沈加裙 方 靜 馬春梅 林麗圓 胡繼軍

抗乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus，HBV)感染疫苗使用已有30多年的歷程，而慢性乙型肝炎(Chronic Hepatitis B，CHB)仍然是全球常見的疾病[1]。CHB可逐步發(fā)展為肝硬化、肝失代償及肝癌，導(dǎo)致每年死亡人數(shù)約100萬(wàn)[2]。目前，抗病毒治療對(duì)大部分CHB患者是有效的，主要包括2類藥物：核苷類藥物，例如恩替卡韋，可抑制病毒聚合酶及干擾病毒復(fù)制；干擾素，包括聚乙二醇類化合物，具有抗病毒和免疫調(diào)節(jié)作用[3]。對(duì)于HBeAg陽(yáng)性CHB患者，長(zhǎng)效型干擾素依然是重要的一線治療藥物，因?yàn)樵谟邢薜闹委熯^程后，大約25% 的患者可以獲得長(zhǎng)期的非治療持續(xù)反應(yīng)[4,5]。近期國(guó)際臨床指南提出，HBeAg陽(yáng)性患者HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換被認(rèn)為是持久治療反應(yīng)和臨床結(jié)果改善的標(biāo)志[6,7]。

HBV RNA是一種游離型病毒，與病毒學(xué)反應(yīng)和預(yù)后密切相關(guān)[8,9]。CHB患者血清HBV RNA在接受治療期間的變化仍不清楚，HBV RNA是否能預(yù)測(cè)HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換也存在爭(zhēng)議。近期有報(bào)道指出，接受聚乙二醇干擾素α-2a治療CHB患者的血清HBV RNA水平可預(yù)測(cè)HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換，但其對(duì)病毒學(xué)反應(yīng)的預(yù)測(cè)價(jià)值研究甚少，而且研究對(duì)象中較多曾經(jīng)接受過其它相關(guān)治療，可能會(huì)影響血清學(xué)相關(guān)指標(biāo)結(jié)果[10]?；诖耍狙芯吭O(shè)置更嚴(yán)格的納入標(biāo)準(zhǔn)，以首次接受聚乙二醇干擾素α-2a治療的CHB患者為研究對(duì)象，觀察治療前和治療6個(gè)月后HBV RNA水平變化，分析HBV RNA與血清其它相關(guān)指標(biāo)的關(guān)系及預(yù)測(cè)HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換和病毒學(xué)應(yīng)答的臨床意義。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象及分組

納入2020-04—2020-12本院感染科確診、并開始接受聚乙二醇干擾素α-2a治療的CHB患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)首次接受聚乙二醇干擾素α-2a治療；(2)只接受聚乙二醇干擾素α-2a單一治療，并未終止；(3)簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)嚴(yán)重肝臟相關(guān)并發(fā)癥(包括失代償性肝硬化、肝細(xì)胞癌和肝移植)；(2)同時(shí)感染人類免疫缺陷病毒(HIV)或丙型肝炎病毒(HCV)；(3)藥物聯(lián)合治療；(4)治療前后未獲得血清標(biāo)本；(5)依從性差。研究最終納入38例CHB患者參加此項(xiàng)統(tǒng)計(jì)分析，其中15例患者獲得病毒學(xué)應(yīng)答(VR)，23例獲得部分病毒學(xué)應(yīng)答(PVR)。CHB患者經(jīng)過長(zhǎng)達(dá)6個(gè)月聚乙二醇干擾素α-2a治療后，HBV DNA水平無(wú)法檢測(cè)者為病毒學(xué)應(yīng)答組，HBV DNA陽(yáng)性(水平降低>2 log10 copies/ml)納入部分病毒學(xué)應(yīng)答組。38例患者中男31例、女7例，平均年齡為37.53歲；HBeAg陽(yáng)性患者有32(84.2%)例，血清HBV RNA水平為4.12 log10 copies/ml(見表1)。在治療前，32例患者為HBeAg陽(yáng)性，其中14例在治療期間獲得血清學(xué)轉(zhuǎn)換。每位患者均簽署知情同意書，該研究也獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

表1 CHB患者一般臨床表征

分組：(1) 依據(jù)治療后結(jié)果分為病毒學(xué)應(yīng)答組(VR組，n=15，經(jīng)6個(gè)月治療后，HBV DNA水平降低>2log10 IU/ml)和部分病毒學(xué)應(yīng)答組(PVR組，n=23，經(jīng)6個(gè)月治療后，HBV DNA水平無(wú)法檢測(cè))；(2)根據(jù)HBeAg分為HBeAg+血清學(xué)轉(zhuǎn)換組(A組，n=14)、HBeAg+血清學(xué)非轉(zhuǎn)換組(B組，n=18)和HBeAg陰性組(C組，n=6)。

1.2 治療方法

聚乙二醇干擾素α-2a注射液(上海羅氏制藥公司，國(guó)藥準(zhǔn)字J20190068，規(guī)格：180μg/支)皮下注射治療，180μg/次，1次/周，持續(xù)治療6個(gè)月。

1.3 檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.3.1 血樣采集及處理：分別采集CHB患者治療前后空腹靜脈血5ml，經(jīng)3 000r/min離心10min，取血清。

1.3.2 主要觀察指標(biāo)：(1)谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)采用全自動(dòng)生化分析儀(AU5800型，貝克曼庫(kù)爾特)及其配套試劑進(jìn)行檢測(cè)。(2)采用Architect i2000化學(xué)發(fā)光免疫分析儀(美國(guó)雅培公司)及其配套試劑對(duì)HBsAg和HBeAg進(jìn)行定量分析。(3)熒光定量COBAS TAQ-MAN儀(羅氏)及試劑(中山大學(xué)達(dá)安基因公司)檢測(cè)HBV DNA水平，最低檢測(cè)限為100IU/ml；與GenBank(NCBI)數(shù)據(jù)庫(kù)中preS/S基因序列比對(duì)，進(jìn)而鑒定HBV基因型。(4)qRT-PCR法檢測(cè)血清HBV RNA水平，采用QIAamp Viral Mini試劑盒(Qiagen，Germany)提取血清中HBV RNA，將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，特異性引物序列為：5，-ACC ACG CTA TCG CTA CTC-3，。ABI Prism 7500測(cè)序檢測(cè)系統(tǒng)(Applied Biosystems, Foster City, CA, 美國(guó))對(duì)HBV RNA進(jìn)行定量分析，采用Taqman探針法。引物序列為：F: 5，-ACC ACG CTA TCG CTA CTC AC-3，，R:5，-CAA CTT TTT CAC CTC TGC CTA-3，；探針序列為：(TAMARA)CAT GTC CTA CTG TTC AAG CCT CCA AG(BHQ2)。qRT-PCR反應(yīng)體系共25μl，包含2.5μl的Buffer(10×)、2μl的dNTPs(2.5mmol/L)、每種引物各1μl、0.5μl的探針、0.25μl的Taq DNA聚合酶和17.75μl的ddH2O。反應(yīng)條件為95℃變性10min，95℃ 15s，60℃ 1min，共40個(gè)循環(huán)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 VR 組與 PVR 組各有關(guān)指標(biāo)比較

治療前，PVR組患者HBV DNA和HBsAg水平均高于VR組，HBeAg+百分率高于VR組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，兩組患者血清ALT和HBV RNA水平無(wú)明顯差異(P>0.05)。治療后，與VR組患者比較，PVR組患者血清HBV RNA和HBV DNA均升高，HBeAg+百分率和ALT水平高于VR組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。兩組HBsAg差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。相比于治療前，治療后VR組患者血清ALT、HBV DNA和HBV RNA水平均顯著降低(P<0.05或P<0.01)，PVR組患者血清HBV RNA水平顯著升高，ALT和HBV DNA水平均顯著降低(P<0.05或P<0.01)。見表2。

表2 VR組與PVR組CHB患者治療前后各指標(biāo)比較

2.2 A組、B組、C組治療前后各有關(guān)指標(biāo)比較

治療前，A組與B組患者各指標(biāo)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與A組比較，治療前C組患者血清HBV DNA較低(P<0.05)。治療6個(gè)月后，A組、B組和C組ALT和HBV DNA均較治療前降低(P<0.05)，A組和B組HBV RNA較治療前降低(P<0.05)；治療后B組患者血清HBV RNA水平顯著高于A組(P<0.05)。見表3。

表3 不同HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換CHB患者治療前后各指標(biāo)水平比較

2.3 多因素回歸分析CHB患者HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換和病毒學(xué)應(yīng)答的影響因素

實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步采用多因素回歸分析影響CHB患者HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換和病毒學(xué)應(yīng)答的臨床指標(biāo)，將具有差異性的HBsAg、HBV DNA和HBV RNA指標(biāo)進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HBV RNA水平與HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換和病毒學(xué)應(yīng)答均顯著相關(guān)(P<0.01)。

2.4 ROC曲線分析HBV RNA對(duì)HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換和病毒學(xué)應(yīng)答的預(yù)測(cè)價(jià)值

治療前HBV RNA水平對(duì)HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換有較好的預(yù)測(cè)價(jià)值(AUC=0.852)，此時(shí)Cut off值為4.08 log10 copies/ml、敏感度為0.83、特異度為0.79。治療后HBV RNA水平對(duì)病毒學(xué)應(yīng)答具有較好的預(yù)測(cè)價(jià)值，Cut off值為3.05 log10 copies/ml，AUC=0.803、敏感度和特異度分別為0.76和0.71。見圖1和圖2。

圖1 治療前HBV RNA對(duì)CHB患者HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換的ROC曲線分析

圖2 治療后HBV RNA對(duì)CHB患者病毒學(xué)應(yīng)答的ROC曲線分析

3 討 論

60%的CHB患者接受抗病毒藥物治療1年后，血清HBV DNA水平會(huì)降低至檢測(cè)下限；然而，一些患者還會(huì)出現(xiàn)血清學(xué)反應(yīng)，如HBeAg、HBsAg抗體消失[11]。因此，如果HBV DNA維持在不可檢測(cè)水平，很難預(yù)測(cè)患者是否獲得血清學(xué)反應(yīng)。為了解決這樣一個(gè)難題，本研究探討HBV RNA水平與CHB患者的病毒學(xué)應(yīng)答和HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換的關(guān)系，以及HBV RNA是否是預(yù)測(cè)HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換的獨(dú)立因素及其診斷價(jià)值。

表4 多因素回歸分析HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換和病毒學(xué)應(yīng)答的影響指標(biāo)

通過比較VR組和PVR組患者血清HBV RNA水平的動(dòng)態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)VR組患者血清HBV RNA水平顯著降低。然而，PVR組患者血清HBV RNA水平則顯著升高；由此說明，有效抑制病毒復(fù)制不僅是降低HBV DNA水平，而且還得降低HBV RNA水平[12]。另外，A組相比于B組患者血清HBV RNA顯著降低，說明HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換有利于病毒載量降低。早期已有研究報(bào)道，血清HBVRNA是出現(xiàn)在病毒樣顆粒中的前基因組RNA(pgRNA)，而阻斷HBV聚合酶可以導(dǎo)致pgRNA聚集，接受抗病毒治療后HBV RNA水平會(huì)降低[13,14]。CHB患者在接受抗病毒治療時(shí)，獲得HBV RNA陽(yáng)性血清學(xué)轉(zhuǎn)換的患者血清HBV RNA水平明顯降低[15]，該研究結(jié)果與本文發(fā)現(xiàn)一致。上述結(jié)果提示，HBV RNA可以預(yù)測(cè)抗病毒治療的效果及HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換。

多變量因素回歸分析結(jié)果表明，血清HBV RNA是CHB患者獲得HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換和VR的影響因素。盡管可通過檢測(cè)HBV DNA水平來提示患者是否獲得病毒學(xué)應(yīng)答，但是在獲得PVR的患者血清中HBV RNA水平升高。由于血清HBV DNA和RNA都只來源于cccDNA，于是阻斷逆轉(zhuǎn)錄活性的可部分作用引起HBV RNA水平增加。ROC曲線分析表明，治療后獲得HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換和病毒學(xué)應(yīng)答的患者血清HBV RNA水平會(huì)降低。

總之，CHB患者血清HBV RNA水平可以較好的預(yù)測(cè)HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換和病毒學(xué)應(yīng)答；而且CHB患者血清HBV RNA水平低于4.08 log10 copies/ml時(shí)可更好的獲得HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換。因此，聚乙二醇干擾素α-2a 用于治療慢性乙型肝炎，憑借其雙重作用機(jī)制實(shí)現(xiàn)持久免疫控制，可有效提高乙肝病毒學(xué)指標(biāo)轉(zhuǎn)陰率、改善肝功能，值得臨床推廣應(yīng)用，而且其治療效果還可用HBV RNA水平進(jìn)行預(yù)測(cè)。

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