基于種特異引物（SS-COI）快速鑒定銹紅果實蠅

黃振 郭瓊霞 侯有明

摘要 [目的]開展不受蟲態(tài)限制的實蠅快速鑒定技術(shù)研究。[方法]基于mtDNA COⅠ基因序列，篩選設(shè)計了一對能夠準(zhǔn)確鑒定銹紅果實蠅的種特異性引物XF29和XR29 選用銹紅果實蠅作為陽性對照，顏帶實蠅B.cilifer （Hendel）、瘤脛實蠅B.tuberculata （Bezzi）等19種實蠅作為陰性對照，進行PCR擴增和電泳檢測。[結(jié)果]僅陽性種銹紅果實蠅在約265 bp的位置擴增出一條清晰且單一的條帶，其余實蠅均未出現(xiàn)任何條帶。[結(jié)論]采用SS-PCR技術(shù)，基于mtDNA COⅠ基因序列篩選設(shè)計的特異引物種特異性和穩(wěn)定性強，可為進出境果蔬檢疫、疫情早期預(yù)警和有效監(jiān)測防治提供快速鑒定的依據(jù)。

關(guān)鍵詞 銹紅果實蠅;SS-PCR技術(shù); COⅠ基因;種特異性引物;分子鑒定

中圖分類號 S 433? 文獻標(biāo)識碼 A

文章編號 0517-6611（2021）21-0164-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.21.040

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Rapid Identification of Bactrocera rubigina by Species-specific Primers （SS-COI）

HUANG Zhen? GUO Qiong-xia3，HOU? You-ming1

（1.College of Plant Protection，F(xiàn)ujian Agriculture and Forestry University，F(xiàn)uzhou，F(xiàn)ujian? 350002;2.Fuzhou Changle Airport Customs，F(xiàn)uzhou，F(xiàn)ujian 350209;3.Fuzhou Customs Technology Center，F(xiàn)uzhou，F(xiàn)ujian? 350001）

Abstract

[Objective]To study the rapid identification technology of? Bactrocera rubigina.[Method]Based on mtDNA COⅠ gene sequence， a pair of species-specific primers XF29 and XR293 were screened and designed， which could accurately identify Bactrocera rubigina.Bactrocera rubigina was selected as positive control， and 19 fruit flies such as B. cilifer and B. tuberculata were selected as negative control for PCR amplification and electrophoresis detection.[Result]Only the positive fruit fly rust red fruit fly amplified a clear and single band at about 265 bp， and none of the other fruit flies showed any band.[Conclusion]Using SS-PCR technology， the specific primers designed based on mtDNA COⅠ gene sequence screening have strong species specificity and stability， which can provide rapid identification basis for entry and exit fruit and vegetable quarantine， early warning of epidemic situation and effective monitoring and control.

Key words Bactrocera rubigina;SS-PCR;COI;Species specific primers;Molecular identification

基金項目 福建省自然科學(xué)基金項目 （2011J01066，2012JO1061）。

作者簡介 黃振（1985—），男，福建莆田人，農(nóng)藝師，博士，從事農(nóng)業(yè)昆蟲與害蟲防治研究。*通信作者：郭瓊霞，研究員，從事雜草分類和植物檢疫研究;侯有明，研究員，博士，從事昆蟲生態(tài)研究。

收稿日期 2021-03-14

銹紅果實蠅（Bactrocera rubigina （Wang & Zhao））是一種重要的檢疫性害蟲，屬雙翅目（Diptera）實蠅科（Tephritidae）果實蠅屬（Bactrocera）。我國于1999年在深圳羅湖口岸首次被截獲[1]，目前主要分布在老撾[2]、不丹[3]、越南[4]、孟加拉[5]以及中國的海南[6-7]、廣東[6]、廣西[6，8]、云南[9]等地。銹紅果實蠅是具有重要經(jīng)濟意義的果蔬害蟲，寄主多，危害大，主要危害辣椒、輪葉木姜子[10]等果蔬。其幼蟲在果內(nèi)取食危害，且隨寄主果實或包裝物等進行遠距離傳播，而傳統(tǒng)單靠成蟲鑒定實蠅的方法，難以適應(yīng)現(xiàn)有口岸高通量、快進快出的檢疫鑒定需求，故此開展不受蟲態(tài)限制的實蠅快速鑒定技術(shù)研究，對適應(yīng)和提升口岸對實蠅的快速鑒定具有現(xiàn)實的重要意義，也是快速通關(guān)、早期預(yù)警和防止傳入傳播的基本要求和重要手段。

隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，采用分子鑒定昆蟲種類的方法可以解決不受蟲態(tài)限制的種類鑒定問題[11-12]。mtDNA COI——線粒體細胞色素 c氧化酶亞基 I基因序列結(jié)構(gòu)相對保守，而種間的變異較大，序列的差異程度可以將特定種類區(qū)分開，所以線粒體基因序列被應(yīng)用于實蠅近緣種系統(tǒng)發(fā)育研究也越來越多[13-14]。筆者應(yīng)用mtDNA COI基因序列，篩選設(shè)計種特異性引物、快速鑒定銹紅果實蠅的方法，為解決口岸進境果蔬檢疫截獲的、疫情調(diào)查監(jiān)測中發(fā)現(xiàn)的疑似銹紅果實蠅不同蟲態(tài)的鑒定提供依據(jù)[15]。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源 供試實蠅種類有銹紅果實蠅B.rubigina （Wang & Zhao）、桔小實蠅B.dorsalis （Hendel）、番石榴實蠅B.correcta （Bezzi）、楊桃實蠅B.carambolae Drew & Hancock、辣椒實蠅B.latifrons （Hendel）、瓜實蠅B.cucurbitae （Coquillett）、南瓜實蠅B.tau （Walker）、顏帶實蠅B.cilifer （Hendel）、瘤脛實蠅B.tuberculata （Bezzi）、瑞麗果實蠅B.ruiliensis Wang，Long et Zhang，sp.nov.、滇寡鬃實蠅B.modica （Hardy）、黑膝實蠅B.scutellaris （Bezzi）、近黑顏實蠅B.parater （Zhao & Lin）、黑顏實蠅B.diaphora Coquillett、具條實蠅B.scutellata （Hendel）、腿端黑實蠅B.atrifemur Drew & Hancock、棗實蠅Carpomya vesuviana Costa、何氏華實蠅B.hochii （Zia）、五指山實蠅B.wuzhishana Lin et Yang，sp.nov、瓜棍腹實蠅Dacus longicornis Wiedemann 20種實蠅。蟲樣來自口岸進境果蔬檢疫截獲、中國邊境監(jiān)測調(diào)查的檢疫性實蠅種類。其中包括Bactrocera、Carpomya、Dacus 3個實蠅屬Bactrocera、Zeugodacus、Sinodacus、Asiadacus 4個果實蠅亞屬。用于分子生物學(xué)鑒定試驗的實蠅標(biāo)本，采用乙醇浸泡并放置冰箱保存。

1.2 DNA的提取和DNA質(zhì)量檢測

1.2.1 DNA的提取。

選用OMEGA E.Z.N.A.TM Insect DNA Kit試劑盒法，取整只實蠅或?qū)嵪売紫x、蛹或成蟲的翅膀、腿的部分組織，放置于2 mL離心管中，加入適量液氮后進行充分研磨，并按照試劑盒的操作步驟進行基因組DNA的提取。

1.2.2 DNA質(zhì)量檢測。

設(shè)置反應(yīng)體系和反應(yīng)條件，采用上游引物L(fēng)CO1490 （堿基序列為5′-GGTCAACAAATCATAAAGATATTG-3′）和下游引物HCO2198 （堿基序列為5′-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3′） 的1對通用引物對20種供試實蠅蟲樣提取的基因組DNA進行質(zhì)量檢測，在定量梯度PCR儀上進行PCR反應(yīng)，凝膠成像，查看目標(biāo)片段，拍攝記錄質(zhì)量檢測結(jié)果。

1.2.3 引物的設(shè)計。

利用通用引物L(fēng)CO1490 和HCO2198對提取的銹紅果實蠅的DNA進行擴增并測序，測序由上海英濰捷基貿(mào)易有限公司進行，擴增銹紅果實蠅的核酸序列：

5′-TTTTATTTTCGGAGCCTGAGCAGGAATAGTAGGAACTTC-

GCTTAGAATTTTAGTTCGAGCTGAACTAGGACACCCTGGAG-

CACTAATTGGAGATGATCAAATTTATAATGTAACTGTAACA-

GCTCATGCCTTTGTAATAATTTTCTTTATAGTAATACCTATCA-

TAATTGGTGGATTCGGAAATTGACTTGTTCCCCTAATATTAG-

GGGCCCCCGACATAGCATTTCCACGAATAAATAATATAAGA-

TTTTGACTATTGCCTCCTTCTCTCACGCTTCTATTAGTAAGAA-

GTCTAGTAGAAAATGGAGCTGGTACAGGTTGAACAGTTTAT-

CCTCCGCTATCATCTGTTATTGCTCACGGAGGAGCTTCAGT-

TGACCTAGCAATTTTCTCTCTTCACTTAGCAGGTATTTCCTC-

AATTTTAGGAGCGGTTAATTTTATTACAACAGTAATTAATAT-

ACGATCAACAGGAATTTCATTCGATCGAATACCTTTATTCGT-

TTGAGCAGTTGTATTAACAGCTCTTTTACTTTTATTATCATTA-

CCAGTTTTAGCAGGAGCTATTACTATATTATTAACAGATCGA-

AACTTAAACACTTCCTTTTTTGACCCTG-3′。

通過數(shù)據(jù)庫（NCBI）查找銹紅果實蠅在NCBI數(shù)據(jù)庫已登錄公布的序列，并進行比較分析，下載選定登錄號KF659744的FASTA格式，利用Primer-Premier 5.0人工設(shè)計引物和利用Oligo 6.44對引物進行比較分析和評價，再利用NCBI數(shù)據(jù)庫中提供的Primer-BLAST程序檢查同源序列，篩選目標(biāo)實蠅的種特異性引物。

1.2.4 引物的種特異性測試。

選用銹紅果實蠅為陽性對照，其余19種實蠅為陰性對照，驗證試驗所設(shè)計引物的種特異性。SS-PCR在定量梯度PCR儀上進行，反應(yīng)體系：2×EasyTaq PCR SuperMix 12.5 μL，引物各1.0 μL，取DNA模板各2.0 μL，加ddH2O至總體積25.0 μL;反應(yīng)條件為94 ℃/5 min，94 ℃/40 s，52 ℃/30 s，72 ℃/1 min，30個循環(huán)，最后延伸7 min;分別提取5 μL PCR產(chǎn)物在含DNA染色劑的1.5%瓊脂糖凝膠多功能電泳儀上電泳30 min（120 V），利用凝膠成像分析儀檢測是否擴增出預(yù)期大小的目標(biāo)片段，拍攝并記錄結(jié)果。

1.2.5 引物的靈敏度測試。采用核酸蛋白分析儀測試提取的銹紅果實蠅DNA模板的濃度。將銹紅果實蠅DNA模板按10-1、10-2、10-3倍梯度稀釋，然后使用種特異性引物XF29和XR293進行PCR擴增，來驗證該檢測方法的靈敏度。

1.2.6 應(yīng)用與驗證。

利用口岸截獲和我國邊境監(jiān)測的銹紅果實蠅（已飼養(yǎng)到成蟲并經(jīng)過形態(tài)鑒定）的卵、幼蟲、蛹和成蟲的部分組織提取的DNA為模板，使用種特異性引物XF29和XR293進行PCR擴增，采用SS-PCR快速鑒定銹紅果實蠅的方法來進行檢測試驗，應(yīng)用與驗證該方法的穩(wěn)定性與準(zhǔn)確性。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA 質(zhì)量檢測結(jié)果

利用通用引物L(fēng)CO1490和HC02198對提取的20種實蠅DNA模板進行PCR擴增，結(jié)果表明，該20種實蠅DNA均能擴增出一條單一且清晰長度約700 bp的目標(biāo)條帶（圖1）。

2.2 引物的選擇

通過篩選最終選擇的種特異性引物XF29和XR29 引物由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司合成，引物XF29序列為5′-GTAGGAACTTCGCTTAGAATTTTAG-3′;XR293 序列為 5′-GACTTCTTACTAATAGAAGCGTGA-3′。

2.3 引物的種特異性

通過引物的種特異性測試，結(jié)果顯示僅銹紅果實蠅約在265 bp擴增出有一條清晰且單一的條帶，其他試蠅種類均未出現(xiàn)任何條帶。該引物的種特異性試驗重復(fù)3次，結(jié)果均一致，表明該試驗篩選設(shè)計的種特異性引物XF29和XR293鑒定銹紅果實蠅具有較強的特異性及穩(wěn)定性（圖2）。

將試驗所得到的PCR產(chǎn)物送到英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司進行測序，將所得到的序列提交NCBI數(shù)據(jù)庫進行BLAST，結(jié)果表明該段序列與數(shù)據(jù)庫中的銹紅果實蠅序列具100%的一致性。

2.4 引物的靈敏度

采用核酸蛋白分析儀測試提取的銹紅果實蠅DNA模板的濃度為9.419 ng/μL。通過取3種不同濃度的DNA模板進行測定，結(jié)果表明，隨著DNA模板濃度的降低，擴增出的條帶逐漸減弱，在濃度稀釋至10-2倍后仍可見明顯的條帶，說明引物XF29和XR293具有較高的靈敏度（圖3）。

2.5 應(yīng)用與驗證

通過對19種銹紅果實蠅卵、幼蟲、蛹和成蟲的部分組織蟲樣的DNA模板進行種特異性測試驗證，均顯示出目標(biāo)條帶，結(jié)果表明分子生物學(xué)鑒定結(jié)果與形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果一致，該方法具有較好的穩(wěn)定性，可以應(yīng)用于銹紅果實蠅的實際鑒定工作（圖4）。

3 結(jié)論與討論

實蠅科昆蟲的種類多，分布廣，危害大[16]，部分種屬對果蔬生產(chǎn)具有重要的經(jīng)濟意義，尤其是在果蔬的進出境貿(mào)易中，疫情復(fù)雜，截獲實蠅的種類多，且均為不同蟲態(tài)的卵、幼蟲和蛹，由于實蠅科的卵、幼蟲和蛹形態(tài)極其相似，難以鑒別，若飼養(yǎng)到成蟲后，根據(jù)成蟲的形態(tài)特征進行分類鑒定，周期長，飼養(yǎng)條件受限，費時耗力，難以滿足進口果蔬的快速通關(guān)和果蔬的早期預(yù)警，所以獲得更多實蠅科昆蟲物種的線粒體基因組序列，開展不受蟲態(tài)限制的實蠅快速鑒定技術(shù)研究，顯得極為迫切。

該研究基于 mtDNA COI基因序列，并結(jié)合 NCBI中已公開的部分實蠅的 COI基因序列設(shè)計種特異性引物，以20種具有重要經(jīng)濟意義的實蠅作對照，測試并建立了銹紅果實蠅的種特異性引物快速鑒定方法，以滿足口岸進出境高通量、及時、快速、準(zhǔn)確檢疫鑒定實蠅物種的需求[17-18]。該方法也為有效防止銹紅果實蠅的入侵和局部發(fā)生以及物種的進一步傳播擴散、保護果蔬的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)安全、維護國家對外貿(mào)易信譽等提供了技術(shù)支撐[19]。

該試驗所建立的SS-PCR快速鑒定銹紅果實蠅的方法，可以在8 h之內(nèi)完成銹紅果實蠅的物種鑒定，該方法具有快速簡便、可操作性強、特異性和靈敏度高等優(yōu)點，能夠滿足口岸快速通關(guān)、早期預(yù)警等檢疫的要求。

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