提取效果的影響以溶出蛋白質(zhì)為指標,稱取1.0 g 脫脂粉,分別按料液比為1∶5,1∶10,1∶20,1∶30,1∶40,1∶50,1∶60(w/v),在室溫下進行磁力攪拌,調(diào)節(jié)溶液的pH 為11.0,待溶液的pH 恒定后進行磁力攪拌1 h,然后在室溫下以10 000 g 離心10 min,取一定量的上清液用考馬斯亮藍法測定提取液的蛋白質(zhì)含量,計算不同料液比下蛋白質(zhì)的提取率,確定最佳料液比。

    4)提取溫度對核桃蛋白質(zhì)提取效果的影響以溶出蛋白質(zhì)為指標,稱取1.0 g 脫脂粉,加入20 mL 的去離子水[即料液比為1 ∶20(m/V)],在室溫下進行磁力攪拌,調(diào)節(jié)溶液的pH 為11.0,待溶液的pH 恒定后分別調(diào)節(jié)溶液的溫度為:30,35,40,45,50,55,60,65 ℃進行磁力攪拌1 h,然后在室溫下以10 000 g 離心10 min,取一定量的上清液用考馬斯亮藍法測定提取液的蛋白質(zhì)含量,計算不同提取溫度下蛋白質(zhì)的提取率,確定最佳提取溫度。

    5)響應面分析法優(yōu)化核桃蛋白質(zhì)提取條件綜合pH、提取時間、料液比、提取溫度等對核桃蛋白質(zhì)提取效果的單因素試驗結(jié)果,由于pH 對核桃蛋白質(zhì)的提取率有很大影響,此外也影響提取蛋白質(zhì)的色澤,因此,固定提取pH 11,確定對核桃蛋白質(zhì)提取效果影響比較顯著的其他三因素為:料液比、提取溫度、提取時間,采用響應面法(RSM)(Box-Behnken 中心組合)對提取條件進行響應面分析,以蛋白質(zhì)提取率為響應值。因素與水平見表1。

    表1 響應面分析因素與水平Table 1 Levels and codes of variables chosen for response surface analysis

    1.3.9 核桃堿溶蛋白酸沉點的確定 通過堿提得到核桃蛋白提取液后,要制備分離蛋白,需要將蛋白質(zhì)溶液沉淀下來,一般選擇酸沉工藝,即將蛋白質(zhì)提取液pH 調(diào)整到等電點。根據(jù)響應面分析優(yōu)化得到的核桃蛋白提取最佳條件參數(shù),即提取pH 11,料液比1∶26,提取溫度53 ℃,提取1.5 h,得到的蛋白質(zhì)提取液,在室溫下以10 000 g 離心10 min,收集上清液,用0.1 mol/L HCl 調(diào)節(jié)上清液的pH 分別為3,3.5,4,4.5,5,5.5,6。待蛋白液的pH穩(wěn)定后進行磁力攪拌1 h,然后在室溫下以10 000 g 離心10 min,取一定量的上清液用Bradford 法[18]測定蛋白質(zhì)含量,以上清液中可溶性蛋白質(zhì)含量(mg/100 mg 脫脂粉)最低為核桃堿溶蛋白酸沉點。

    1.3.10 數(shù)據(jù)處理與分析 試驗數(shù)據(jù)以均值±標準誤差的形式表示,數(shù)據(jù)采用SPSS 11.0 (Chicago,Illinois)統(tǒng)計軟件進行方差分析和顯著性檢驗(LSD,P<0.05)。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 核桃仁及核桃脫脂粉的基本成分的分析

    新疆薄皮核桃仁主要成分見表2。結(jié)果顯示,新疆薄皮核桃仁蛋白質(zhì)含量高達17.66%,蛋白質(zhì)含量高于我國其它地區(qū)的核桃,如:云南大姚核桃(16.2%),小油籠核桃(13.6%)等[19]。此外,粗脂肪含量達60.84%,低于我國其它地區(qū)的核桃,如云南大姚核桃(73.88%),山東核桃(68.89%)[20]。與國外的核桃相比,新疆薄皮核桃蛋白質(zhì)含量高于美國核桃(16.66%),而粗脂肪含量低于美國核桃(66.90%)[1],分析新疆薄皮核桃仁蛋白質(zhì)含量較高而粗脂肪含量較低的原因,可能由于新疆特殊的地理環(huán)境和氣候?qū)颂业纳L和發(fā)育產(chǎn)生了一定的影響。

    對新疆薄皮核桃仁進行脫脂處理后得到的核桃脫脂粉的基本成分見表2。結(jié)果顯示,脫脂后的核桃粉粗脂肪降至1.80%,蛋白質(zhì)含量為52.51%,水分含量變化比較大,為9.20%,灰分降至0.54%。核桃脫脂粉的NPN 為3.74%,NSI 為7.64%,相比較脫脂大豆蛋白的NSI (75.3%)[21]要低得多。新疆薄皮核桃脫脂粉較低的NSI 會增加核桃蛋白產(chǎn)品的溶解難度,因此,通過一定的工藝處理制備核桃蛋白產(chǎn)品將有助于核桃蛋白質(zhì)的溶解度的增加。

    表2 核桃仁及核桃脫脂粉的主要成分Table 2 Components of walnut kernel and defatted walnut flour

    2.2 不同溶劑對核桃脫脂粉蛋白溶解度的影響

    圖2 不同溶劑對核桃脫脂粉蛋白溶解度的影響Fig.2 Influence of solubilising agent on defatted walnut flour protein solubility

    用微量凱氏定氮法測定不同溶劑提取核桃脫脂粉中可溶性蛋白質(zhì)的含量,結(jié)果見圖2。6 種不同的溶劑中,0.1 mol/L NaOH 溶液溶解蛋白量最高,溶解蛋白質(zhì)可達45.89 mg/100 mg 脫脂粉;70%乙醇溶液溶解蛋白量最低,溶解蛋白質(zhì)僅為3.23 mg/100 mg 脫脂粉;0.1 mol/L Tris-HCl 溶解蛋白質(zhì)量與1 mol/L NaCl 溶液溶解蛋白量比較相似,分別為10.67 mg/100 mg 脫脂粉和8.98 mg/100 mg脫脂粉。上述研究結(jié)果與Sze-Tao 等[1]的研究結(jié)果比較相似,但溶解蛋白含量均比Sze-Tao 的研究結(jié)果低,可能是微量凱氏定氮法測定[3]結(jié)果比Lowry 法[22]測定結(jié)果偏低的原因。Venkatachalam等人[4]比較了Lowry 法和微量凱氏定氮法測定美國山核桃的蛋白質(zhì)的含量,結(jié)果發(fā)現(xiàn),微量凱氏定氮法測定結(jié)果普遍比Lowry 法測定結(jié)果低。以上結(jié)果表明,核桃蛋白質(zhì)在堿性溶液中蛋白質(zhì)溶出率比較高,而在70%乙醇溶液和去離子水中蛋白質(zhì)溶出率比較低,這說明堿液是核桃蛋白質(zhì)比較好的溶劑。

    2.3 核桃蛋白組成及含量分析

    以核桃脫脂粉為原料,按照核桃蛋白組分分離工藝流程圖(見圖1)的步驟進行分離得到核桃蛋白組成為:谷蛋白、清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白。4種核桃蛋白質(zhì)組分在核桃總蛋白質(zhì)中所占的比例即含量見圖3。結(jié)果顯示,清蛋白、醇溶蛋白、谷蛋白、 球蛋白的含量分別是7.54%,4.73%,72.06%,15.67%。由此可以看出,谷蛋白是構(gòu)成核桃蛋白組成的主要部分,含量超過了70%,這與Sze-Tao 等[1]研究的美國核桃(Juglans Legia L.)結(jié)果基本一致,同時與Venkatachalam 等[4]研究的山核桃(Carya illinoinensis)結(jié)果相似,這主要是因為研究對象都屬于核桃科胡桃屬植物。球蛋白排第二,占核桃蛋白的14.08%,其次清蛋白占7.54%,含量最少的是醇溶蛋白,占4.73%。核桃蛋白質(zhì)的組成與巴旦杏[23]、腰果[24-25]和開心果[26]等堅果的蛋白組成有一定差異,巴旦杏、腰果和開心果等堅果的蛋白組成中含有大量的球蛋白和清蛋白,其中,球蛋白含量占總蛋白的40%以上。此外,核桃蛋白的組成與豆科類蛋白組成明顯不同,豆類蛋白質(zhì)沒有醇溶蛋白,以球蛋白為主,占60%~70%,其次還包括清蛋白(15%~21%)、谷蛋白(10%~15%),其中大豆中球蛋白占60%~90%[27-28],花生含90%球蛋白和10%的清蛋白[29]。谷物中,大米蛋白由75%~79%谷蛋白,13%~15%球蛋白,4.5%~6%清蛋白,小于3%的醇溶蛋白構(gòu)成[30-31],相比之下,核桃蛋白的組成與大米蛋白比較相似。由于谷蛋白是構(gòu)成核桃蛋白的主要組成,核桃蛋白的NSI 較豆科類蛋白低很多。

    圖3 核桃蛋白組分及含量Fig.3 Content of walnut protein fractions

    2.4 核桃蛋白提取條件的研究

    2.4.1 pH 對核桃蛋白質(zhì)提取效果的影響 pH 對核桃蛋白質(zhì)提取效果的影響見圖4。由圖4可以看出,pH 對核桃脫脂粉中蛋白質(zhì)的提取率有顯著的影響(P<0.05)。核桃蛋白質(zhì)在中性和酸性pH 中提取率比較低,尤其在酸性條件下,如pH 3~7 之間,核桃蛋白質(zhì)的提取率最低,低于10%以下,這與Sze-Tao 等人[1]的研究結(jié)果一致。在pH 1~2 之間,蛋白質(zhì)的提取率在15%~18%,在堿性條件下,隨著pH 的升高,蛋白質(zhì)的提取率逐漸提高。pH 8以后,隨著pH 的升高,提取率顯著增加,到pH 11時,提取率達71.12%,隨后提取率增加緩慢,到pH 12 時,提取率達75.23%。上述研究結(jié)果與本論文第二章中核桃蛋白質(zhì)的組分研究結(jié)果剛好吻合,由于谷蛋白是核桃蛋白的主要組成成分,占核桃總蛋白的70%以上,因此,在堿性條件下,由于大部分谷蛋白和少量球蛋白和清蛋白溶出,所以核桃蛋白的提取率較高。Venkatachalam 等人[4]也得到相似的研究結(jié)果。由于pH 11 以后,核桃蛋白質(zhì)的提取率提高不顯著,且核桃蛋白質(zhì)提取液的顏色開始發(fā)生褐變,可能由于核桃蛋白質(zhì)含有單寧。Osborne 和Campbell[32]報道了英國核桃蛋白質(zhì)包含3.5%(w/w)的球蛋白,之后在核桃仁除去單寧后核桃蛋白質(zhì)中的球蛋白的得率提高到20%[33]。這些早期的研究結(jié)果表明,核桃仁中單寧物質(zhì)的存在能極大的影響核桃球蛋白的溶解度。綜合考慮提取率和提取蛋白的色澤,選取pH11為核桃蛋白質(zhì)最佳提取pH。

    2.4.2 提取時間對核桃蛋白質(zhì)提取效果的影響

    提取時間對核桃蛋白質(zhì)提取率的影響見圖5。由圖5可以看出,隨著提取時間的延長,核桃蛋白的提取率逐漸提高。提取時間從0.5 h 增加到1 h,核桃蛋白質(zhì)的提取率顯著提高,從62.23%提高到71.02%,隨后,隨著提取時間的延長,核桃蛋白質(zhì)提取率增加緩慢。在提取初期,核桃蛋白質(zhì)沒有完全溶解,隨著提取時間的延長,核桃蛋白質(zhì)的溶出量不斷增加。當核桃蛋白質(zhì)的溶出量增加到一定程度后,在固定的條件下,由于核桃蛋白質(zhì)大部分已經(jīng)溶解出來,即使再增加提取時間,也只能有很少的蛋白質(zhì)繼續(xù)溶出,因此,隨著提取時間的延長,核桃蛋白質(zhì)的提取率增加緩慢。綜合考慮節(jié)約能源和蛋白質(zhì)提取率等因素,提取時間為1 h 為核桃蛋白的最佳提取時間。

    2.4.3 料液比對核桃蛋白質(zhì)提取效果的影響 料液比對核桃蛋白質(zhì)提取效果的影響見圖6。由圖6可以看出,隨著料液比的不斷增加,核桃蛋白的提取率逐漸增加。Venkatachalam 等人[4]和劉淼[34]也得到了相似的研究結(jié)果。當料液比從1∶5(m/V)增加到1 ∶20 (m/V)時,核桃蛋白質(zhì)的提取率顯著提高,從52.76%提高到71.89%,隨后,隨著料液比的繼續(xù)增加,當料液比從1∶20 (m/V)增加到1∶50(m/V)時,核桃蛋白質(zhì)的提取率增加緩慢,從71.89%增加到78.12%。當料液比較小的時候,蛋白質(zhì)沒有完全溶出,隨著料液比的增加,增加了水分子與蛋白質(zhì)分子的相互接觸,從而促進了蛋白質(zhì)的溶解,因此,蛋白質(zhì)提取率顯著提高。當?shù)鞍踪|(zhì)基本已完全溶出,在現(xiàn)有的條件下,即使繼續(xù)增加料液比,對蛋白質(zhì)的溶解無顯著提高作用。綜合考慮蛋白質(zhì)的提取工藝和提取率,以料液比為1∶20(m/V)為最佳提取蛋白料液比。

    2.4.4 提取溫度對核桃蛋白質(zhì)提取效果的影響提取溫度對核桃蛋白提取效果的影響見圖7。由圖7可以看出,隨著提取溫度的升高,核桃蛋白提取率逐漸提高,當提取溫度達50 ℃時,蛋白質(zhì)提取率為77.98%。當溫度升至55 ℃時,蛋白質(zhì)提取率有少量增加,隨后,蛋白質(zhì)提取率隨溫度的升高不斷下降,當溫度達70 ℃時,蛋白質(zhì)提取率為64.67%。劉淼[34]和姜榮慶[9]也得到了相似的研究結(jié)果。當提取溫度較低時,水分子和蛋白質(zhì)分子不能充分進行相互作用,因而蛋白質(zhì)提取率較低,當提取溫度逐漸升高時,對水分子和蛋白質(zhì)分子的相互作用有一定的促進作用,有利于蛋白質(zhì)溶解度的提高,因而,升高溫度對于核桃蛋白質(zhì)的提取率有一定提高作用。當提取溫度升高到一定值時,這時高溫可能引起部分蛋白質(zhì)發(fā)生變性而發(fā)生聚集,從而使蛋白質(zhì)溶出量減少,此外,高溫可能引起核桃脫脂粉中其他成分如碳水化合物黏度增大而與蛋白質(zhì)發(fā)生粘合[35],從而使核桃蛋白質(zhì)的提取率下降。綜合考慮蛋白質(zhì)提取率和蛋白提取工藝,以50 ℃為核桃蛋白質(zhì)最佳提取溫度。

    圖4 pH 對核桃蛋白質(zhì)提取效果的影響Fig.4 Effect of pH on walnut protein extraction

    圖5 提取時間對核桃蛋白質(zhì)提取效果的影響Fig.5 Effect of extraction time on walnut protein extraction

    圖6 料液比對核桃蛋白質(zhì)提取效果的影響Fig.6 Effect of flour-to-solvent ratio on walnut protein extraction

    圖7 提取溫度對核桃蛋白質(zhì)提取效果的影響Fig.7 Effect of extraction temperature on walnut protein extraction

    2.4.5 響應面分析法優(yōu)化核桃蛋白質(zhì)提取條件綜合單因素試驗結(jié)果,以蛋白質(zhì)的提取率為響應值,作響應面分析試驗(3 因素3 水平)。其中,以液料比(X1)、提取溫度(X2)、提取時間(X3)為自變量。方案與結(jié)果見表3。

    通過對響應值與各因素進行回歸擬合后,得到回歸方程:Y=78.48+4.95X1+0.35X2+1.14X3+0.082X1X2+0.90X1X3+0.52X2X3-4.89X12-0.75X22-0.59X32,通過方差分析及相關(guān)系數(shù)來考察模型的可靠性,見表4。

    表3 方案及結(jié)果Table 3 Program and results of response surface analysis

    表4 方差分析表Table 4 Analysis of variance

    由表4可知,模型P<0.0001,表明回歸模型極顯著,失擬項F=2.78527<(F0.05(9,3)=8.81),P=0.1738>0.05,在P=0.05 水平上影響不顯著,因變量與所有自變量之間的線性關(guān)系顯著(R2=0.9959)。模型的調(diào)整確定系數(shù)RAdj2=0.9906,說明該模型擬合程度良好,試驗誤差小,可用此模型來分析和預測核桃蛋白提取條件。

    由表4可知,三因素中,液料比與提取時間,提取溫度與提取時間有交互作用,液料比X1、提取時間X3達到極顯著程度,核桃蛋白提取率的影響因素主次為液料比>提取時間>提取溫度。

    由圖8的等高線可以看出,在提取溫度為50℃時,液料比和提取時間對蛋白質(zhì)提取率的交互作用顯著。隨著液料比和提取時間的增加,蛋白質(zhì)提取率呈現(xiàn)出先快速增加后趨于穩(wěn)定的趨勢。單因素結(jié)果與優(yōu)化試驗結(jié)果一致,因此,適當?shù)脑黾恿弦罕群吞崛r間,有利于蛋白質(zhì)的溶出,使蛋白質(zhì)提取率提高。

    由圖9的等高線可以看出,液液比為20∶1(v/w)時,提取溫度和提取時間對蛋白質(zhì)提取率的交互作用顯著。隨著提取溫度的升高,蛋白質(zhì)提取率呈現(xiàn)先增加后稍有減少的趨勢,隨著提取時間的延長,蛋白質(zhì)提取率呈現(xiàn)先增加后趨于穩(wěn)定的趨勢。優(yōu)化試驗結(jié)果與單因素結(jié)果基本一致,由此可見,適當延長提取時間,升高提取溫度有利于蛋白質(zhì)的溶出,從而提高了蛋白質(zhì)的提取率。

    圖8 Y=f(X1,X3,50 ℃)的響應面和等高線圖Fig.8 Responsive surfaces of Y=f(X1,X3,50 ℃)

    圖9 Y=f(X2,X3,20∶1 v/w)的響應面和等高線圖Fig.9 Responsive surfaces of Y=f (X2,X3,20∶1 v/w)

    2.5 核桃蛋白提取條件的確定

    通過響應面分析并優(yōu)化,得到了提取pH 11,液料比26.03 ∶1、提取溫度53.07 ℃、提取時間1.5 h,為最優(yōu)核桃蛋白提取條件,預測蛋白質(zhì)提取率為81.05%。

    2.6 驗證優(yōu)化蛋白質(zhì)提取條件

    采用數(shù)學模型優(yōu)化蛋白質(zhì)提取條件,從而驗證響應面分析法優(yōu)化結(jié)果,且取整數(shù)即:pH 11,液料比26 ∶1(v/w),提取時間1.5 h,提取溫度53 ℃,進行6 次重復驗證試驗,測得蛋白質(zhì)提取率為82.68%±0.29%。因此,采用響應面分析法優(yōu)化得到的核桃蛋白提取條件準確可靠。

    2.7 核桃堿溶蛋白酸沉點的確定

    由pH 對核桃蛋白提取率的影響結(jié)果可以看出,核桃蛋白在堿性條件下的提取率比在酸性條件下高,且在堿性條件下,隨著pH 的升高,蛋白質(zhì)提取率迅速增加。在確定為pH 11 的條件下,結(jié)合響應面優(yōu)化核桃蛋白提取條件,即料液比26∶1(v/w),提取溫度53 ℃,提取時間1.5 h,得到的蛋白提取液為堿溶蛋白,其經(jīng)過離心,酸沉可以將其分離從而得到核桃分離蛋白。圖10為核桃堿溶蛋白在不同的pH 條件下酸沉、 離心后上清液的可溶性蛋白含量(mg/100 mg 脫脂粉)。由圖10可以看出,在pH 4~5 之間,核桃堿溶蛋白的酸沉量是比較大的。在pH 4.5 條件下酸沉后上清液可溶性蛋白含量最低,說明大部分核桃堿溶蛋白在pH 4.5 可以酸沉下來。這一結(jié)果與Sze-Tao K W C等人[1]和姜莉[8]、崔莉[7]的研究結(jié)果略有些差異。Sze-Tao K W C 等人用0.1 mol/L NaOH(pH 12)溶解核桃脫脂粉,得到的核桃蛋白提取液在不同pH 條件下的蛋白質(zhì)溶解度結(jié)果表明,pH 4 時蛋白質(zhì)溶解度最低。姜莉和崔莉都采用pH 8.5 的條件下提取核桃蛋白,并測定了蛋白液的等電點分別為pH 4.5 和pH 5。結(jié)果產(chǎn)生差異的原因可能是提取蛋白質(zhì)溶液pH 不同以及酸沉點pH 的劃分不同,但結(jié)果表明,核桃堿溶蛋白的等電點基本為pH 4~5。

    圖10 不同pH 對上清液的可溶性蛋白的影響Fig.10 Effect of pH on soluble protein of supperents

    2.8 核桃分離蛋白的制備工藝

    參照Wolf[36]制備大豆分離蛋白的方法,根據(jù)響應面優(yōu)化核桃蛋白提取條件以及核桃堿溶蛋白酸沉點的結(jié)果,本試驗采用核桃脫脂粉為原料,按照以下工藝制備核桃分離蛋白,得到的核桃分離蛋白,純度為90.5%,得率為43.15%。此法制備的核桃蛋白純度比姜榮慶[9]和姜莉[8]分別采用堿提法提取制備出的核桃蛋白質(zhì)純度 (分別為82.46%、83%)高。由此結(jié)果可以看出,按照以下堿溶酸沉工藝制備的核桃分離蛋白基本達到分離蛋白純度的要求。

    核桃脫脂粉→95%醇洗(1∶10,w/v)→過濾得濾餅→揮干溶劑→蛋白質(zhì)溶液 (1∶26(w/v))→調(diào)蛋白液pH 11 →攪拌1.5 h (53 ℃)→離心(7 000 g,15 min,25 ℃)→上清液 →調(diào)pH 為4.5 →攪拌1 h →離心 (7 000 g,15 min,25 ℃)→沉淀→水洗至中性→凍干。

    3 結(jié)論

    通過對核桃及核桃蛋白的組成分析研究,發(fā)現(xiàn)核桃蛋白4 種組成蛋白谷蛋白、 清蛋白、 球蛋白、醇溶蛋白中,谷蛋白含量最高,達72.06%。正是基于核桃蛋白的組成,采用堿性條件溶解核桃蛋白,通過響應面優(yōu)化核桃蛋白分離提取工藝,得到核桃分離蛋白純度為90.5%,得率為43.15%。說明堿溶酸沉的方法是核桃蛋白比較有效的分離提取方法。

    但是,由于谷蛋白是構(gòu)成核桃蛋白的主要組成,核桃蛋白的NSI 較豆科類蛋白低很多。這也為核桃蛋白產(chǎn)品的開發(fā)和應用提高了難度。這就需要采用一定安全的方法對核桃蛋白進行適度處理改性,以提高其NSI,有助于提高產(chǎn)品品質(zhì),例如適度酶解可以提高其NSI。關(guān)于核桃蛋白的適度酶解提高其溶解度有待于進一步研究。

    猜你喜歡
    脂粉谷蛋白核桃
    “素面朝天”朝的是天空嗎?
    科教新報(2024年26期)2024-07-05 10:57:37
    微波輔助Osborne法提取米糠谷蛋白及對其性質(zhì)的影響
    中國油脂(2022年1期)2022-02-12 09:42:50
    小核桃變身“致富果”
    稻米陳化中谷蛋白變化光譜解析及其對功能性質(zhì)的影響
    γ-聚谷氨酸對凍藏谷蛋白水合及結(jié)構(gòu)的影響
    櫻花
    可賞可食可入藥的核桃
    CHIC的化妝包
    唯美主義者
    ——埃西浦太太——奧爾德斯·赫胥黎的《脂粉》主人公性格分析
    轉(zhuǎn)高賴氨酸融合蛋白基因水稻谷蛋白急性毒性
    食品科學(2013年17期)2013-03-11 18:27:09
    国内揄拍国产精品人妻在线| 人人妻人人看人人澡| 美女黄网站色视频| 国产不卡一卡二| 国产真实伦视频高清在线观看| 网址你懂的国产日韩在线| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 免费观看精品视频网站| 亚洲精品一区蜜桃| 亚洲不卡免费看| 免费在线观看成人毛片| 99热6这里只有精品| 1024手机看黄色片| 亚洲国产精品成人久久小说| 在线免费十八禁| 久久久久久国产a免费观看| 久久精品91蜜桃| 国产精品电影一区二区三区| 大香蕉97超碰在线| 男女边吃奶边做爰视频| 国产精品福利在线免费观看| 国产亚洲精品av在线| 啦啦啦啦在线视频资源| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 国产精品一及| 三级经典国产精品| 97超碰精品成人国产| 成人综合一区亚洲| 免费黄网站久久成人精品| 好男人在线观看高清免费视频| or卡值多少钱| 热99在线观看视频| 中文天堂在线官网| 岛国毛片在线播放| 午夜免费男女啪啪视频观看| 久久久久久久国产电影| 国产精华一区二区三区| 嫩草影院入口| 一边亲一边摸免费视频| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 美女被艹到高潮喷水动态| 99热全是精品| 欧美色视频一区免费| 国产精品熟女久久久久浪| 国产人妻一区二区三区在| 热99re8久久精品国产| 国产精品国产三级国产专区5o | 国产精品久久久久久久久免| 一级av片app| 成人鲁丝片一二三区免费| 老司机福利观看| 精品久久久久久久久久久久久| a级毛片免费高清观看在线播放| 国产成人91sexporn| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片 精品乱码久久久久久99久播 | 狠狠狠狠99中文字幕| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | 久久久久久久久久久丰满| 免费观看性生交大片5| 国产精品久久久久久av不卡| 两个人视频免费观看高清| 精品熟女少妇av免费看| 伦精品一区二区三区| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 我要搜黄色片| 一个人观看的视频www高清免费观看| 好男人视频免费观看在线| 一级毛片我不卡| 中文乱码字字幕精品一区二区三区 | 久久韩国三级中文字幕| АⅤ资源中文在线天堂| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 午夜亚洲福利在线播放| 99久久无色码亚洲精品果冻| 国产一区二区在线观看日韩| 日本黄色片子视频| 婷婷色av中文字幕| 亚洲美女搞黄在线观看| 免费搜索国产男女视频| 午夜免费男女啪啪视频观看| 十八禁国产超污无遮挡网站| 中文字幕亚洲精品专区| 亚洲国产精品成人久久小说| 91精品伊人久久大香线蕉| 男女国产视频网站| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 亚洲av福利一区| or卡值多少钱| 午夜亚洲福利在线播放| 久久午夜福利片| 搡老妇女老女人老熟妇| 亚洲av熟女| 综合色丁香网| 国产黄色小视频在线观看| 综合色丁香网| 男人和女人高潮做爰伦理| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 国产乱人偷精品视频| 国产探花在线观看一区二区| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 国产精品野战在线观看| 久久久久久久久久久丰满| 亚洲三级黄色毛片| 亚洲国产精品久久男人天堂| 欧美成人精品欧美一级黄| 国产色婷婷99| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 久久鲁丝午夜福利片| 欧美日韩综合久久久久久| 日本黄色视频三级网站网址| 蜜臀久久99精品久久宅男| 日韩精品有码人妻一区| 五月玫瑰六月丁香| 免费大片18禁| 国产精品久久久久久av不卡| 丰满少妇做爰视频| 国产老妇伦熟女老妇高清| 波多野结衣高清无吗| 中文天堂在线官网| 精品久久久久久久久亚洲| 在线免费观看的www视频| 久久久精品94久久精品| 免费搜索国产男女视频| 国产精品一区www在线观看| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 又黄又爽又刺激的免费视频.| av专区在线播放| 丝袜喷水一区| 欧美极品一区二区三区四区| 国产久久久一区二区三区| 内地一区二区视频在线| 99热这里只有精品一区| 欧美成人精品欧美一级黄| 国产精品永久免费网站| av在线老鸭窝| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 又爽又黄无遮挡网站| 久久久国产成人精品二区| 国产精品一区www在线观看| 日韩 亚洲 欧美在线| 国产老妇伦熟女老妇高清| 一级爰片在线观看| 国产在线一区二区三区精 | 夜夜爽夜夜爽视频| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 看十八女毛片水多多多| 又粗又爽又猛毛片免费看| 久久99热这里只有精品18| 国产成人福利小说| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 能在线免费观看的黄片| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 免费一级毛片在线播放高清视频| 久久久久国产网址| 中文天堂在线官网| 久久久成人免费电影| 最近视频中文字幕2019在线8| 亚洲国产精品成人综合色| 久久久久网色| 99九九线精品视频在线观看视频| 舔av片在线| 丰满乱子伦码专区| 日本av手机在线免费观看| 免费大片18禁| 久久韩国三级中文字幕| 午夜免费激情av| 欧美成人a在线观看| 青青草视频在线视频观看| 久久这里只有精品中国| 3wmmmm亚洲av在线观看| 婷婷色综合大香蕉| www.色视频.com| 身体一侧抽搐| 日韩av不卡免费在线播放| 九九爱精品视频在线观看| 国产一区有黄有色的免费视频 | 最新中文字幕久久久久| 亚洲欧美日韩无卡精品| 亚洲美女视频黄频| 日韩强制内射视频| 一区二区三区免费毛片| 免费看av在线观看网站| 国产在视频线在精品| 久久人妻av系列| 亚洲,欧美,日韩| 国产老妇女一区| 国产极品天堂在线| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 一级毛片我不卡| 成人鲁丝片一二三区免费| 级片在线观看| 国产伦理片在线播放av一区| 亚洲av中文av极速乱| 爱豆传媒免费全集在线观看| 校园人妻丝袜中文字幕| 国产成人a∨麻豆精品| 久久精品夜色国产| 超碰97精品在线观看| 日韩视频在线欧美| 国产成人freesex在线| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 最近最新中文字幕免费大全7| 国产高清有码在线观看视频| 少妇人妻精品综合一区二区| 亚洲在线观看片| .国产精品久久| 中文欧美无线码| 欧美性猛交黑人性爽| 日韩高清综合在线| 18禁动态无遮挡网站| 欧美变态另类bdsm刘玥| 身体一侧抽搐| 亚洲av.av天堂| 毛片一级片免费看久久久久| 国产单亲对白刺激| 亚洲在线观看片| 国产精品国产高清国产av| 波野结衣二区三区在线| 一区二区三区高清视频在线| 亚洲精品,欧美精品| 搡女人真爽免费视频火全软件| 国产私拍福利视频在线观看| 丰满乱子伦码专区| 日韩av在线大香蕉| 男插女下体视频免费在线播放| 国产淫片久久久久久久久| 日韩一区二区三区影片| 免费黄网站久久成人精品| 丝袜喷水一区| 97超碰精品成人国产| 在线天堂最新版资源| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 亚洲真实伦在线观看| 日韩精品有码人妻一区| 国产精品爽爽va在线观看网站| 国产亚洲精品久久久com| 婷婷色av中文字幕| 亚洲人成网站在线观看播放| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 一个人看视频在线观看www免费| 岛国毛片在线播放| 国产一级毛片七仙女欲春2| 神马国产精品三级电影在线观看| 婷婷六月久久综合丁香| 欧美性感艳星| 国产人妻一区二区三区在| 一级爰片在线观看| 国产熟女欧美一区二区| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 久久精品影院6| 中国国产av一级| 欧美色视频一区免费| 国产精品熟女久久久久浪| 国产免费又黄又爽又色| 最近中文字幕2019免费版| 久久久久久久久久黄片| 亚洲高清免费不卡视频| 欧美高清性xxxxhd video| 久久精品国产亚洲av涩爱| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 一级毛片电影观看 | 欧美zozozo另类| 欧美3d第一页| 高清视频免费观看一区二区 | 看十八女毛片水多多多| 91aial.com中文字幕在线观看| 九九热线精品视视频播放| 国产精品一区www在线观看| 国产一区有黄有色的免费视频 | 亚洲国产精品国产精品| 日韩在线高清观看一区二区三区| 永久网站在线| 国产伦精品一区二区三区视频9| 校园人妻丝袜中文字幕| 成人亚洲精品av一区二区| 欧美日韩国产亚洲二区| 少妇人妻一区二区三区视频| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 热99re8久久精品国产| 观看免费一级毛片| 搞女人的毛片| 91久久精品电影网| 国产免费一级a男人的天堂| 亚洲欧美日韩无卡精品| 男女边吃奶边做爰视频| 久久6这里有精品| 国产在视频线在精品| 国产精品乱码一区二三区的特点| 国产精品综合久久久久久久免费| 草草在线视频免费看| 嫩草影院新地址| 人妻系列 视频| 联通29元200g的流量卡| 一个人看视频在线观看www免费| 国产真实伦视频高清在线观看| 久久久久久久午夜电影| 久久久久久久午夜电影| 男人和女人高潮做爰伦理| 99热6这里只有精品| 亚洲国产精品成人久久小说| 欧美另类亚洲清纯唯美| 一级毛片aaaaaa免费看小| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 国产精品一及| 美女cb高潮喷水在线观看| 免费黄网站久久成人精品| 日本熟妇午夜| 亚洲欧美精品专区久久| 国产视频首页在线观看| 国产人妻一区二区三区在| 看片在线看免费视频| 中文天堂在线官网| 亚洲内射少妇av| 欧美3d第一页| 国产伦理片在线播放av一区| 深夜a级毛片| 激情 狠狠 欧美| 亚洲人与动物交配视频| 不卡视频在线观看欧美| 午夜a级毛片| 天天躁日日操中文字幕| 亚洲不卡免费看| 色网站视频免费| 亚洲av.av天堂| 日日摸夜夜添夜夜爱| 欧美丝袜亚洲另类| 国产成人精品一,二区| 成人毛片a级毛片在线播放| 乱人视频在线观看| 成人鲁丝片一二三区免费| 老司机影院毛片| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 在线免费观看不下载黄p国产| av专区在线播放| 日韩一本色道免费dvd| 日韩强制内射视频| 亚洲精品国产av成人精品| 久久久久久久国产电影| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 黄片无遮挡物在线观看| 久久精品久久精品一区二区三区| 老司机福利观看| 亚洲经典国产精华液单| 成人国产麻豆网| 最后的刺客免费高清国语| 三级毛片av免费| 欧美+日韩+精品| 久久久成人免费电影| 人妻系列 视频| 插逼视频在线观看| 免费观看a级毛片全部| 在线免费十八禁| 老司机影院毛片| 舔av片在线| av黄色大香蕉| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 日韩高清综合在线| 欧美+日韩+精品| 九色成人免费人妻av| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 成人亚洲精品av一区二区| 色综合色国产| 91久久精品国产一区二区三区| 午夜福利成人在线免费观看| 纵有疾风起免费观看全集完整版 | 久久热精品热| 天天躁日日操中文字幕| 在线播放无遮挡| 97超视频在线观看视频| 国产精品久久久久久久久免| 精品一区二区三区人妻视频| 变态另类丝袜制服| 九九爱精品视频在线观看| 午夜日本视频在线| 国产精品久久久久久久电影| 成年女人永久免费观看视频| 内地一区二区视频在线| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 国产精品不卡视频一区二区| www.色视频.com| 欧美丝袜亚洲另类| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 男女国产视频网站| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 国产亚洲精品久久久com| 久久久久国产网址| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 亚洲图色成人| 日本五十路高清| 午夜精品在线福利| 黄色配什么色好看| 听说在线观看完整版免费高清| 国产高清三级在线| 欧美日韩精品成人综合77777| 成人性生交大片免费视频hd| 网址你懂的国产日韩在线| 中国国产av一级| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 国产精品无大码| 国产精品一二三区在线看| av在线观看视频网站免费| 欧美3d第一页| 国内揄拍国产精品人妻在线| 乱码一卡2卡4卡精品| 亚州av有码| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 美女被艹到高潮喷水动态| 国产成人福利小说| 国产精品不卡视频一区二区| 日日干狠狠操夜夜爽| 精品酒店卫生间| 久久午夜福利片| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 欧美色视频一区免费| 国产乱人视频| 成年免费大片在线观看| 91aial.com中文字幕在线观看| 91精品国产九色| 精品国产三级普通话版| 国产一区有黄有色的免费视频 | 国产黄a三级三级三级人| 国产欧美日韩精品一区二区| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 亚洲无线观看免费| 国国产精品蜜臀av免费| 在线播放国产精品三级| 男女啪啪激烈高潮av片| 最后的刺客免费高清国语| 国产淫语在线视频| 搡女人真爽免费视频火全软件| 简卡轻食公司| 精品熟女少妇av免费看| 最近视频中文字幕2019在线8| videos熟女内射| 热99在线观看视频| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 久久精品人妻少妇| 国产精品久久视频播放| 欧美激情国产日韩精品一区| 少妇的逼好多水| 别揉我奶头 嗯啊视频| 亚洲欧美日韩无卡精品| 精品无人区乱码1区二区| 欧美+日韩+精品| 午夜视频国产福利| 国产av在哪里看| 激情 狠狠 欧美| 午夜精品一区二区三区免费看| 欧美bdsm另类| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 大话2 男鬼变身卡| 亚洲国产最新在线播放| 国产精华一区二区三区| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 国产黄a三级三级三级人| 黄色欧美视频在线观看| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 国产精品一及| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 男人的好看免费观看在线视频| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 日日干狠狠操夜夜爽| 少妇的逼水好多| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 女人被狂操c到高潮| 日韩人妻高清精品专区| 久久久久九九精品影院| 看免费成人av毛片| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 日本一本二区三区精品| eeuss影院久久| 秋霞在线观看毛片| 国产免费福利视频在线观看| 日日摸夜夜添夜夜爱| 久久精品国产亚洲av涩爱| 97在线视频观看| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品 | 日本熟妇午夜| 中文字幕熟女人妻在线| 高清在线视频一区二区三区 | 18禁在线播放成人免费| 成人综合一区亚洲| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 日本免费a在线| 波多野结衣巨乳人妻| 日韩三级伦理在线观看| 免费黄网站久久成人精品| 久久精品91蜜桃| 国产精品三级大全| 乱码一卡2卡4卡精品| 国产精品综合久久久久久久免费| 成年女人永久免费观看视频| 亚洲在线自拍视频| 我的女老师完整版在线观看| 99热这里只有精品一区| 少妇被粗大猛烈的视频| 久久草成人影院| 国产真实伦视频高清在线观看| 少妇熟女欧美另类| 久久久久久九九精品二区国产| 久久久色成人| 熟女电影av网| 午夜老司机福利剧场| 看十八女毛片水多多多| 嫩草影院精品99| 欧美潮喷喷水| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 久久亚洲精品不卡| 国产精品久久久久久久久免| 亚洲中文字幕日韩| 两个人视频免费观看高清| 97超碰精品成人国产| 精品一区二区三区人妻视频| 长腿黑丝高跟| 亚洲图色成人| 黄片无遮挡物在线观看| 简卡轻食公司| 国语自产精品视频在线第100页| 激情 狠狠 欧美| 日韩欧美国产在线观看| www日本黄色视频网| 欧美成人免费av一区二区三区| 久久99精品国语久久久| 能在线免费观看的黄片| 大话2 男鬼变身卡| 免费观看的影片在线观看| 国产高清不卡午夜福利| 国产成人a∨麻豆精品| 免费看光身美女| 免费观看人在逋| 人人妻人人看人人澡| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 欧美97在线视频| 亚洲av免费在线观看| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 免费播放大片免费观看视频在线观看 | 中文亚洲av片在线观看爽| 亚洲高清免费不卡视频| 精品酒店卫生间| 69av精品久久久久久| 岛国毛片在线播放| 91在线精品国自产拍蜜月| 国产精品野战在线观看| 国产av不卡久久| 中文字幕久久专区| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 亚洲av成人精品一区久久| 亚洲av男天堂| 国产av一区在线观看免费| 久久久久久伊人网av| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 国产精品人妻久久久影院| 国产一区有黄有色的免费视频 | 日韩,欧美,国产一区二区三区 | 尾随美女入室| 18禁在线播放成人免费| 美女被艹到高潮喷水动态| 国产黄a三级三级三级人| 国产大屁股一区二区在线视频| 久久这里只有精品中国| 成人亚洲精品av一区二区| 欧美bdsm另类| 欧美成人午夜免费资源| 国产伦精品一区二区三区视频9| 国产精品永久免费网站| 99久久精品热视频| 国产av一区在线观看免费| 久久久久精品久久久久真实原创| 秋霞在线观看毛片| 男女啪啪激烈高潮av片| 99在线视频只有这里精品首页| 国产极品精品免费视频能看的| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 夫妻性生交免费视频一级片| 日本免费a在线| 搞女人的毛片| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 欧美激情久久久久久爽电影| 91精品伊人久久大香线蕉| 欧美不卡视频在线免费观看| 亚洲国产精品成人综合色| 欧美不卡视频在线免费观看| 91精品伊人久久大香线蕉| 成年版毛片免费区| 美女内射精品一级片tv| 成人亚洲欧美一区二区av| 插阴视频在线观看视频| 中文亚洲av片在线观看爽| 国产精华一区二区三区| 大话2 男鬼变身卡| 久99久视频精品免费| 久久精品人妻少妇| 国产视频内射| 免费观看a级毛片全部| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 久久精品国产自在天天线| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 亚洲综合色惰| 亚洲在线自拍视频| 国产成人福利小说| 日韩欧美在线乱码| 日韩成人av中文字幕在线观看| 久久鲁丝午夜福利片| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 精品国产一区二区三区久久久樱花 | 午夜视频国产福利| 国产精品一区二区三区四区久久| 亚洲在线自拍视频| 变态另类丝袜制服| 在线播放无遮挡|