多發(fā)性硬化患者腫瘤壞死因子樣弱凋亡誘導(dǎo)因子和神經(jīng)絲輕鏈水平變化及臨床意義

楊 睿 張光戀

多發(fā)性硬化(Multiple Sclerosis，MS)是一種慢性中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，由脫髓鞘、炎癥和退行性過程導(dǎo)致的不可逆功能障礙[1]。退化過程主要體現(xiàn)于MS患者繼發(fā)的局部或彌漫性炎癥，尋找持續(xù)的炎癥標(biāo)志物對于治療干預(yù)非常重要[2]。臨床上通常采用中樞神經(jīng)系統(tǒng)核磁共振成像(MRI)確診MS復(fù)發(fā)或炎癥反應(yīng)，然而，復(fù)發(fā)患者檢測炎癥反應(yīng)過程的敏感性極低[3,4]。此外，MRI涉及的成本、檢查時間、患者舒適度及釓累積的潛在有害影響導(dǎo)致其無法成為有效的一種檢測方法[5]。因此，尋找持續(xù)性炎癥的血液生物標(biāo)志物，對于患者日常監(jiān)測非常重要。

MS發(fā)病與中樞神經(jīng)系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)之間的交流障礙有關(guān)，而炎性細(xì)胞因子會誘導(dǎo)此障礙的發(fā)生。腫瘤壞死因子樣弱凋亡誘導(dǎo)因子(TWEAK)是一種跨膜蛋白，屬于腫瘤壞死因子配體家族成員的細(xì)胞因子，其廣泛表達(dá)于大腦組織[6]。TWEAK主要由單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及神經(jīng)小膠質(zhì)細(xì)胞分泌[7]，是一種分泌型蛋白，可作為可溶性細(xì)胞因子發(fā)揮作用。早期已在MS動物模型中證實，TWEAK在中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)期間有促炎作用；然而，在免疫細(xì)胞招募通過血腦屏障過程中阻斷TWEAK信號可起神經(jīng)保護(hù)作用[8]。MS患者尸檢發(fā)現(xiàn)，大腦硬化部位TWEAK表達(dá)上調(diào)，而且還與炎癥程度和脫髓鞘密切相關(guān)[6]，提示其可能與MS疾病的嚴(yán)重程度相關(guān)。神經(jīng)絲是一種中間纖維蛋白質(zhì)，在軸突發(fā)育、軸突徑向生長、成熟神經(jīng)元軸突皮質(zhì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)和運(yùn)輸功能等方面發(fā)揮不可或缺的作用。軸突損傷將神經(jīng)絲釋放到細(xì)胞外液，在腦脊液中可以測量神經(jīng)絲輕鏈(NfF) ，可作為軸突變性的生物標(biāo)志物[9]。本研究探討MS患者腦脊液和血清中TWEAK和NfL水平的變化及與病情嚴(yán)重程度的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 研究對象和分組

本項前瞻性研究于2017-01—2020-06共納入本院神經(jīng)內(nèi)科就診的76例MS患者和23例非炎癥性神經(jīng)系統(tǒng)疾病(OND)患者，患者診斷均符合2017修訂版McDonald標(biāo)準(zhǔn)[10]。將感覺減退、分離性障礙或緊張性頭痛患者(腦脊液和MRI表征正常)納入OND組(中位數(shù)年齡為43歲) 。MS患者包含39例復(fù)發(fā)緩解型(RRMS組)[包含22例復(fù)發(fā)期復(fù)發(fā)緩解型MS(中位數(shù)年齡為47歲，病史中位數(shù)為59個月)和17例急性加重期復(fù)發(fā)緩解型MS(中位數(shù)年齡為49歲，病史中位數(shù)為7個月)]和37例慢性進(jìn)展型(PMS組)[包含13例繼發(fā)進(jìn)展型MS(中位數(shù)年齡為51歲，病史中位數(shù)為287個月)和24例原發(fā)進(jìn)展型MS(中位數(shù)年齡為52歲，病史中位數(shù)為61個月)]，急性加重期定義為持續(xù)24h以上的局灶性神經(jīng)系統(tǒng)紊亂[11]。樣本采集前RRMS患者4例處在復(fù)發(fā)緩解期，并接受疾病修飾治療，其中2例接受干擾素-β、1例接受那他珠單抗、1例接受阿侖單抗。PMS組中3例接受疾病修飾治療(那他珠單抗、干擾素-β和鹽酸芬戈莫德)。另外，有62例MS患者進(jìn)行了腰椎穿刺時的顱磁共振成像(MRI)，并且還有54例患者還進(jìn)行了頸部和胸部脊髓MRI檢查。66.1%(n=41)的MS患者病灶數(shù)>9，32.3%(n=20)的MS患者病灶數(shù)在2-9之間，僅1.6%(n=1)的患者頭顱MRI成像病灶數(shù)<2。

1.2 腦脊液和血清標(biāo)本采集

患者腦脊液和血清標(biāo)本在入院后第二天凌晨采集，RRMS患者腦脊液和血清標(biāo)本在應(yīng)用甲基去氫氧化可的松治療前進(jìn)行收集，按照標(biāo)準(zhǔn)化方案儲存，以降低標(biāo)本中的生物反應(yīng)[12]，并排除溶血腦脊液標(biāo)本。采集樣本于-80 ℃保存，待所有標(biāo)本收齊后集中檢測。

1.3 腦脊液、血清TWEAK和NfL水平檢測

將凍存于-80℃的腦脊液和血清標(biāo)本于室溫解凍，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗測定TWEAK和NfL水平，試劑盒為Diaclone SAS產(chǎn)品。具體操作步驟如下：將ELISA試劑盒置于室溫環(huán)境平衡30min，每孔加入100μl待測腦脊液或血清標(biāo)本，置于37℃孵育1h；棄去血清，洗板1次，加入新鮮稀釋的生物素標(biāo)記抗體100μl，37℃孵育1h；洗板3次，拍干，再加入100μl酶結(jié)合物稀釋液，37℃孵育30min；洗板3次，拍干，每孔加100μl顯色底物，37℃避光孵育15min；最后加入100μl終止液，3min內(nèi)完成測定，并記錄結(jié)果。腦脊液/血清中白蛋白比值作為血-腦脊液屏障功能指標(biāo)[13]，血清白蛋白采用溴甲酚綠法測定(采用德國西門子全自動生化分析儀及配套試劑)。

1.4 核磁共振掃描(MRI)成像分析

患者入院確診后采用1.5 Tesla核磁共振掃描儀(Symphony，德國西門子)進(jìn)行大腦和脊髓核磁共振掃描，分析MS患者病灶數(shù)和病變位置。

1.5 MS嚴(yán)重程度評估

應(yīng)用MS殘疾評分(EDSS)、MS嚴(yán)重程度評分(MSSS)和年齡相關(guān)的MS嚴(yán)重程度評分(ARMSS)評估患者疾病嚴(yán)重程度[14]。每種評分方式均按照量表內(nèi)容由專業(yè)醫(yī)師評價完成。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

采用19.0 SPSS統(tǒng)計學(xué)軟件(IBM公司，Armonk，NY，美國)進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)采用中位數(shù)、四分位數(shù)[M(P25,P75)]表示。Shapiro-Wilk檢驗用于數(shù)據(jù)分布分析，Mann-Whitney U-檢驗用于偏態(tài)分布參數(shù)中位數(shù)比較，一般線性模型用于分析TWEAK和年齡之間強(qiáng)相關(guān)性帶來的可能混雜偏移，相關(guān)性分析采用Spearman's rho檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組患者TWEAK、NfL及疾病嚴(yán)重程度評分比較

RRMS組與PMS組各疾病嚴(yán)重程度評分差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與RRMS組比較，PMS組EDSS、MSSS、ARMSS評分均升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。各組腦脊液/血清白蛋白比值、血清和腦脊液中TWEAK及NfL水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。除RRMS組與PMS組腦脊液/血清白蛋白比值、腦脊液中NfL水平以及OND組與RRMS組腦脊液TWEAK水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，其余各指標(biāo)水平兩兩組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組患者疾病嚴(yán)重程度評分及腦脊液和血清生物標(biāo)志物水平比較[M(P25,P75)]

2.2 腦脊液和血清中TWEAK與NfL水平的相關(guān)性分析

MS患者以及RRMS和PMS患者中，腦脊液以及血清中TWEAK與NfL水平均呈正相關(guān)(P<0.05)，見表2。

表2 MS、PMS和RRMS患者腦脊液和血清中TWEAK與NfL水平相關(guān)性分析

2.3 腦脊液和血清中TWEAK和NfL水平與疾病嚴(yán)重程度評分的相關(guān)性分析

MS患者腦脊液TWEAK水平與EDSS評分呈正相關(guān)(P<0.01)，血清TWEAK水平與EDSS、MSSS、ARMSS評分均呈正相關(guān)(P<0.01)，血清NfL水平與EDSS評分呈正相關(guān)(P<0.01)，其余指標(biāo)間無明顯相關(guān)性(P>0.05)。RRMS患者血清TWEAK水平與EDSS評分呈正相關(guān)(P<0.01)，其余指標(biāo)間無明顯相關(guān)性(P>0.05)。PMS患者血清TWEAK水平與EDSS、ARMSS評分均呈正相關(guān)(P<0.01)，血清NfL水平與EDSS評分呈正相關(guān)(P<0.05)，其余指標(biāo)間無明顯相關(guān)性(P>0.05)。見表3、表4、表5。

表3 PMS組患者腦脊液或血清TWEAK水平與疾病評分的相關(guān)性分析

表4 RRMS組患者腦脊液或血清TWEAK水平與疾病評分的相關(guān)性分析

表5 PMS組患者腦脊液或血清TWEAK水平與疾病評分的相關(guān)性分析

2.4 MS患者TWEAK和NfL與MRI成像結(jié)果的相關(guān)性分析

MRI成像病灶數(shù)>9的患者腦脊液和血清中TWEAK水平均顯著高于2-9個病灶的患者(P<0.01)；MRI成像病灶數(shù)>9的患者血清中NfL水平均顯著高于2-9個病灶的患者(P<0.01)。腦脊液和血清TWEAK水平不受病灶位置的影響。見表6。

表6 MS患者M(jìn)RI成像病灶數(shù)和病灶位置對TWEAK水平的影響[M(P25,P75)]

3 討 論

與公認(rèn)的神經(jīng)軸突損傷標(biāo)志物NfL相比，關(guān)于炎性因子TWEAK與MS疾病嚴(yán)重程度的相關(guān)性研究較少。有越來越多的證據(jù)表明，MS患者病變部位存在炎癥反應(yīng)[15]，實驗使用ELISA檢測到MS患者腦脊液和血清中TWEAK水平升高。該研究發(fā)現(xiàn)MS或OND患者腦脊液與血清中TWEAK水平存在較強(qiáng)的相關(guān)性，與早期描述的腦脊液和血清中NfL水平存在相關(guān)性一致[16,17]。

本研究發(fā)現(xiàn)PMS患者腦脊液或血清中TWEAK水平相比于OND患者升高， PMS患者腦脊液或血清中TWEAK與NfL水平呈顯著相關(guān)性，慢性活動性或非活動性損傷主要發(fā)生在大量炎性小膠質(zhì)細(xì)胞堆積的PMS患者腦組織，而且該炎癥性免疫細(xì)胞可抑制髓鞘和軸突再生[18,19]。另外，RRMS患者腦主要活動區(qū)域的炎癥性小膠質(zhì)細(xì)胞具有雙重作用，它們可通過分泌促炎細(xì)胞因子、細(xì)胞毒性因子和招募各種亞型免疫細(xì)胞來增強(qiáng)炎癥活性。同時，它們又可以終止免疫反應(yīng)，支持輔助性T細(xì)胞的分化，促進(jìn)髓鞘再生[20]。RRMS患者血清TWEAK與EDSS評分相關(guān)可用于解釋炎癥性小膠質(zhì)細(xì)胞的雙重作用。

除了小膠質(zhì)細(xì)胞的不同炎癥活化程度外，MS患者硬化病灶在不同神經(jīng)軸突觸死亡的程度上也有所差異；其中活動性病變較慢性活動性或非活動性病變表現(xiàn)出更多的軸突損傷[21]。TWEAK與臨床嚴(yán)重程度評分的相關(guān)性在血清中最為顯著。其原因可能是TWEAK表達(dá)主要發(fā)生在小膠質(zhì)細(xì)胞軸突上，該細(xì)胞還參與血腦屏障的形成，可與血管直接接觸[22]。考慮到MS患者硬化病灶周圍分布著血管，TWEAK可能部分直接分泌進(jìn)血液，而非腦脊液。

該項目仍然需要進(jìn)一步的前瞻性研究，獲得更多樣本量、隨訪樣本、更詳細(xì)的MRI報告及上述生物標(biāo)志物在急性加重期之后的時間變化，以期解釋除炎癥性病變負(fù)荷外，其它如白質(zhì)或灰質(zhì)萎縮對MS的影響?？傊?，本研究發(fā)現(xiàn)MS患者血清TWEAK水平升高；TWEAK和NfL水平與疾病嚴(yán)重程度相關(guān)，表明小膠質(zhì)細(xì)胞可能在MS神經(jīng)軸突死亡中起作用；且TWEAK可能是一個可用于評估疾病嚴(yán)重程度的標(biāo)志物。

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