lncRNA-ATB、miR-34a和miR-145在高齡肺腺癌患者癌組織中的表達(dá)水平及臨床價(jià)值

袁 旦，邰 萍

江蘇省南京市第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇南京 210000

肺癌作為目前發(fā)病率最高的一種惡性腫瘤，是造成癌癥病死率居高不下的重要原因，且發(fā)病率呈逐年上升趨勢，大部分發(fā)病人群為中老年患者，肺腺癌是非小細(xì)胞肺癌的常見類型之一。近年來，微創(chuàng)外科技術(shù)在惡性腫瘤的治療中得到廣泛應(yīng)用和發(fā)展，已經(jīng)成為肺腺癌的重要治療手段，但患者術(shù)后預(yù)后評(píng)價(jià)指標(biāo)仍需要進(jìn)一步探索[1]。長鏈非編碼RNA(lncRNA)是一種不具備蛋白質(zhì)編碼功能的RNA，一般由200個(gè)以上核苷酸組成?，F(xiàn)有研究證實(shí)，人體95%左右的RNA是不編碼功能蛋白的，但很大一部分lncRNA在基因表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮重要作用，其可以作為基因調(diào)控的一種上游分子，能夠從轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控、表觀遺傳學(xué)等方面調(diào)節(jié)基因表達(dá)過程[2]。微小RNA(miRNA)是生物體內(nèi)廣泛存在的一類內(nèi)源性且高度保守的非編碼單鏈RNA，可以參與生物體細(xì)胞的增殖、分化、凋亡、免疫、代謝及炎性反應(yīng)等重要生理過程[3]。miR-34a是一類具有顯著抑癌作用的高度保守miRNA，可通過與相關(guān)癌基因結(jié)合使得癌細(xì)胞周期G1期發(fā)生停滯，從而抑制癌細(xì)胞的增長并促使其凋亡。miR-145是位于人體5號(hào)染色體的另一種miRNA，可通過有效調(diào)控下游靶基因表達(dá)情況抑制腫瘤細(xì)胞增殖、分化，且在乳腺癌、肺癌、腸癌等多種惡性腫瘤中發(fā)揮重要作用[4]。本研究通過檢測肺腺癌患者癌組織中被轉(zhuǎn)化生長因子β激活的長鏈非編碼RNA(lncRNA-ATB)、miR-34a和miR-145表達(dá)水平并探討其與患者預(yù)后之間的關(guān)系，以期為臨床提供依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2014年8月至2016年8月在本院治療的112例高齡肺腺癌患者為研究對象，患者年齡70～85歲，平均(76.41±2.68)歲，其中男64例，女48例，吸煙和非吸煙患者各55、57例，TNM分期為Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期的患者分別為57、50、5例。納入標(biāo)準(zhǔn)[5]：(1)所有患者經(jīng)組織病理檢查確診為肺腺癌；(2)患者年齡不低于70周歲；(3)患者未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；(4)患者入組前未接受過其他胸部手術(shù)或化療；(5)患者無放療禁忌證且可以耐受手術(shù)。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)心、肝、腎功能嚴(yán)重異常者；(2)術(shù)前經(jīng)過新輔助化療者；(3)合并有嚴(yán)重感染、凝血功能障礙等疾病者；(4)無法完成隨訪者。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者均簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1臨床資料收集 收集并記錄入選患者入院時(shí)的年齡、性別、TNM分期、病理分級(jí)以及影像學(xué)檢查等臨床資料，并以總生存率(OS)作為肺腺癌患者術(shù)后生存情況的評(píng)價(jià)指標(biāo)。

1.2.2lncRNA-ATB、miR-34a和miR-145表達(dá)水平測定 手術(shù)過程中獲得所有患者癌組織和癌旁組織，并立刻置于-80 °C液氮中保存；統(tǒng)一取出癌組織和癌旁組織并加入TRIzol試劑(Invitrogen 公司)將細(xì)胞完全裂解，并于室溫條件下靜置5 min，然后加入氯仿200 μL于裂解后細(xì)胞中，渦旋20 s后再于室溫條件下靜置5 min。取靜置后樣品放入離心機(jī)中，在12 000 r/min條件下離心15 min，將上清液轉(zhuǎn)移于EP管中并加入異丙醇0.5 mL，混勻并于室溫條件下靜置10 min。使用Prime Script RT reagent Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒(賽默飛世爾中國公司)將總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，從肺腺癌組織或癌旁組織中提取總RNA，分別得到模板單鏈cDNA，以18S rRNA作為內(nèi)參，使用PCR試劑盒(北京康為世紀(jì)公司)對cDNA進(jìn)行PCR。18S rRNA上、下游引物分別為5′-ACACGGACAGGATTGACAGA-3′、5′-GGACATCTAAGG GCATCACA-3′。lncRNA-ATB的上、下游引物分別為5′-TGACAAAGGCAG-GAGGTA-3′、5′-ATCTCTGGGTGCTGGTGAAGG-3′。miR-34a qRT-PCR擴(kuò)增以U6作為對照基因，miR-34a上下游引物分別為5′-TGGCAGTGTCTTAGCTGGTTG-3′、5′-GCGAGCACAGAATTAATACGAC-3′；U6基因上下游引物分別為5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′、5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。miR-145 qRT-PCR擴(kuò)增也以U6作為對照基因，上、下游引物分別為 5′-TCGGTCCAGTTTTCCCAG-3′、5′-AGTGCGTGTCGTGGAGTC-3′；U6基因上、下游引物分別為5′-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3′、5′-GGAACGCTTCACGAATTTG-3′，lncRNA-ATB、miR-34a和miR-145、U6引物均由金斯瑞生物有限公司合成。最后采用2-ΔΔct計(jì)算組織中l(wèi)ncRNA-ATB、miR-34a和miR-145相對表達(dá)量(RQ)，并分別根據(jù)lncRNA-ATB、miR-34a和miR-145的RQ中位值將患者分為高、低表達(dá)組各56例。

1.3隨訪 所有患者隨訪時(shí)間為10～50個(gè)月，中位隨訪時(shí)間22.3個(gè)月，隨訪截止時(shí)間為2020年1月31日。每3個(gè)月隨訪1次，檢查內(nèi)容包括患者腫瘤標(biāo)志物、胸部 B 超以及CT，同時(shí)每年進(jìn)行頭顱磁共振成像(MRI)以及骨掃描檢查。

2 結(jié) 果

2.1癌組織及癌旁組織中l(wèi)ncRNA-ATB、miR-34a和miR-145表達(dá)水平比較 癌組織中l(wèi)ncRNA-ATB表達(dá)水平顯著高于癌旁組織，miR-34a和miR-145表達(dá)水平顯著低于癌旁組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 癌組織及癌旁組織中l(wèi)ncRNA-ATB、miR-34a和miR-145表達(dá)水平比較

2.2lncRNA-ATB、miR-34a和miR-145不同表達(dá)水平患者術(shù)后生存情況比較 所有患者均順利完成手術(shù)，圍術(shù)期無死亡病例，截止至隨訪結(jié)束，共有24例患者死亡，所有患者的3年OS為78.57%。其中l(wèi)ncRNA-ATB高表達(dá)組死亡16例，3年OS為71.43%，低表達(dá)組死亡8例，3年OS為85.71%；miR-34a高表達(dá)組死亡5例，3年OS為91.07%，低表達(dá)組死亡19例，3年OS為66.07%；miR-145高表達(dá)組死亡6例，3年OS為89.29%，低表達(dá)組死亡18例，3年OS為67.86%。Log-rank檢驗(yàn)顯示，各指標(biāo)高、低表達(dá)患者的OS比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1～3。

圖1 lncRNA-ATB高、低表達(dá)組患者生存曲線圖

2.3影響患者預(yù)后的單因素和多因素Cox分析 對影響患者預(yù)后的因素進(jìn)行單因素分析，并將差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的因素作為自變量進(jìn)行Cox多因素分析，以患者生存情況(賦值：死亡=1，生存=0)為因變量，Cox多因素分析結(jié)果顯示，腫瘤TNM分期升高、發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和胸膜侵犯、lncRNA-ATB高表達(dá)以及miR-34a、miR-145低表達(dá)是影響患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05)。見表2。

圖2 miR-34a高、低表達(dá)組患者生存曲線圖

圖3 miR-145高、低表達(dá)組患者生存曲線圖

表2 預(yù)后影響因素的單因素和多因素Cox回歸分析

續(xù)表2 預(yù)后影響因素的單因素和多因素Cox回歸分析

3 討 論

肺癌的發(fā)病率和病死率在眾多惡性腫瘤中居首位，且在肺癌的發(fā)生發(fā)展過程中常伴隨多種調(diào)控因子的作用，故研究多種調(diào)控因子在肺癌患者中的表達(dá)水平差異，探討其對疾病發(fā)展機(jī)制和預(yù)后的影響具有重要的臨床意義。lncRNA作為一種長度為200個(gè)核苷酸以上的非編碼RNA分子，其一級(jí)結(jié)構(gòu)類似于核苷酸排列順序，以往研究誤認(rèn)為lncRNA屬于基因的“轉(zhuǎn)錄噪音”[6]。隨著研究深入，發(fā)現(xiàn)lncRNA占哺乳動(dòng)物基因組序列中轉(zhuǎn)錄本的10%左右，相較于產(chǎn)生的1%編碼蛋白轉(zhuǎn)錄本更多，甚至具有較強(qiáng)的細(xì)胞或者組織特異性[7]。研究證實(shí)，lncRNA不僅直接調(diào)控靶基因轉(zhuǎn)錄以及翻譯過程，還可間接調(diào)控靶基因的上下游基因，其在基因重組、細(xì)胞周期調(diào)控、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄和翻譯等多種生理過程中發(fā)揮重要的作用，與機(jī)體細(xì)胞生長、分化、凋亡等重要過程以及一些惡性腫瘤關(guān)系密切，為肺癌等惡性腫瘤的發(fā)生機(jī)制研究提供了重要方向[8]。lncRNA-ATB作為一種新發(fā)現(xiàn)的lncRNA，許多研究均證實(shí)其在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，且與患者預(yù)后顯著相關(guān)[9-12]。丁如良等[9]研究結(jié)果顯示，結(jié)直腸癌患者的癌組織和血清中l(wèi)ncRNA-ATB過度表達(dá)，且患者的病灶大小、是否發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及胸膜侵犯都會(huì)影響lncRNA-ATB的表達(dá)水平。預(yù)后研究顯示lncRNA-ATB呈過度表達(dá)的患者預(yù)后更差，中位生存期更短[10]。本研究結(jié)果顯示，肺腺癌患者癌組織lncRNA-ATB表達(dá)水平高于癌旁組織，與上述研究結(jié)論一致，提示lncRNA-ATB在肺腺癌等惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中扮演癌基因角色。多因素分析顯示，除腫瘤TNM分期、是否發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和胸膜侵犯外，lncRNA-ATB表達(dá)水平也與患者預(yù)后有關(guān)。推測lncRNA-ATB表達(dá)水平可能與肺腺癌惡性程度以及轉(zhuǎn)移情況存在密切聯(lián)系，提示lncRNA-ATB可能在肺腺癌的病情進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。WANG等[11]研究結(jié)果證實(shí)，lncRNA-ATB參與了惡性腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移級(jí)聯(lián)反應(yīng)，并對該過程具有一定促進(jìn)作用。SONG等[12]研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA-ATB能夠通過上調(diào)E盒結(jié)合鋅指蛋白1(ZEB1)和鋅指蛋白(ZNF)-217的表達(dá)水平以誘導(dǎo)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，從而進(jìn)一步促進(jìn)乳腺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移，故推測lncRNA-ATB可能是通過上述途徑促進(jìn)肺腺癌的擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移，從而影響患者術(shù)后生存情況，與本研究結(jié)果相符。

隨著人們對miRNA在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的作用機(jī)制的深入了解，miRNA在惡性腫瘤治療中的重要作用逐漸被揭示，不僅可以將其作為惡性腫瘤早期診斷和預(yù)后預(yù)測的一種生物標(biāo)志物，miRNA還有望成為治療腫瘤的一種新型藥物。miRNA是一種由20～25個(gè)核苷酸組成的人體內(nèi)源性非編碼小分子RNA，可參與調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育、細(xì)胞分化凋亡等多種生物學(xué)過程。其可以與靶基因信使RNA(mRNA)之間發(fā)生相互作用，抑制轉(zhuǎn)錄后翻譯過程，從而對靶基因產(chǎn)生負(fù)性調(diào)控并降低相關(guān)蛋白表達(dá)量。miRNA對于惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有重要作用，扮演著癌基因或抑癌基因的角色[13]。miR-34a和miR-145能影響細(xì)胞周期以及染色體結(jié)構(gòu)形成，已有研究證實(shí)，miR-34a和miR-145可以抑制多種惡性腫瘤細(xì)胞的增殖[14]。彭淑賢等[15]研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，肺腺癌患者癌組織中miR-34a表達(dá)水平顯著低于癌旁組織和正常組織，且在癌組織、癌旁組織、正常組織中呈依次升高趨勢；王瑞娟[16]研究結(jié)果顯示，肺腺癌組織中miR-145異常低表達(dá)，且隨著腫瘤病理分級(jí)越高、腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移程度越高，患者的miR-145表達(dá)水平越低。說明miR-34a和miR-145表達(dá)水平可以作為肺腺癌患者病情嚴(yán)重程度的監(jiān)測指標(biāo)。本研究結(jié)果顯示，肺腺癌組織miR-34a和miR-145表達(dá)水平低于癌旁組織，且miR-34a、miR-145低表達(dá)與患者預(yù)后相關(guān)，提示miR-34a、miR-145可能均屬于抑癌基因。段亞男等[17]研究證實(shí)miR-145可以靶向調(diào)控結(jié)締組織生長因子(CTGF)表達(dá)水平以發(fā)揮肺腺癌病情調(diào)控作用，CTGF是由多種細(xì)胞分泌合成的具有參與和調(diào)控細(xì)胞有絲分裂、增殖以及黏附過程的細(xì)胞因子，同時(shí)CTGF能夠影響新生血管生成以及腫瘤發(fā)生發(fā)展過程，其在肝癌等多種惡性腫瘤中呈顯著低表達(dá)。因此，可以將血清miR-145作為惡性腫瘤侵襲潛能以及預(yù)后預(yù)測的重要生物學(xué)指標(biāo)。許晶晶等[18]報(bào)道m(xù)iR-34a的目的調(diào)控mRNA是c-myc蛋白，c-myc是一種可以有效促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)入DNA合成期以快速完成DNA合成與復(fù)制的特殊蛋白，因此可以將c-myc的高度表達(dá)作為腫瘤發(fā)生或發(fā)展的重要信息。而人體正常組織和細(xì)胞中的miR-34a能與c-myc特異性結(jié)合導(dǎo)致c-myc蛋白表達(dá)降低，產(chǎn)生明顯抑癌作用。

綜上所述，lncRNA-ATB在高齡肺腺癌患者癌組織中呈高表達(dá)，miR-34a、 miR-145在高齡肺腺癌患者癌組織中呈低表達(dá)，且lncRNA-ATB高表達(dá)，miR-34a、miR-145低表達(dá)是影響患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。