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    2019-nCoV檢測方法的研究進展

    2021-11-28 11:16:02陳立娥王延飛
    濱州醫(yī)學院學報 2021年2期
    關(guān)鍵詞:膠體金核酸特異性

    陳立娥 王延飛

    濱州醫(yī)學院附屬醫(yī)院 山東 濱州 256603

    新型冠狀病毒(2019-nCoV)肺炎疫情爆發(fā)以來,截至2020年6月6日,全球累計確診病例為6 766 314例,累計死亡人數(shù)392 449人,與嚴重急性呼吸綜合征(SARS)和中東呼吸綜合征(MERS)相比,其傳染性更強、傳播速度更快,危害極其嚴重。

    2019-nCoV屬于冠狀病毒亞科β屬,是一種有囊膜的單股正鏈RNA病毒,其基因組長為29 881堿基,編碼為9 860個氨基酸,具有4個結(jié)構(gòu)蛋白,包含12個蛋白編碼區(qū)/開放讀碼框,其中開放讀碼框lab(open reading frame lab,ORFlab)、核殼蛋白(nucleocapsid protein,N)基因和囊膜蛋白(envelope protein,E)基因區(qū)域高度保守,因此常被設計作為引物和探針的結(jié)合位點[1]。張永振課題組對其進行了病毒分離測序并公開結(jié)果后,各國對病毒的研究逐漸深入[2]。面對新冠病毒感染人數(shù)的逐漸增多,亟需更快、更準確的新冠病毒檢測技術(shù)。檢測技術(shù)中,病毒分離是病毒檢測的金標準,但其耗時長,檢測難度高,不適用臨床檢測工作[3],而CT診斷不適合實驗室檢測。根據(jù)目前臨床使用和實驗證據(jù),對新冠病毒檢測的核酸檢測、免疫檢測、聯(lián)合檢測等多種臨床使用和最新實驗室方法進行分析總結(jié),以期對新冠病毒的防控和人群篩查提供參考。

    1 核酸檢測技術(shù)

    1.1 測序技術(shù) 第二代基因測序技術(shù)能夠在短時間內(nèi)實現(xiàn)高通量的未知基因組測序。2019-nCoV便是通過患者的呼吸道分泌物提取病毒RNA,構(gòu)建cDNA文庫進行高通量測序,隨后進行基因組比對分析,從而確定為一種新型的冠狀病毒?;驕y序的優(yōu)勢是:能確定未知樣本的序列,這在疫情爆發(fā)初期具有極大價值;針對臨床高度疑似但逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(reversetranscription-polymerasechainreaction,RT-PCR)診斷為陰性的病例,使用測序技術(shù)可以提高準確性,并判明是否為其他致病病原體;可以檢測病毒是否變異,以便改進檢測手段。然而測序技術(shù)的儀器配置要求高,對檢測人員的技術(shù)要求高,檢測時間長,費用高,不適用于人群大規(guī)模篩查。而納米孔靶向測序(nanopore target sequencing,NTS)技術(shù)作為一種單分子實時的測序技術(shù),利用DNA或RNA通過生物納米孔時產(chǎn)生的電流變化來進行堿基測序,且可配合小型實時測序設備,因此在即時檢測(point-of-care testing,POCT)上擁有廣闊的應用前景。2月29日,武漢大學團隊使用NTS技術(shù)實現(xiàn)了10 min內(nèi)高濃度呼吸道病毒樣品和4 h內(nèi)低濃度樣本的檢測,靈敏度是實時熒光定量PCR的100倍。NTS具有靈敏度高,檢測范圍廣,成本低,反應速度快,且能進行突變監(jiān)測的特點,是其他檢測方法無法有效診斷時最合適的選擇[4]。

    1.2 PCR技術(shù)

    1.2.1 RT-PCR技術(shù) RT-PCR可以通過擴增病毒的特異性片段來定性判斷是否感染病毒。其中實時熒光RT-PCR作為確診的最常用的診斷標準之一,被選入我國《新型冠狀病毒的肺炎診療方案(試行第七版)》。實時熒光RT-PCR的工作原理是首先將2019-nCoV逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,再利用特異性引物通過變溫反應擴增cDNA片段,隨后用熒光信號檢測每次PCR循環(huán)產(chǎn)物的總量。利用RT-PCR可以檢測多種臨床樣品,例如血液、痰液、支氣管肺泡灌洗液、咽鼻拭子、糞便等。RT-PCR具有靈敏、快速、特異性高、適用樣品種類多、重復性好等特點,是較為理想的檢測方法[5]。首個檢定合格的新型冠狀病毒檢測產(chǎn)品是上海之江生物科技股份有限公司的2019-nCoV核酸檢測試劑盒,該試劑盒能在2 h內(nèi)完成一個樣品的檢測,但假陽性率較高,隨后陸續(xù)有80多家生物公司開發(fā)出RT-PCR試劑盒。然而疫情緊急導致產(chǎn)品研發(fā)上市時間短,這些檢測試劑盒的質(zhì)量良莠不齊。從WHO公布的數(shù)據(jù)來看,根據(jù)2019-nCoV的基因組,已經(jīng)設計出針對其上的ORFlab基因、N基因、RdRP基因、E基因,Spike蛋白,ORF1b-nsp14位點的多種擴增序列和探針。同時一步法RNA檢測技術(shù)的出現(xiàn),也讓逆轉(zhuǎn)錄和擴增整合于同一個體系,減少了樣品污染,縮短了檢測時間,更適合大規(guī)模批量檢測[6]。然而,雖然在實驗室中,一步法實時熒光PCR技術(shù)檢測2019-nCoV靈敏度能達到10個拷貝,但受樣品采集污染,運輸不規(guī)范,試劑盒質(zhì)量不一等多種因素,實際臨床中RT-PCR試劑盒的靈敏度在102拷貝范圍。

    1.2.2 數(shù)字PCR 面對RT-PCR靈敏度低的問題,藍柯團隊開發(fā)了微滴式數(shù)字PCR(droplet digital PCR,ddPCR),將檢測的下限值降到了RT-PCR的1/500,并且臨床的總體準確率達到了94.3%,其極低的檢測線適用于2019-nCoV早期診斷和臨床治愈的判斷[7]。數(shù)字PCR技術(shù)是一種運用泊松分布對分子直接定量的技術(shù),其可細化為微滴式、芯片式、微流控等檢測分支,但其核心原理是把體系的大量核酸制備成單分子,并在獨立的反應室進行擴增檢測,這使其具有高靈敏度,甚至能檢測單拷貝的病毒樣品。與RT-PCR相比,數(shù)字PCR的檢測準確性和靈敏度更高,系統(tǒng)更加穩(wěn)定,重復性高,可以減少樣本的交叉感染。然而數(shù)字PCR技術(shù)必須配合相應的檢測儀才能使用,導致其成本較高,同時由于技術(shù)新穎,暫無國家或業(yè)界標準,質(zhì)控無法評價,限制了推廣使用。

    1.3 等溫擴增技術(shù) 恒溫擴增技術(shù)既具有PCR的靈敏特異性強的優(yōu)點,又操作簡單,設備要求低,肉眼即可確定結(jié)果,是一種適合POCT的快速核酸檢測技術(shù)。目前最常用的是環(huán)介導等溫擴增技術(shù)(loop-mediated isothermal amplification,LAMP),該技術(shù)的原理是通過具有鏈置換活性功能的DNA聚合酶,將4對特異性引物與靶基因的6個區(qū)域退火雜交,實現(xiàn)等溫擴增,當靶基因是RNA時,通過添加反轉(zhuǎn)錄酶即可實現(xiàn)對RNA的擴增[8]。該技術(shù)的效率較高,操作方便,但需注意操作中開蓋引起的氣溶膠污染,且其4對引物對靶標序列的選擇性高,使其應用范圍受限。

    有團隊報道運用逆轉(zhuǎn)錄LAMP設計了6個引物在65℃恒溫下對2019-nCoV的ORFlab的8個不同區(qū)域進行擴增檢測,靈敏度達到了97.6%[9]。中國疾病預防控制中心也利用LAMP,與公司合作開發(fā)了能在8~15min完成樣品檢測的試劑盒。2020年2月22日藥監(jiān)局批準了首個基于恒溫擴增技術(shù)的2019-nCoV檢測試劑盒,其能1.5 h內(nèi)檢測16份樣品同時檢測6種呼吸道病毒核酸,高效的進行人群篩查[10]。

    除了LAMP,重組酶聚合擴增技術(shù),滾環(huán)擴增技術(shù),切割酶擴增反應,指數(shù)擴增反應等也陸續(xù)發(fā)展出高效能的試劑盒。其中,雅培公司利用等溫擴增技術(shù)開發(fā)的2019-nCoV檢測技術(shù)能在5~13 min得到結(jié)果,即單日能進行5萬次檢測,得到了美國食品藥品監(jiān)督管理局的應急使用授權(quán)認證。

    1.4 CRISPR技術(shù) 常間回文重復序列叢集(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)系統(tǒng)不僅是基因編輯的利器,更是因為其具有靶向RNA的特性,能夠鑒定是否存在特定序列。同時它可以與等溫擴增技術(shù)相聯(lián)合使用,提高檢測準確度和速度。張鋒團隊基于此開發(fā)出SHERLOCK技術(shù)對樣本處理,核酸擴增,靶核酸序列測定技術(shù)進行改造,實現(xiàn)了常溫下無需PCR儀和離心機等設備,即可測定下限低至1拷貝的核酸檢測。SHERLOCK系統(tǒng)采用了HUDSON核酸提取法進行核酸提取,隨后利用重組聚合酶擴增的方法在兩小時常溫條件下快速擴增靶核酸片段,使用T7 RNA聚合酶將擴增的DNA轉(zhuǎn)錄為RNA后,CRISPR/Cas13系統(tǒng)能在crRNA的引導下,利用Cas13a在crRNA互補位置外的側(cè)翼序列附近切割靶RNA,從而將熒光報告探針切割下來產(chǎn)生熒光,利用熒光信號實現(xiàn)核酸檢測。同時靶RNA存在時,Cas13a會非特異性的切割體系中的單鏈RNA,因此可以高特異性的檢測RNA病毒核酸[11]。

    本次疫情爆發(fā)后,張峰團隊在2020年2月14日成功實現(xiàn)基于SHERLOCK技術(shù),針對ORFlab和S蛋白基因設計了特異性crRNA,開發(fā)出一款即時檢測產(chǎn)品,該產(chǎn)品便在1 h內(nèi)完成10~100拷貝/μL載量檢測[12]。其比RT-PCR靈敏度和敏感性更高,檢測速度更快,應用前景廣闊。然而制備高質(zhì)量均一化的Cas13a蛋白的難度較大,且報道中未到達SHERLOCK技術(shù)理論檢測下限,需要進一步優(yōu)化。

    2 免疫檢測技術(shù)

    根據(jù)WHO的指導意見,血清檢測應該作為核酸檢測的補充。潛在患者的感染急性期和恢復期血清中的血清特異抗體免疫球蛋白G(immunoglobulin G,IgG)/免疫球蛋白M(immunoglobulin M,IgM)可以幫助確診。IgM通常于患者感染2019-nCoV后3~5 d出現(xiàn),濃度與時間和病毒載量相關(guān)。而18 d后IgG含量明顯上升,其陽性表明進入感染中后期或既往感染。目前血清學檢測試劑盒利用抗原抗體特異性結(jié)合的原理,運用了酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA),化學發(fā)光法,膠體金等技術(shù)。

    2.1 ELISA檢測法 ELISA是一種利用抗原抗體特異性結(jié)合,在聚苯乙烯等固相載體上結(jié)合酶標的抗體或抗原,最后利用酶與底物結(jié)合的顯色反應,對待測抗原或抗體進行定量的方法[13]。雖然國內(nèi)有許多針對新冠病毒的ELISA試劑盒,然而不同廠家的試劑盒檢測效果不一。即使ELISA能夠相對定量的檢測病毒核酸,但由于ELISA的操作相比化學發(fā)光法復雜,手工操作的誤差較大,檢測時間更長,故臨床應用較少。

    2.2 化學發(fā)光法 化學發(fā)光技術(shù)是利用類磁粒子包被待檢靶抗原的特異性抗體,并利用吖啶酯類等化學發(fā)光標記物作為二抗,通過激發(fā)液激發(fā)后,檢測發(fā)光強度,進而直接檢測病毒抗原的方法[14]。特異性抗體主要針對病毒的表面蛋白或者高度保守的N、S蛋白等。

    化學發(fā)光技術(shù)檢測試劑盒是臨床一線使用最廣泛的針對IgM/IgG抗體的試劑盒。例如,重慶醫(yī)科大學與博奧賽斯公司研發(fā)的試劑盒,對IgM和IgG抗體靈敏度分別為93.7%和89.6%,特異性分別為96.20%和92.41%,總計已完成13 532例檢測[15]。美康公司使用硝酸纖維膜包埋抗體,并將特異性抗體標記納米顆粒,運用納米顆粒的顯色作用,實現(xiàn)了對病毒蛋白進行定性檢測和快速篩查。另有團隊報道了使用利用合成的S蛋白肽來檢測血清中IgG和IgM抗體的方法,這種合成肽的穩(wěn)定性和可重復性很高,并且比直接使用病毒作為抗原更加具有特異性,臨床診斷陽性率能達到81.5%[16]。

    化學發(fā)光技術(shù)的免疫檢測試劑盒檢測快速,并且能實現(xiàn)高通量和低成本,適用于流行病學篩查和病程監(jiān)測,然而其數(shù)據(jù)依賴高靈敏度的光電倍增管捕獲光子,無法實現(xiàn)POCT[17]。

    2.3 膠體金免疫層析技術(shù) 膠體金免疫層析技術(shù)是主流的抗體檢測方法,占抗體檢測市場的80%。其原理是膠體金顆粒的靜電作用能結(jié)合蛋白質(zhì)分子,將硝酸纖維素膜上包被病毒抗原,利用側(cè)向免疫層析原理捕獲到的膠體金標記的IgM和IgG抗體會與包被抗原形成抗原抗體復合物,由此實現(xiàn)信號放大,在檢測線處形成紅色反應線。

    有團隊利用這一技術(shù)開發(fā)了定點測流免疫分析技術(shù),該技術(shù)能在15 min內(nèi)同時檢測臨床血液樣本的IgM和IgG,且監(jiān)測臨床陽性2019-nCoV樣本準確性能達到88.66%,特異性為90.63%[18]。

    然而膠體金技術(shù)的準確性和特異性會受到抗體金標記量、加樣量、非特異性吸附、樣品污染、患者自身抗體干擾等限制,這讓膠體金技術(shù)僅能進行定性檢測,且其靈敏性特異性均低于化學發(fā)光法和RT-PCR技術(shù)。但憑借其操作極其方便,結(jié)果肉眼可見,檢測時間短,膠體金技術(shù)在POCT領域廣受歡迎[19]。

    3 實驗室聯(lián)合檢測

    在臨床工作中,最常用的RT-PCR方法會帶來假陽性、假陰性率高,操作繁瑣的問題,而免疫檢測又存在窗口期,容易受患者自身攜帶其他抗體的影響,因此為了提高檢測的準確性,一般會選用多檢測聯(lián)合的方式。中國衛(wèi)健委的第七版診療方案中明確指出應該使用“核酸+抗體”聯(lián)合的檢測方案來彌補單檢測帶來的誤診。

    除了核酸-抗體聯(lián)合,有證據(jù)表明2019-nCoV感染患者的血常規(guī),生化免疫等指標均有一致的規(guī)律性變化[20]。在發(fā)病早期,患者的白細胞和淋巴細胞數(shù)量可能會減少,這提示了血常規(guī)檢查的重要性。根據(jù)臨床分析,淋巴細胞亞群分析可能預測疾病轉(zhuǎn)歸,且在重癥及危重癥患者中出現(xiàn)淋巴細胞耗竭現(xiàn)象為100%,對淋巴細胞亞群分析可以盡早對淋巴細胞耗竭現(xiàn)象進行干預[21]。

    4 小結(jié)

    檢測技術(shù)從實驗室到臨床要經(jīng)歷四個階段:概念認證階段、少量樣本分析階段、大量患者參與臨床試驗階段和技術(shù)商業(yè)化階段。而疫情爆發(fā)以來,雖然各式2019-nCoV檢測方法層出不窮,但大多只停留在第二步少量樣本分析階段,未能真正商業(yè)化運用。目前雖然RT-PCR的方式被質(zhì)疑準確性不佳,但血清免疫學檢查無法篩查低病毒載量和無癥狀感染者,數(shù)字PCR和SHERLOCK技術(shù)雖大大提高了靈敏度卻沒有行業(yè)運用標準。在RT-PCR核酸檢測試劑盒能及時滿足臨床需要的情況下,應開始考慮如何提高2019-nCoV檢測技術(shù)的靈敏度,準確性和通量,并爭取能實現(xiàn)全自動流水線式操作或能滿足POCT的要求。

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