OPN/IGF1促進小鼠皮質(zhì)脊髓束軸突再生的作用及機制研究

張倩，張坤，張增強，李劍勇，崔芳*

1解放軍總醫(yī)院海南醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，海南三亞 572013；2空軍軍醫(yī)大學神經(jīng)生物學教研室，西安 710032

脊髓損傷(spinal cord injury，SCI)及腦卒中后自發(fā)性運動功能恢復有限，主要原因是中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system，CNS)神經(jīng)元損傷后很難再生[1-2]，尤其是皮質(zhì)脊髓束(corticospinal tract，CST)幾乎無再生潛能[3-4]。SCI后有限的功能恢復主要依賴于CST發(fā)芽[5]，大量研究證實，通過調(diào)控相關(guān)分子的表達增加神經(jīng)元的內(nèi)在再生潛能，從而促進CST再生，有助于損傷后運動功能的恢復[6]。SCI后運動功能恢復通常依賴以下兩種方式：損傷后CST再生穿過損傷部位，或未損傷的軸突代償性發(fā)芽，與中間神經(jīng)元建立聯(lián)系間接支配失神經(jīng)的肌肉。鑒于CNS神經(jīng)元再生能力弱，損傷后的軸突無法重建原始回路，能取得的功能恢復有限[7-8]，如何增加CST的發(fā)芽以促進功能恢復是目前迫切需要解決的難題。最近，在小鼠脊髓半切和腦卒中模型中的研究顯示，信號分子骨橋蛋白(osteopontin，OPN)可增加神經(jīng)元對胰島素樣生長因子1(insulinlike growth factor 1，IGF1)的敏感性，進而促進CST再生和發(fā)芽[9]。本研究采用小鼠單側(cè)錐體束橫斷模型研究OPN/IGF1促進軸突發(fā)芽的分子機制，以期尋找促進CNS損傷后軸突再生的方法。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 兔抗小鼠紅色熒光蛋白(red fluorescent protein，RFP)多克隆抗體(ab34771，英國Abcam公司)；兔抗脊髓蛋白激酶Cγ(protein kinase Cγ，PKCγ)多克隆抗體(sc211)、兔抗小鼠胰島素樣生長因子受體(insulin-like growth factor receptor，IGFR)單克隆抗體(sc-712)(美國Santa Cruz公司)；兔抗小鼠核糖體蛋白S6激酶(ribosomal protein S6 kinase，pS6)單克隆抗體(4857，美國Cell Signaling Technology 公司)；神經(jīng)元核抗原(neuronal nuclei antigen，NeuN)小鼠單克隆抗體(MAB377，美國Millipore公司)；Alexa FlourR647 標記的山羊抗小鼠IgG(A-21236，美國ThermoFisher Scientific公司)；Alexa FlourR405 標記的山羊抗兔IgG(A31556，美國Invitrogen公司)；Alexa Fluor 594標記的山羊抗兔IgG(A-11012，美國Life Technology公司)。病毒：AAV-IGF1，AAV-OPN，AAV-胎盤堿性磷酸酶(placental alkaline phosphatase，PLAP)，AAV-ChR2-mCherry(紅色熒光蛋白，波士頓兒童醫(yī)院，viral core)。4,6-二脒基-2-苯基吲哚(4,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI，28718-90-3，美國Sigma公司)，糖丸(F0071，日本Bio-Serv公司)；意大利面(pasta)；氯胺酮(美國Hospira公司)；賽拉嗪(美國AnaSed公司)。冰凍切片機(德國Leica CM3050S)；微量注射器(UMC4 Micro4TMController)；小鼠立體定位儀(美國Stoelting公司)；共聚焦顯微鏡(Zeiss 700和Zeiss 710，日本)；高速攝像機(Hotshot e64)；不規(guī)則水平梯；糖丸抓取箱。

1.2 實驗動物及分組 6～8周齡C57BL/6野生型小鼠28只，雌雄不限，體重25～30 g，購自美國Charles River公司。所有實驗程序均按照波士頓兒童醫(yī)院動物使用委員會批準的動物規(guī)程(17-05-3451R，Boston Children's Hospital)進行，審批號17-05-3451R。28只小鼠按照隨機分配原則均分為實驗組與對照組。實驗組：單側(cè)錐體束切斷，對側(cè)皮質(zhì)給予AAV-OPN/IGF1和AAV-mCherry注射；對照組：單側(cè)錐體束切斷，對側(cè)皮質(zhì)給予AAV-PLAP和AAVmCherry注射。結(jié)合PKCγ免疫組化染色結(jié)果，去除CST殘余超過80%的小鼠，最終實驗組入組10只，對照組入組8只。各項行為學檢測采取錄像及雙盲方法，實驗過程符合國家及單位實驗動物管理和使用的相關(guān)規(guī)定。

1.3 方法

1.3.1 單側(cè)錐體束橫斷術(shù) 氯胺酮(100 mg/kg)聯(lián)合賽拉嗪(10 mg/kg)麻醉小鼠后，俯臥位固定于離體定位儀上，在相應顱骨上以(±1.5，0)為中心打開顱骨(長4 mm，寬2 mm)，實驗組給予AAV-IGF1+AAVOPN+AAV-ChR2-mCherry病毒注射，對照組給予AAVPLAP+AAV-ChR2-mCherry病毒注射，病毒濃度調(diào)至(0.5～5)×1013拷貝/ml。注射坐標位分別為：(±1.3，1.0)(±1.3，0.5)(±1.3，0) (±1.3，–0.5) (±1.3，–1.0)(±1.3，–1.5)，每個點注射200 μl。病毒注射皮質(zhì)是控制小鼠抓取糖丸的上肢對側(cè)皮質(zhì)(不同小鼠抓取糖丸的優(yōu)勢上肢不同)。病毒注射后1周，再次麻醉小鼠，仰臥位固定，沿氣管一側(cè)切開皮膚，鈍性分離肌肉，暴露顱底，咬骨鉗打開枕骨，暴露延髓，用手術(shù)刀在錐體交叉以上橫斷一側(cè)錐體束(控制小鼠抓取糖丸的優(yōu)勢一側(cè))，逐層縫合肌肉和皮膚。術(shù)后每2周進行行為學檢測。

1.3.2 不規(guī)則水平梯測試 術(shù)前2周，水平梯訓練小鼠行走，用高速攝像機(Hotshot e64)錄像，使錯誤率達到20%左右，表明訓練成功。結(jié)果判斷：小鼠前掌正中央放在小鋼柱上，且足趾抓牢為正確，其余均為錯誤。

1.3.3 糖丸抓取測試 小鼠提前禁食18 h，放置于特制透明裝置內(nèi)(203.00 cm×153.00 cm×8.53.00 cm)，正前方有一個寬0.53 cm、高133.00 cm 的開口，外加一個可以放置糖丸的平臺，20 min內(nèi)放置40個糖丸，小鼠用優(yōu)勢上肢抓取糖丸計為成功，統(tǒng)計成功率(剔除無抓取糖丸意識或用舌頭取糖丸的小鼠)。

1.3.4 握食意大利面測試 將意大利面裁剪成長度為1.5 cm，禁食18 h的小鼠適應環(huán)境后，給予一根1.5 cm的意大利面，記錄進食完整意大利面的時間。

1.3.5 免疫組化染色 給予小鼠過量麻醉藥后，用4%多聚甲醛固定取材，30%蔗糖溶液脫水24 h后，用組織包埋劑包被組織，冷凍切片(頸段脊髓40 μm，腦組織60 μm)，用10%山羊血清+0.5%Triton-100溶液室溫下孵育2 h，一抗兔抗PKCγ多克隆抗體(1:100)、兔抗小鼠RFP多克隆抗體(1:400)、兔抗小鼠IGFR單克隆抗體(1:200)、兔抗小鼠pS6單克隆抗體(1:200)、NeuN小鼠單克隆抗體(1:150)4 ℃條件下孵育過夜，對應的二抗(1:1000)室溫下孵育2 h，DAPI(1:5000)室溫下孵育10 min。共聚焦顯微鏡在同一條件下采集圖像，采用Image J軟件選取不同區(qū)域NeuN陽性細胞，統(tǒng)計pS6、IGFR熒光強度，取平均值。分析至少統(tǒng)計3套切片。

1.3.6 發(fā)芽軸突數(shù)量統(tǒng)計 采用PKCγ免疫組化染色判斷皮質(zhì)脊髓束橫斷情況；錐體束橫斷術(shù)后12周，將脊髓切片按上述方法進行RFP免疫組化染色。通過脊髓中央導水管及灰質(zhì)邊緣畫一水平線，采用3條垂直線Mid、Z1、Z2把軸突損傷側(cè)脊髓灰質(zhì)的水平線分為3等份，計算通過3條垂直線的軸突數(shù)量，得到的數(shù)值除以每只小鼠在延髓處(錐體交叉以上)標記的軸突數(shù)量(至少選取2套切片，每套計算4個10 000 μm2/個范圍內(nèi)標記到的軸突數(shù)量)。

1.4 統(tǒng)計學處理 采用GraphPad 5.0和SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料采用表示，運動行為學分析采用Two-way ANOVA方法，軸突發(fā)芽數(shù)量和神經(jīng)元熒光強度的比較采用獨立樣本t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 OPN/IGF1對單側(cè)錐體束橫斷術(shù)后小鼠運動功能恢復的影響 單側(cè)錐體束橫斷術(shù)后不同時間，采用運動行為學方法評估小鼠運動行為學的恢復情況，結(jié)果顯示：在不規(guī)則水平梯中，術(shù)后第2周以后，對照組神經(jīng)損傷側(cè)的錯誤率高于實驗組，并且持續(xù)到術(shù)后12周，但兩者之間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；錐體束切斷術(shù)前及術(shù)后，實驗組及對照組神經(jīng)未損傷側(cè)錯誤率在不同時間點之間均未見明顯差異，損傷后相同時間點實驗組與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05，圖1A)。在糖丸抓取行為學測試中，實驗組與對照組成功率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05，圖1B)；在握食意大利面行為學測試中，兩組動物完成任務的時間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05，圖1C)。

圖1 單側(cè)錐體束橫斷術(shù)后小鼠運動行為學檢測Fig.1 Behavioral tests of mice after unilateral pyramidotomy

2.2 OPN/IGF1對單側(cè)錐體束橫斷術(shù)后CST軸突代償性發(fā)芽的促進作用 RFP染色結(jié)果顯示，實驗組未損傷側(cè)軸突向損傷側(cè)發(fā)芽明顯多于對照組(圖2A)；統(tǒng)計通過Mid、Z1、Z2三條垂直線的軸突數(shù)量(圖2B)，實驗組通過Mid、Z1、Z2發(fā)芽軸突數(shù)量明顯多于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖2C)。

圖2 單側(cè)錐體束橫斷術(shù)后小鼠未損傷側(cè)軸突向?qū)?cè)發(fā)芽情況Fig.2 Axon sprouted to the contralateral side in mice after unilateral pyramidotomy

2.3 OPN/IGF1通過增加神經(jīng)元IGFR的表達促進軸突再生 對神經(jīng)元pS6熒光強度進行統(tǒng)計學分析，結(jié)果顯示，實驗組pS6表達明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖3A)，表明皮質(zhì)注射AAVOPN/IGF1可促進神經(jīng)元高表達pS6。對神經(jīng)元IGFR熒光強度進行統(tǒng)計學分析，結(jié)果顯示，實驗組IGFR表達明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖3B)，顯示皮質(zhì)注射AAV-OPN/IGF1可促進神經(jīng)元IGFR的表達。

圖3 單側(cè)錐體束橫斷術(shù)后小鼠神經(jīng)元pS6(A)及IGFR(B)的表達(n=6，bar=20 μm)Fig.3 Expressions of neuronal pS6 and IGFR in mice after unilateral pyramidotomy

3 討 論

研究發(fā)現(xiàn)，敲除人類第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源的基因(phosphatase and tension homologue deleted from chromosome10，PTEN)，能夠增加CNS神經(jīng)元再生潛能[3,10]，PTEN基因敲除后，通過調(diào)節(jié)雷帕霉素靶蛋白(mechanistic target of rapamycin，mTOR)表達促進軸突再生，但作為抑癌基因PTEN不適用于臨床應用。進一步研究發(fā)現(xiàn)，PTEN可通過抑制OPN的表達影響mTOR，而OPN存在于各種組織細胞中，把OPN作為調(diào)節(jié)靶點成為研究熱點。在小鼠視神經(jīng)橫斷模型中，促進視神經(jīng)節(jié)細胞高表達OPN、IGF1或腦源性神經(jīng)生長因子(brain derived neurotrophic factor，BDNF)可促進軸突再生，使小鼠恢復部分視力[8,11]。體外培養(yǎng)神經(jīng)元時給予IGF1或BDNF，可促進其軸突再生[12-14]，但在體內(nèi)實驗中，僅給予IGF1或BDNF并不能有效促進CST再生[15]，可能是由于成熟神經(jīng)元對神經(jīng)生長因子的反應性降低。因此，探尋有效的措施來增加成熟神經(jīng)元對神經(jīng)生長因子的敏感性，可能更有利于軸突再生。

SCI后通過中和外源性的抑制分子、增強神經(jīng)元活性，可以促進CST再生，恢復部分運動功能[7,16]。軸突損傷后，主要通過兩種方式再生：被橫斷的軸突再生越過損傷區(qū)；未損傷的軸突發(fā)芽，與中間神經(jīng)元建立聯(lián)系[17]。因局部環(huán)境中的抑制分子以及瘢痕形成，損傷后的軸突很難穿越損傷區(qū)；通過去除抑制分子、增強神經(jīng)元的再生潛能，可以促進未損傷CST代償性發(fā)芽，從而有利于SCI后運動功能的恢復[8-9,18-19]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠T10半切模型和腦卒中模型中，OPN/IGF1可促進軸突的再生和發(fā)芽，進而促進運動功能的恢復[9]，但在單側(cè)錐體束橫斷模型中是否具有同樣的效果尚不清楚。單側(cè)錐體束橫斷術(shù)主要對前肢的運動功能造成影響，尤其是前肢抓握功能[6,20-21]。因此，本研究選擇不規(guī)則步行梯、抓取糖丸和握食意大利面測試來評估小鼠運動功能的恢復情況。

在單側(cè)錐體束橫斷模型中，本研究結(jié)果顯示OPN/IGF1可促進未損傷CST的發(fā)芽(圖2)，但實驗組與對照組小鼠運動功能恢復情況并無明顯差異(圖1)。推測可能的原因有兩種：第一，發(fā)芽的軸突尚未與損傷側(cè)神經(jīng)元建立有效的聯(lián)系，不能發(fā)揮其調(diào)節(jié)運動功能恢復的作用；第二，因錐體束橫斷術(shù)手術(shù)難度大，模型制作過程中可能存在誤差，不能完全橫斷所有錐體束，或切的過深加重損傷，均可能對動物運動行為學的觀察造成影響，增加實驗誤差，導致兩組動物行為學無差異。

有研究發(fā)現(xiàn)，體外培養(yǎng)原代神經(jīng)元時，給予IGF1可以促進軸突生長[14]。但體內(nèi)實驗采用小鼠腦卒中模型，單獨給予IGF1不能促進損傷后軸突再生[15]。本研究顯示，成熟神經(jīng)元和未成熟神經(jīng)元對神經(jīng)營養(yǎng)因子的反應不同，單獨應用IGF1或者OPN并不能增加IGFR的表達進而促進軸突再生，而聯(lián)合應用IGF1和OPN可增加神經(jīng)元IGFR和pS6的表達[9]。OPN可以提高神經(jīng)元對IGF1的反應，OPN作為可溶性的蛋白信號分子，作用于細胞表面，通過增加神經(jīng)元IGFR的表達促進軸突再生(圖4)。OPN可通過整合素(integrins)和CD44作用于不同類型的細胞，在皮膚細胞和免疫細胞中，IGFR和整合素均與細胞表面脂蛋白相互連接，向細胞內(nèi)傳遞信號[22-23]?；谝陨涎芯拷Y(jié)果，推測OPN可能通過整合細胞表面的IGFR調(diào)節(jié)相關(guān)信號通路，進而促進軸突再生。

綜上所述，本研究通過神經(jīng)元高表達OPN/IGF1增加了神經(jīng)細胞的再生潛能，促進了CST再生，而OPN、IGF1作為可溶性蛋白[9]，用于CNS損傷后修復，具有很高的轉(zhuǎn)化醫(yī)學價值，該研究結(jié)果為今后臨床應用OPN、IGF1治療SCI及腦卒中提供了實驗依據(jù)。