基于腦脊液常規(guī)的細胞學(xué)檢查在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病診斷中的應(yīng)用進展

高 悅 張彩霞 李桐桐 王 濤

1 濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗科 山東 濱州 256603；2 濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院藥學(xué)部 山東 濱州 256603

中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病是指因腦部和脊髓部位由于受到感染、先天遺傳、外傷及新陳代謝障礙等多方面影響和因素所引起的一類疾病[1]。腦脊液常規(guī)檢測(后稱常規(guī))是中樞神系統(tǒng)疾病診斷、鑒別診斷及療效觀察的重要手段之一[1]，其中，細胞分類正是常規(guī)的核心檢查之一。然而，在臨床工作中，大多數(shù)醫(yī)院依然采用較為原始的顯微鏡分類法—經(jīng)冰醋酸酸化后在高倍鏡下對有核細胞進行單個核和多個核細胞進行分類計數(shù)(共計100個有核細胞)[1]。隨著抗生素及各種診療措施的廣泛應(yīng)用，越來越多疾病的臨床表現(xiàn)(包括癥狀及體征)變得復(fù)雜，缺乏典型特征，給臨床診療工作帶來很大的困難，常規(guī)已很難滿足臨床的診療需要[2]。如今，部分醫(yī)院對腦脊液標本除進行常規(guī)細胞計數(shù)外，還附加一種新的腦脊液檢查項目——腦脊液細胞學(xué)檢查，即通過對收集的腦脊液細胞進行邁-格-姬 (MGG)染色，并在顯微鏡下對細胞及有形成分進行形態(tài)學(xué)分析，就如同對蛛網(wǎng)膜下腔的組織活檢，反映蛛網(wǎng)膜下腔和腦膜的病變情況，從而對疾病作出診斷及療效評估[2-3]。隨著各種藥物及治療手段的介入，許多疾病的臨床表現(xiàn)變得復(fù)雜多樣 ，特別是常規(guī)白細胞計數(shù)正常的病例，給臨床醫(yī)生的診斷和鑒別診斷造成了很大困惑，而細胞學(xué)在這方面具有不可替代的作用[4]。本文將主要介紹細胞學(xué)在幾種主要的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的特征表現(xiàn)，以證其重要的臨床意義。

1 腦脊液細胞學(xué)檢查的概述

腦脊液的細胞學(xué)檢查是將腦脊液細胞經(jīng)過收集和染色后對細胞形態(tài)學(xué)的觀察和研究，能反映機體因各種病因引起病理變化時的細胞學(xué)表現(xiàn),可用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的診斷、病情監(jiān)測、療效評價和預(yù)后判斷。由于許多中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的病理生理學(xué)改變只發(fā)生在腦脊液中，故腦脊液細胞學(xué)檢查就顯得尤為重要。

1.1 細胞收集 腦脊液細胞學(xué)檢查已經(jīng)開展了百余年，但因為腦脊液中細胞數(shù)量較少，加之細胞收集裝置的限制，使得長久以來檢驗人員只能使用較為原始的血細胞計數(shù)版進行不精確的檢查。直至 1954 年Saky發(fā)明了腦脊液細胞玻片離心沉淀器, 將細胞直接收集在玻片上進行固定和染色檢查的新方法后, 腦脊液細胞學(xué)檢查才得到了快速發(fā)展, 并獲得了較理想的臨床效果[5]。1962年，在南京醫(yī)學(xué)院侯熙德教授首先引進的新型玻片離心沉淀法腦脊液細胞學(xué)方法后[6]，隨著國內(nèi)學(xué)者的不斷努力，粟氏FMMU-5微型(1981年)和孔氏FCS兩用型(1993年)細胞玻片離心沉淀器相繼研制成功[7]?，F(xiàn)如今，大多是使用腦脊液玻片離心沉淀儀進行細胞收集工作。該項檢查技術(shù)對中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病的診斷具有較好的臨床應(yīng)用價值，檢查方法簡便、易行，而且也非其他檢查方法所能完全替代的。

1.2 細胞染色 臨床上常用MGG染色法對腦脊液細胞進行染色。MGG由May-Grunwald染料和Giemsa染料組成。前者化學(xué)名為曙紅亞甲基藍Ⅱ，對胞質(zhì)著色較好；后者對胞核著色較好。因此MGG染色方法簡單，且兼有瑞氏、姬氏兩種染色的優(yōu)點，并且涂片可保存十多年而不退色。MGG染色對胞質(zhì)胞核染色效果均較好，結(jié)構(gòu)清晰，所染細胞亦比HE染色的細胞大；同時對細菌、霉菌及膽固醇結(jié)晶的顯示也很清楚。因此適用于淋巴造血系統(tǒng)的細胞標本、胸腹水、穿刺標本等。尤其對鑒別惡性淋巴瘤的類型，MGG染色更有幫助。

此外,一些特殊的染色方法也有一定的補充和拓展作用，如吖啶橙熒光染色法和DNA染色法對癌細胞的辨認及其活力狀態(tài)的判斷、酸性非特異性酯酶活性(ANAE)染色法對腦脊液T細胞的辨認及腦脊液免疫功能的快速檢測、高碘酸雪夫(PAS)染色法對癌細胞和淋巴母細胞的鑒別、過氧化酶染色法對形態(tài)相似的幼稚白細胞的鑒別、脂類染色法對脂類吞噬細胞的鑒別、硝基四氮唑藍染色法對成熟和幼稚的中性粒細胞的鑒定等。隨著技術(shù)的發(fā)展，包括免疫組化染色在內(nèi)的一些新型染色方法不斷出現(xiàn)。有學(xué)者[8]稱，免疫組化染色是腦脊液細胞學(xué)常規(guī)染色的補充，能有效彌補常規(guī)染色對腫瘤細胞鑒定困難的不足，特別對于腦膜癌病的診斷具有重要意義。

2 在疾病診斷中的應(yīng)用

腦脊液細胞學(xué)檢查是多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的診斷、鑒別診斷、療效評價及預(yù)后判斷所必需的方法之一，包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染、中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤、中樞神經(jīng)系統(tǒng)白血病和腦血管病等。

2.1 中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染 中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染是各種病原微生物侵犯腦或脊髓實質(zhì)、被膜和血管等引起的急、慢性炎癥性疾病，也是神經(jīng)系統(tǒng)的常見病。根據(jù)病原微生物的不同，該病主要分為細菌性感染、病毒性感染、結(jié)核性感染、霉菌性感染和寄生蟲性感染五類。中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染是神經(jīng)系統(tǒng)的常見疾病，也是嚴重威脅人類健康的感染性疾病。腦脊液是由腦室脈絡(luò)叢產(chǎn)生，正常腦脊液中單核細胞與淋巴細胞比例約為7∶3，當(dāng)中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生感染時，其內(nèi)細胞種類和比例會發(fā)生相應(yīng)變化。而腦脊液細胞學(xué)則是一門對正常和病理狀態(tài)下腦脊液細胞成分進行分析的科學(xué)，尤其是精確的細胞分類和動態(tài)腦脊液細胞學(xué)的觀察，對了解中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的病理過程和協(xié)助診斷中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病起了很大的作用，還可通過CSFC演變過程的分析來評估治療的效果。

2.1.1 化膿性腦膜炎 化膿性腦膜炎(細菌性腦膜炎)一般為急性或亞急性起病，以發(fā)燒頭痛惡心嘔吐等腦膜刺激征為臨床表現(xiàn)。一般分為三個時期：急性期該期細胞總數(shù)大量增加，常達103～104/mm3。以中性粒細胞為主，可占白細胞總數(shù)的90%及以上，還伴有少量大淋巴樣細胞、大單核細胞以及漿細胞等。早期細胞較為幼稚，以桿狀核細胞為主，但時間較短，很快演變?yōu)榉秩~核粒細胞，并且該粒細胞吞噬能力較強，可在其胞漿內(nèi)發(fā)現(xiàn)病原菌并在其作用下逐漸轉(zhuǎn)化成膿細胞；亞急性期經(jīng)過有效抗生素等藥物治療，細胞總數(shù)和中性粒細胞數(shù)會逐漸下降，淋巴、單核樣細胞明顯增多，大淋巴細胞、激活單核細胞及漿細胞出現(xiàn)；恢復(fù)期經(jīng)過不斷治療，細胞總數(shù)接近正常，嗜中性粒細胞消失，以各種淋巴細胞(大淋巴細胞、小淋巴細胞和激活淋巴細胞)為主，激活單核細胞較前減少，漿細胞消失。若病情進一步好轉(zhuǎn)，則細胞總數(shù)及細胞比例恢復(fù)正常。

在與結(jié)核性腦膜炎的鑒別方面，結(jié)核性腦膜炎的基本細胞學(xué)表現(xiàn)是以中性粒細胞和淋巴細胞為主的混合細胞反應(yīng)。而由于抗生素的廣泛使用，許多患者就診時就進入亞急性期，故兩種疾病容易混淆[9]。有研究[10]稱化膿性腦膜炎的演變明顯快于結(jié)核性腦膜炎。所以對于初次腦脊液檢查結(jié)果為混合細胞反應(yīng)而臨床懷疑化膿性腦膜炎，應(yīng)注重其腦脊液細胞學(xué)動態(tài)檢查，根據(jù)演變的速度加以鑒別—若演變速度快，則提示化膿性腦膜炎，反之則需要排除其他類型腦膜炎的可能。

2.1.2 病毒性腦膜炎 病毒性腦膜炎常由多種病毒引起，其中以由腸道 Ev71病毒和單純皰疹病毒為主，起病急，好發(fā)于兒童。

病毒性腦膜炎患者的細胞總數(shù)常達50～500/mm3，腦脊液中會出現(xiàn)來自外周通過血腦屏障進行免疫應(yīng)答的免疫活性細胞，根據(jù)細胞種類變化大致分為以下幾個時期：①超早期(發(fā)病3 d內(nèi))可見中性粒細胞一過性增加，常達50%以上，呈混合細胞型反應(yīng)；②急性期(發(fā)病3 d后)出現(xiàn)大量淋巴細胞(可占白細胞總數(shù)的80%～90%)和少量單核細胞，可見轉(zhuǎn)化型淋巴細胞、淋巴樣細胞和漿細胞，粒細胞明顯減少；③亞急性期(發(fā)病1周后)與急性期相似，中性粒細胞明顯減少甚至消失；④恢復(fù)期(發(fā)病2～3周)表現(xiàn)為混合細胞型反應(yīng)，以淋巴細胞為主。若異常細胞消退，正常細胞出現(xiàn)并接近正常水平時提示病情康復(fù)。

在鑒別診斷方面，病毒性腦膜炎應(yīng)與結(jié)核性腦膜炎做好鑒別。結(jié)核性腦膜炎常被誤診為病毒性腦膜炎，誤診率達30%左右，且一旦誤診應(yīng)用激素后會引起結(jié)核桿菌全身播散，后果極為嚴重[11]。病毒性腦膜炎的細胞學(xué)表現(xiàn)一般呈淋巴細胞反應(yīng)，而結(jié)核性腦膜炎則是以中性粒細胞反應(yīng)或以中性粒細胞為主的混合細胞反應(yīng)。值得注意的是，病毒性腦膜炎超早期(3 d內(nèi))會出現(xiàn)一過性的中性粒細胞增加[12]。所以要做到兩者的有效鑒別，要注意患者起病3 d后的腦脊液細胞學(xué)表現(xiàn)，再結(jié)合臨床癥狀、腦脊液生化、影像學(xué)進行進一步的評估，最大限度地提高早期確診率。

2.1.3 結(jié)核性腦膜炎 結(jié)核性腦膜炎是最嚴重的肺外結(jié)核病，其病死率和致殘率居高不下[13]。有文獻[14]報道,早期確診并快速啟動治療是改善結(jié)核性腦膜炎預(yù)后的關(guān)鍵。但由于一方面抗酸染色等病原學(xué)檢查陽性率低[15]，另一方面其臨床表現(xiàn)和腦脊液生化檢查越來越不典型的特點[16]，共同導(dǎo)致了結(jié)核性腦膜炎的誤診率增加，早期診斷困難。

結(jié)核性腦膜炎細胞總數(shù)常達(100～1000)× 106/L。起病早期，可出現(xiàn)中性粒細胞比例升高。結(jié)核性腦膜炎常呈現(xiàn)多種細胞并存的混合細胞反應(yīng)，并且短時間內(nèi)保持穩(wěn)定，通常以淋巴細胞為主的混合細胞反應(yīng)最為常見，這是結(jié)核性腦膜炎在細胞學(xué)上最顯著的特征。此時，腦脊液細胞學(xué)并不典型，混合細胞反應(yīng)可以淋巴細胞為主，也可以單核細胞為主，細胞總數(shù)也不高，難以與病毒性腦膜炎鑒別，易造成誤診，而一旦誤診應(yīng)用激素后會引起結(jié)核桿菌全身播散，后果極為嚴重[17]。隨著病情進展，其中性粒細胞比例逐漸下降，而淋巴細胞核單個細胞的比例則增高。腦脊液細胞學(xué)檢查也是結(jié)核性腦膜炎病情監(jiān)測最重要的指標之一，若中性粒細胞減少或消失，提示預(yù)后良好；若持續(xù)混合型細胞反應(yīng)，提示預(yù)后不良；若再度出現(xiàn)大量嗜中性粒細胞，則提示病情加重或復(fù)發(fā)。

有研究提出的改良抗酸染色法使檢測的敏感度從傳統(tǒng)離心涂片法的 3.3%提高到 82.9%，診斷效率極大提高[18]；還有報道稱創(chuàng)新的聚合酶鏈反應(yīng)檢測技術(shù)是提高診斷中樞神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)核病的敏感方法[19]；在細胞染色方面，對腦脊液單核細胞內(nèi)結(jié)核抗原進行免疫組化檢測可進一步提高檢測的特異性[20]。

2.1.4 霉菌性腦膜炎 霉菌性腦膜炎最常見的致病菌為新型隱球菌。隱球菌為條件致病菌，主要經(jīng)呼吸道傳播。當(dāng)宿主免疫功能低下時經(jīng)血流播散到中樞神經(jīng)系統(tǒng)引起隱球菌性腦膜炎。由于隱球菌性腦膜炎的臨床表現(xiàn)、腦脊液常規(guī)檢查及影像學(xué)檢查缺乏足夠的特異性，故病死率仍在20%～30%[21]。

在腦脊液中找到隱球菌是隱球菌性腦膜炎確診的依據(jù)，所以病原學(xué)檢查是診斷隱球菌性腦膜炎的關(guān)鍵。目前來說，主要的檢測隱球菌的方法有墨汁染色、乳膠凝集試驗和腦脊液細胞學(xué)檢測等。其中，墨汁染色法簡單易行，國內(nèi)報道其陽性率可達80.0%。但由于直接涂片墨汁染色涂片不均勻、雜質(zhì)污染等缺點可能造成陽性率降低, 有報道通過 13 ～19 次墨汁涂片才找到隱球菌[22]；關(guān)于乳膠凝集試驗，有報道[23]稱，其檢測隱球菌多糖抗原的敏感性與特異性均可達 90.0%以上，但同時也有報道，由于受血清中類風(fēng)濕因子的影響可能會導(dǎo)致假陽性反應(yīng)，乳膠凝集實驗特異度只有 56.5%[24]，存在較多假陽性，所以乳膠凝集實驗的特異度還有待觀察；有報道[24]稱，腦脊液細胞學(xué)檢查較傳統(tǒng)的墨汁染色 法及乳膠凝集實驗更有優(yōu)勢，且更直接，是一種先進的快捷便利的方法，能對隱球菌性腦膜炎快速做出敏感度和特異度較高的診斷。

2.1.5 腦寄生蟲病 寄生蟲腦病的細胞學(xué)特征是以嗜酸性粒細胞增多為主,常在4%～10%左右,最高可達60%及以上。寄生蟲病原體的檢出率很低。在寄生蟲腦病急性期可出現(xiàn)一過性中性粒細胞增加，但一般持續(xù)時間較短。

2.1.6 新進展 近十年，國內(nèi)外學(xué)者在普通光鏡鏡檢的細胞學(xué)基礎(chǔ)上，與電鏡技術(shù)、環(huán)介導(dǎo)的等溫擴增(LAMP) 技術(shù)、流式細胞術(shù)等技術(shù)相結(jié)合，使得診斷的可靠性大大提升[25]。其中LAMP技術(shù)可以實現(xiàn)對單純皰疹病毒性腦炎的早期診斷[26]，而流式細胞術(shù)可對中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥患者的血液和腦脊液的淋巴細胞亞群的比例進行分析[27]。

2.2 中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤 中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤患者的腦脊液中可發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞，其特點是“體大核大”，核漿比例失調(diào)，細胞著色很深；細胞有絲分裂活躍,常呈團、簇或花瓣樣、腺管狀排列并且胞膜界限不清，易與其他細胞鑒別，也可通過一些特殊染色方法輔助鑒別。如應(yīng)用 AO染色檢測法觀察核酸的變化來判斷細胞的良惡性程度，應(yīng)用PAS染色法可將組織中的黏多糖類物質(zhì)染成櫻桃紅色, 從而判定腫瘤細胞是否分泌糖原并推斷出腫瘤細胞的起源, 用于某些腫瘤的診斷和鑒別診斷[28]。值得注意的是，對于腦膜癌，其多位于硬膜內(nèi)面及軟腦膜上, 呈顆粒性廣泛分布。因其太薄，故CT和MRI多為陰性[29]，故漏診率較高。其腫瘤細胞檢出率較高，而腦脊液細胞學(xué)就成為了這種情況下的有效檢查方法，作為影像學(xué)檢查的補充方法。

盡管隨著技術(shù)的發(fā)展，對于腫瘤有許多進一步檢查，如查腫瘤標記物、PCR 擴增技術(shù)、單克隆抗體檢測、免疫組化及流式細胞檢測技術(shù)[30]等，然而用 CSF 細胞學(xué)方法鑒別 CSF 中腦脊髓膜癌轉(zhuǎn)移細胞仍是金標準[31]。

腦脊液細胞學(xué)對于中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的診斷、病情監(jiān)測和療效評價具有重要意義，是影像學(xué)檢查的重要補充，并且把對于腦膜癌病等的確診從過去的術(shù)后或死后病理診斷發(fā)展到術(shù)前或生前即可確診的新階段。

2.3 中樞神經(jīng)系統(tǒng)白血病/淋巴瘤 中樞神經(jīng)系統(tǒng)白血病是白血病細胞浸潤腦膜、腦神經(jīng)、腦組織及脊髓等的總稱，其中以蛛網(wǎng)膜和硬腦膜最為多見。淋巴瘤是非腫瘤性淋巴細胞在中樞神經(jīng)系統(tǒng)反應(yīng)性集聚所致。免疫系統(tǒng)多以多克隆形式反映，但腦組織免疫功能較為缺乏，在慢性抗原的刺激下，逐漸變?yōu)閱慰寺≡鲋常蔀榱馨土觥?/p>

腦脊液中瘤細胞的細胞學(xué)特點與外周原發(fā)白血病和淋巴瘤細胞基本相同，故易辨別，但兩者也有一定區(qū)別：前者有惡性細胞特征(核仁較大，胞漿空泡較多等)，而后者沒有。腦脊液中出現(xiàn)白血病細胞或淋巴瘤細胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)白血病/淋巴瘤診斷的特征性改變。部分以中樞神經(jīng)系統(tǒng)損害為首發(fā)癥狀就診的白血病患者，甚至可以出現(xiàn)經(jīng)腦脊液細胞學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)，骨髓確診，而外周血卻找不到幼稚細胞的情況。所以腦脊液細胞學(xué)檢驗是該疾病診斷的金標準。

2.4 腦血管病 蛛網(wǎng)膜下腔出血主要分為3個時期。急性期以大量紅細胞和中性粒細胞為主。其中中性粒細胞比例在70%以上，48～72 h達高峰，一周后逐漸消失。吸收期出血 3～7 d即可見到紅細胞吞噬細胞和含鐵血黃素吞噬細胞—蛛網(wǎng)膜下腔出血的特征性細胞，在吞噬細胞胞漿內(nèi)的含鐵血黃素吞噬細胞被 MGG 染成灰黑色或棕黑色顆粒。同時，激活單核細胞增多，持續(xù)持續(xù)2～3周?；謴?fù)期激活單核細胞增多，可持續(xù)數(shù)周到數(shù)月。

吞噬細胞常可持續(xù)數(shù)周或數(shù)月，以清除腦脊液內(nèi)紅細胞及其分解產(chǎn)物。若腦脊液中紅細胞吞噬細胞消失，只有含鐵血黃素吞噬細胞及膽紅質(zhì)吞噬細胞，則提示腦出血已停止；若一次出血后同時見吞噬新鮮紅細胞，褪色紅細胞，含鐵血黃素和膽紅質(zhì)的吞噬共存，則提示出血未止或有再出血的可能。缺血性腦病患者的腦脊液中除偶見少量紅細胞外，一般沒有其他細胞學(xué)異常。

3 小結(jié)

腦脊液細胞學(xué)檢查在五種中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染診斷與鑒別、兩種腦血管病的診斷與鑒別、病理性出血和穿刺誤傷的鑒別、中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的診斷、中樞神經(jīng)系統(tǒng)白血病和淋巴瘤的診斷以及多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的療效評價及預(yù)后判斷都有著重要的臨床價值。

盡管腦脊液細胞學(xué)發(fā)展迅速，但依然有不少問題噬待解決。我們認為今后腦脊液細胞學(xué)發(fā)展路線應(yīng)該從以下三方面開展：①結(jié)構(gòu)研究，明晰細胞、亞細胞、分子乃至量子的內(nèi)部結(jié)構(gòu),才能闡明生命的本質(zhì)，只有從結(jié)構(gòu)入手才能理解其功能；②信息研究，信息流是生命現(xiàn)象的一項重要活動以及外界信息對細胞的影響(胞膜從胞漿至胞核)；③層次研究，大分子、細胞、細胞間直至人體是幾個主要的不同層次結(jié)構(gòu),任何一個層次的研究都離不開整體的綜合和歸納。