• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    miR-663調(diào)控MMP11對(duì)妊娠滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲和遷移的影響

    2021-11-26 07:29:38段昆茂王世芳陳周紅
    關(guān)鍵詞:滋養(yǎng)層熒光素酶子癇

    段昆茂,王世芳△,陳周紅

    1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院綦江醫(yī)院產(chǎn)科,重慶 401420; 2.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院婦產(chǎn)科,重慶 401120

    子癇前期是妊娠期高血壓疾病的一種特殊類(lèi)型,一般表現(xiàn)為妊娠女性在妊娠20周以后出現(xiàn)水腫、蛋白尿、高血壓,在分娩以后血壓恢復(fù)正常[1]。目前尚不清楚子癇前期的具體發(fā)病機(jī)制和病因,已知滋養(yǎng)層細(xì)胞是胎盤(pán)的主要組成部分,在胎盤(pán)形成和胎兒正常發(fā)育過(guò)程中具有重要作用,滋養(yǎng)層細(xì)胞侵入子宮螺旋動(dòng)脈受限和過(guò)淺均可能夠誘導(dǎo)子癇前期的發(fā)生,改善滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲和遷移能力可能是抑制子癇前期的重要步驟[2]。微小RNA(miRNA)是一類(lèi)沒(méi)有編碼蛋白質(zhì)功能的RNA,可以通過(guò)與靶基因的3端非翻譯區(qū)(3′UTR)結(jié)合影響蛋白翻譯[3]。miRNA的功能很多,如調(diào)控細(xì)胞分化、凋亡、炎癥、衰老、氧化損傷、增殖等,還與很多疾病的發(fā)生有關(guān)[4]。既往研究顯示,子癇前期患者胎盤(pán)組織中miRNA表達(dá)異常,且影響滋養(yǎng)層細(xì)胞的功能[5]。miR-663是與腫瘤有關(guān)的調(diào)控因子,還與鼻息肉的產(chǎn)生、燙傷修復(fù)等過(guò)程密切相關(guān)[6-8]。研究顯示,miR-663在子癇前期患者中高表達(dá)[9]。目前尚不清楚miR-663在妊娠滋養(yǎng)層細(xì)胞遷移和侵襲中的作用。前期的預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),miR-663和基質(zhì)金屬蛋白酶11(MMP11)的3′UTR端有互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn),MMP11是基質(zhì)金屬蛋白酶家族成員,在細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、侵襲過(guò)程中發(fā)揮促進(jìn)作用[10]。本研究通過(guò)探討miR-663調(diào)控MMP11對(duì)妊娠滋養(yǎng)層細(xì)胞遷移和侵襲的影響及機(jī)制,以期為改善子癇前期的預(yù)后提供方向。

    1 資料與方法

    1.1一般資料 收集2018年7月至2020年7月重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院綦江醫(yī)院收治的妊娠期子癇前期患者行剖宮產(chǎn)留取的胎盤(pán)組織19例,同時(shí)收集健康妊娠女性行剖宮產(chǎn)留取的胎盤(pán)組織19例(對(duì)照組織)。

    1.2方法

    1.2.1實(shí)驗(yàn)細(xì)胞與試劑 妊娠滋養(yǎng)層JEG-3細(xì)胞購(gòu)自上海通派生物科技有限公司;DMEM培養(yǎng)液、CCK-8、二喹啉甲酸(BCA)蛋白檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司;miR-663 模擬物(mimics)和抑制劑(anti-miR-663)、模擬對(duì)照序列(miR-NC)及抑制劑對(duì)照序列(anti-miR-NC)由上海安必奇生物科技有限公司構(gòu)建;MMP11過(guò)表達(dá)載體及其小干擾RNA(si-MMP11)、空載體(vector)、小干擾RNA陰性對(duì)照(si-NC)、MMP11野生型(WT)和突變型(MUT)熒光素酶報(bào)告載體均由湖南豐暉生物科技有限公司構(gòu)建;MMP11、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體購(gòu)自上海齊一生物科技有限公司。

    1.2.2miR-663和MMP11 mRNA表達(dá)水平檢測(cè) 采用qRT-PCR檢測(cè)miR-663和MMP11 mRNA表達(dá)水平。采用Trizol試劑提取子癇前期患者胎盤(pán)組織和對(duì)照組織中的總RNA,利用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA水平和純度。然后利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,以cDNA為模板,行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)參數(shù)為:95 ℃預(yù)變性60 s;95 ℃變性30 s,60 ℃退火30 s,68 ℃延伸30 s,共40個(gè)循環(huán)。利用2-△△Ct法分析目的基因的表達(dá)變化,miR-663內(nèi)參為U6,MMP11 mRNA內(nèi)參為GAPDH。PCR引物為:U6上游引物5′-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3′,下游引物5′-GGAACGCTTCACGAATTTA-3′;miR-663上游引物5′-GTGCGTGTCGTGGAGTCG-3′,下游引物5′-TTTAGGCGGGGCG-3′;MMP11上游引物5′-TTCTACACCTTCCGCTACC-3′,下游引物5′-GGACTGGCTTCTCACCATCATAT-3′;GAPDH上游引物5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′,下游引物5′-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3′。

    1.2.3細(xì)胞培養(yǎng)和分組 復(fù)蘇JEG-3細(xì)胞,用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將2.5 mL對(duì)數(shù)期JEG-3細(xì)胞(5.0×104個(gè)/毫升)接種至6孔板中,用LipofectamineTM2000脂質(zhì)體法,分別轉(zhuǎn)染anti-miR-NC(anti-miR-NC組)、anti-miR-663(anti-miR-663組)、miR-NC(miR-NC組)、miR-663 mimics(miR-663組)、Vector(Vector組)、MMP11過(guò)表達(dá)載體(MMP11組),共轉(zhuǎn)染anti-miR-663與si-NC(anti-miR-663+si-NC組)、anti-miR-663與si-MMP11(anti-miR-663+si-MMP11組)。同時(shí)設(shè)置對(duì)照組(Control組):不進(jìn)行任何轉(zhuǎn)染操作,常規(guī)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染6 h后,更換新鮮培養(yǎng)液。培養(yǎng)24 h后,采用qRT-PCR檢測(cè)Control組、anti-miR-NC組和anti-miR-663組miR-663表達(dá)驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效果,具體方法同1.2.2;采用蛋白免疫印跡(Western blot)法檢測(cè)Control組、anti-miR-NC組、anti-miR-663組、miR-NC組和miR-663組細(xì)胞中MMP11蛋白表達(dá)水平,觀察miR-663對(duì)細(xì)胞中MMP11蛋白表達(dá)水平的影響,同時(shí)檢測(cè)Vector組、MMP11組、anti-miR-663+si-NC組、anti-miR-663+si-MMP11組MMP11蛋白表達(dá)驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效果。

    1.2.4細(xì)胞增殖檢測(cè) 采用CCK-8法檢測(cè)Control組、anti-miR-NC組、anti-miR-663組、Vector組、MMP11組、anti-miR-663+si-NC組和anti-miR-663+si-MMP11組細(xì)胞增殖情況。將0.2 mL各組細(xì)胞(5.0×104個(gè)/毫升)接種到96孔板,培養(yǎng)24 h后,每孔加10 μL CCK-8。孵育3 h,在酶標(biāo)儀上測(cè)定450 nm處吸光度(A)值。

    1.2.5細(xì)胞遷移和侵襲檢測(cè) 利用孔徑為8 μm的Transwell小室測(cè)定Control組、anti-miR-NC組、anti-miR-663組、Vector組、MMP11組、anti-miR-663+si-NC組和anti-miR-663+si-MMP11組細(xì)胞遷移及侵襲情況。侵襲實(shí)驗(yàn):預(yù)先在Transwell小室的上室添加人工基質(zhì)膠,自然晾干。然后于上室加100 μL各組細(xì)胞懸液(5.0×104個(gè)/毫升),下室中添加500 μL含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液。在培養(yǎng)箱中孵育24 h,將Transwell小室取出,擦掉沒(méi)有穿膜的細(xì)胞,放在4%多聚甲醛溶液中固定10 min,將小室取出,風(fēng)干后進(jìn)行蘇木精染色。選擇4個(gè)視野,計(jì)數(shù)細(xì)胞穿膜數(shù)量。遷移實(shí)驗(yàn):除不鋪基質(zhì)膠外,步驟與侵襲實(shí)驗(yàn)相同。

    1.2.6靶向關(guān)系預(yù)測(cè)及鑒定 采用生物信息學(xué)軟件targetscan分析miR-663的靶基因。以熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)鑒定二者的靶向關(guān)系。將miR-663 mimics、miR-NC分別和WT、MUT熒光素酶報(bào)告載體共轉(zhuǎn)染到JEG-3細(xì)胞,培養(yǎng)24 h后,用熒光素酶活性測(cè)定試劑盒分析細(xì)胞熒光素酶活性變化。

    1.2.7MMP11蛋白表達(dá)水平檢測(cè) 采用Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞中MMP11蛋白表達(dá)水平。將2.5 mL各組細(xì)胞(5.0×104個(gè)/毫升)接種至6孔板中,培養(yǎng)24 h后,棄培養(yǎng)液,用RIPA試劑提取細(xì)胞中總蛋白,用BCA法測(cè)定蛋白表達(dá)水平。用微量加樣器取25 μg的蛋白樣品分別加入SDS-PAGE凝膠樣品孔內(nèi),接通電源。前30 min,以70 V的電壓電泳,然后調(diào)整為100 V繼續(xù)電泳約1.5 h,肉眼可見(jiàn)藍(lán)色染料進(jìn)入到底部邊緣。取出凝膠,放在電轉(zhuǎn)液內(nèi)結(jié)合15 min。設(shè)置100 V的電壓轉(zhuǎn)膜1 h。電轉(zhuǎn)結(jié)束后,將分離蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜,并浸泡在含有5%脫脂奶粉的平皿內(nèi),在室溫孵育2 h。然后放在MMP11(1∶1 000)、GAPDH(1∶1 000)一抗溶液中于4 ℃冰箱中孵育過(guò)夜,洗膜后,再放在二抗(1∶2 000)溶液中室溫孵育2 h。滴加顯影液避光顯影,曝光拍照,分析條帶灰度值。以MMP11與GAPDH灰度值的比值表示MMP11蛋白表達(dá)水平。

    2 結(jié) 果

    2.1子癇前期患者胎盤(pán)組織和對(duì)照組織中miR-663表達(dá)水平比較 與對(duì)照組織比較,子癇前期患者胎盤(pán)組織中miR-663表達(dá)水平升高(P<0.05),miR-663在子癇前期患者胎盤(pán)組織中呈高表達(dá),見(jiàn)圖1。

    注:與對(duì)照組織比較,*P<0.05。

    2.2miR-663 inhibitor轉(zhuǎn)染后妊娠滋養(yǎng)層細(xì)胞中miR-663表達(dá)水平比較 與Control、anti-miR-NC組比較,anti-miR-663組妊娠滋養(yǎng)層細(xì)胞中miR-663表達(dá)水平降低(P<0.05),見(jiàn)表1。

    表1 miR-663 inhibitor轉(zhuǎn)染后妊娠滋養(yǎng)層細(xì)胞中miR-663表達(dá)水平比較

    2.3下調(diào)miR-663對(duì)妊娠滋養(yǎng)層細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響 與Control、anti-miR-NC組比較,anti-miR-663組妊娠滋養(yǎng)層細(xì)胞增殖活性升高,遷移和侵襲數(shù)目增加(P<0.05)。下調(diào)miR-663能促進(jìn)妊娠滋養(yǎng)層細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。見(jiàn)表2。

    表2 下調(diào)miR-663對(duì)妊娠滋養(yǎng)層細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響

    2.4miR-663與MMP11的關(guān)系 生物信息學(xué)軟件顯示miR-663和MMP11存在結(jié)合位點(diǎn),見(jiàn)圖2,提示miR-663和MMP11為靶向關(guān)系。與miR-NC組比較,miR-663 mimics和WT共轉(zhuǎn)染后的妊娠滋養(yǎng)層細(xì)胞熒光素酶活性降低(P<0.05),見(jiàn)表3。

    圖2 miR-663和MMP11結(jié)合位點(diǎn)

    表3 miR-663 mimics和MUT、WT共轉(zhuǎn)染后的妊娠滋養(yǎng)層細(xì)胞熒光素酶活性比較

    2.5miR-663對(duì)MMP11表達(dá)的調(diào)控作用 與Control、anti-miR-NC組比較,anti-miR-663組妊娠滋養(yǎng)層細(xì)胞中MMP11蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05);與miR-NC組比較,miR-663組妊娠滋養(yǎng)層細(xì)胞中MMP11蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05),提示miR-663負(fù)調(diào)控MMP11表達(dá)。見(jiàn)圖3、表4。

    表4 miR-663 inhibitor轉(zhuǎn)染后妊娠滋養(yǎng)層細(xì)胞中MMP11蛋白表達(dá)水平比較

    圖3 miR-663 inhibitor轉(zhuǎn)染后妊娠滋養(yǎng)層細(xì)胞中MMP11蛋白表達(dá)情況

    2.6子癇前期患者胎盤(pán)組織和對(duì)照組織中MMP11 mRNA表達(dá)水平比較 與對(duì)照組織比較,子癇前期患者胎盤(pán)組織MMP11 mRNA表達(dá)水平降低(P<0.05),提示MMP11 mRNA在子癇前期患者中表達(dá)下調(diào)。見(jiàn)圖4。

    注:與對(duì)照組織比較,*P<0.05。

    2.7抑制MMP11逆轉(zhuǎn)下調(diào)miR-663對(duì)妊娠滋養(yǎng)層細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的作用 與Control、Vector組比較,MMP11組妊娠滋養(yǎng)層細(xì)胞中MMP11蛋白表達(dá)水平升高,增殖活性升高,侵襲數(shù)目和遷移數(shù)目增加(P<0.05)。與anti-miR-663+si-NC組比較,anti-miR-663+si-MMP11組妊娠滋養(yǎng)層細(xì)胞中MMP11蛋白表達(dá)水平降低,增殖活性降低,侵襲數(shù)目和遷移數(shù)目減少(P<0.05)。見(jiàn)圖5、表5。

    圖5 Western blot檢測(cè)妊娠滋養(yǎng)層細(xì)胞中MMP11蛋白表達(dá)

    表5 各組妊娠滋養(yǎng)層細(xì)胞MMP11蛋白表達(dá)水平、增殖活性(A值)、侵襲數(shù)目、遷移數(shù)目比較

    續(xù)表5 各組妊娠滋養(yǎng)層細(xì)胞MMP11蛋白表達(dá)水平、增殖活性(A值)、侵襲數(shù)目、遷移數(shù)目比較

    3 討 論

    胚胎發(fā)育與功能性胎盤(pán)的形成有關(guān),囊胚期的胚胎細(xì)胞分化形成內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞,內(nèi)細(xì)胞團(tuán)分化形成胎兒,滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞分化形成不同的滋養(yǎng)層細(xì)胞,滋養(yǎng)層細(xì)胞不斷增殖分化,最終形成具有侵襲能力的多層絨毛外滋養(yǎng)層細(xì)胞,絨毛外滋養(yǎng)層細(xì)胞遷移、侵襲至子宮蛻膜,進(jìn)入母體的螺旋動(dòng)脈,維持子宮正常功能,為胚胎發(fā)育提供有利條件[11-12]。研究顯示,滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲、遷移受限是子癇前期發(fā)生的關(guān)鍵原因[13]。

    miRNA是一類(lèi)長(zhǎng)度在22 nt左右的非編碼RNA分子,這類(lèi)分子可在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控其靶基因的表達(dá)[14]。miRNA在進(jìn)化上極為保守,在不同組織和細(xì)胞中的表達(dá)豐度不同[15]。miRNA的異常表達(dá)常常與疾病有關(guān),如miRNA在腫瘤中可發(fā)揮類(lèi)似癌基因或抑癌基因的作用,通過(guò)影響細(xì)胞的增殖、凋亡等發(fā)揮作用[16]。現(xiàn)階段已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了數(shù)千個(gè)miRNA,影響人體內(nèi)30%的基因表達(dá),在生命進(jìn)程中發(fā)揮十分重要的作用[17]。miRNA在子癇前期中可通過(guò)調(diào)控滋養(yǎng)層細(xì)胞的遷移和侵襲發(fā)揮作用[18]。既往研究表明,子癇前期患者胎盤(pán)組織中miR-663表達(dá)水平升高,提示miR-663可能參與子癇前期的發(fā)病過(guò)程[9]。本研究結(jié)果顯示,miR-663在子癇前期患者中表達(dá)水平升高,并且下調(diào)miR-663可加快滋養(yǎng)層細(xì)胞的增殖,誘導(dǎo)細(xì)胞遷移和侵襲,miR-663可能具有加快子癇前期進(jìn)展的作用。

    miRNA的功能多樣性與其調(diào)控機(jī)制有關(guān),miRNA與靶基因的3′UTR端通過(guò)堿基互補(bǔ)結(jié)合,進(jìn)而影響靶蛋白的表達(dá),并且同一個(gè)miRNA可同時(shí)有多個(gè)靶基因,分別參與不同的生理、病理調(diào)控過(guò)程[19-20]。本研究發(fā)現(xiàn),miR-663與MMP11的3′UTR端互補(bǔ)結(jié)合,并且miR-663靶向負(fù)調(diào)控MMP11表達(dá)。MMP11是基質(zhì)金屬蛋白酶家族成員,而基質(zhì)金屬蛋白酶家族是細(xì)胞外基質(zhì)降解的關(guān)鍵蛋白酶[21-22]。細(xì)胞合成的基質(zhì)降解酶能夠?yàn)榧?xì)胞的運(yùn)動(dòng)、遷移和侵襲提供條件[23]。本研究發(fā)現(xiàn),子癇前期胎盤(pán)組織中MMP11表達(dá)水平降低,并且上調(diào)MMP11可增強(qiáng)滋養(yǎng)層細(xì)胞的侵襲、遷移和增殖能力,提示MMP11在子癇前期中可能發(fā)揮抑制作用。同時(shí)本研究還設(shè)置了逆轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn),證明抑制MMP11逆轉(zhuǎn)了下調(diào)miR-663對(duì)滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲、遷移和增殖的促進(jìn)作用,這進(jìn)一步說(shuō)明下調(diào)miR-663可使MMP11的表達(dá)下調(diào),從而促進(jìn)滋養(yǎng)層細(xì)胞的侵襲、遷移和增殖,miR-663在子癇前期中的作用機(jī)制可能與MMP11有關(guān)。

    綜上所述,miR-663可能具有促進(jìn)子癇前期發(fā)展的作用,并且下調(diào)miR-663可靶向促進(jìn)MMP11增強(qiáng)滋養(yǎng)層細(xì)胞的侵襲、遷移和增殖能力,目前尚不明確miR-663是否能通過(guò)其他途徑影響滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲,這些內(nèi)容會(huì)在以后的研究中進(jìn)一步探討。本研究為明確子癇前期的分子發(fā)生機(jī)制和靶向基因治療子癇前期提供了思路。

    猜你喜歡
    滋養(yǎng)層熒光素酶子癇
    微小miR-184在調(diào)控女性滋養(yǎng)層細(xì)胞凋亡中的作用及其分子機(jī)制探究
    NNMT基因啟動(dòng)子雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)的構(gòu)建及其與SND1靶向關(guān)系的驗(yàn)證
    不同雙熒光素酶方法對(duì)檢測(cè)胃癌相關(guān)miRNAs靶向基因TIAM1的影響
    重組雙熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒psiCHECK-2-Intron構(gòu)建轉(zhuǎn)染及轉(zhuǎn)染細(xì)胞螢火蟲(chóng)熒光素酶和海腎熒光素酶表達(dá)
    如何防范子癇
    Kisspeptin對(duì)早期胎盤(pán)滋養(yǎng)層細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用
    懷孕了發(fā)生子癇前期的9大元兇!
    媽媽寶寶(2017年4期)2017-02-25 07:01:24
    孕中期母血PAPPA與PIGF在預(yù)測(cè)子癇前期發(fā)生的作用
    滋養(yǎng)層干細(xì)胞研究進(jìn)展
    HSP70、NF-κB與子癇前期發(fā)病的關(guān)系
    悠悠久久av| 久久久国产精品麻豆| 男女午夜视频在线观看| 国产成人欧美| 一级黄色大片毛片| 一本大道久久a久久精品| 国产激情偷乱视频一区二区| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| cao死你这个sao货| 99国产综合亚洲精品| 18禁国产床啪视频网站| 亚洲国产精品sss在线观看| 丝袜在线中文字幕| 国产视频一区二区在线看| 国产精品免费视频内射| 白带黄色成豆腐渣| 亚洲最大成人中文| 久久精品国产综合久久久| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 午夜久久久久精精品| 亚洲精品国产一区二区精华液| 桃红色精品国产亚洲av| 视频在线观看一区二区三区| 69av精品久久久久久| 制服丝袜大香蕉在线| 亚洲精品粉嫩美女一区| 丁香欧美五月| 午夜福利在线在线| av电影中文网址| 精品国内亚洲2022精品成人| www.熟女人妻精品国产| 国产精品亚洲av一区麻豆| 久久香蕉激情| 青草久久国产| 久久精品91无色码中文字幕| 欧美在线一区亚洲| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 亚洲第一青青草原| 国产不卡一卡二| 搡老岳熟女国产| 丁香欧美五月| 国产三级在线视频| 韩国精品一区二区三区| 欧美精品亚洲一区二区| 亚洲国产精品合色在线| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 国产亚洲精品一区二区www| 99精品在免费线老司机午夜| 91老司机精品| 淫妇啪啪啪对白视频| 亚洲在线自拍视频| 亚洲 欧美一区二区三区| 国产亚洲精品综合一区在线观看 | 99热6这里只有精品| 中文字幕精品亚洲无线码一区 | 亚洲人成网站高清观看| 黑人欧美特级aaaaaa片| 欧美一级a爱片免费观看看 | 日本三级黄在线观看| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 99热这里只有精品一区 | 无限看片的www在线观看| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 国产av一区在线观看免费| 国产麻豆成人av免费视频| 一级a爱视频在线免费观看| 免费观看精品视频网站| 亚洲在线自拍视频| 国产精品电影一区二区三区| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 中文在线观看免费www的网站 | 久久久久国产一级毛片高清牌| 首页视频小说图片口味搜索| 很黄的视频免费| 国产成人欧美在线观看| av片东京热男人的天堂| 亚洲一区高清亚洲精品| 亚洲欧美精品综合久久99| 午夜成年电影在线免费观看| 高清在线国产一区| 久久国产精品人妻蜜桃| 91老司机精品| 啦啦啦韩国在线观看视频| 热re99久久国产66热| 国产熟女xx| 国产亚洲精品综合一区在线观看 | 看黄色毛片网站| 男女那种视频在线观看| 国内精品久久久久精免费| 中文字幕高清在线视频| 男男h啪啪无遮挡| 亚洲av成人一区二区三| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看 | 国产精品电影一区二区三区| 在线国产一区二区在线| 国产免费男女视频| 一级a爱视频在线免费观看| 在线观看www视频免费| 少妇粗大呻吟视频| 久久久久久九九精品二区国产 | 久久精品91蜜桃| 免费在线观看影片大全网站| www.自偷自拍.com| 午夜福利18| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 午夜免费成人在线视频| 午夜视频精品福利| 国产av在哪里看| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 一区福利在线观看| 黄色女人牲交| 免费在线观看完整版高清| 国产黄a三级三级三级人| 日本a在线网址| 最近最新免费中文字幕在线| 又大又爽又粗| 女警被强在线播放| x7x7x7水蜜桃| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 国产激情久久老熟女| 午夜久久久在线观看| 日韩欧美国产在线观看| 国产成人av激情在线播放| 亚洲 欧美一区二区三区| 国产亚洲精品av在线| 白带黄色成豆腐渣| 午夜视频精品福利| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 一a级毛片在线观看| 他把我摸到了高潮在线观看| 国产av不卡久久| 日本免费a在线| 国产亚洲av嫩草精品影院| 国产成人av教育| 中出人妻视频一区二区| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 国产亚洲精品一区二区www| 欧美不卡视频在线免费观看 | 曰老女人黄片| 又紧又爽又黄一区二区| 久久婷婷成人综合色麻豆| 91成人精品电影| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 99国产综合亚洲精品| 1024手机看黄色片| 女人被狂操c到高潮| 日韩欧美在线二视频| 丁香六月欧美| 色老头精品视频在线观看| 国产精品综合久久久久久久免费| 国产又色又爽无遮挡免费看| 女性生殖器流出的白浆| 久久精品成人免费网站| 三级毛片av免费| 高清在线国产一区| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 亚洲熟女毛片儿| 久久精品人妻少妇| 国产欧美日韩精品亚洲av| 制服丝袜大香蕉在线| 日本一区二区免费在线视频| 欧美大码av| 中文字幕精品免费在线观看视频| 精品国产国语对白av| 天天一区二区日本电影三级| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 国产高清videossex| 99国产精品99久久久久| 亚洲精品国产区一区二| 国产不卡一卡二| 成人亚洲精品一区在线观看| 一本久久中文字幕| 精品一区二区三区四区五区乱码| 久久国产精品人妻蜜桃| 欧美精品亚洲一区二区| 啦啦啦免费观看视频1| 国产精品日韩av在线免费观看| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放 | 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放 | 午夜精品在线福利| 人妻久久中文字幕网| 真人做人爱边吃奶动态| www日本在线高清视频| 久久久久久免费高清国产稀缺| av天堂在线播放| 国产91精品成人一区二区三区| 免费高清在线观看日韩| www.www免费av| 少妇的丰满在线观看| 免费在线观看日本一区| 亚洲色图av天堂| 波多野结衣av一区二区av| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 啪啪无遮挡十八禁网站| 两人在一起打扑克的视频| 亚洲午夜理论影院| 一区二区三区激情视频| 色在线成人网| 长腿黑丝高跟| 中亚洲国语对白在线视频| 久久这里只有精品19| 中文字幕最新亚洲高清| 欧美乱色亚洲激情| 999精品在线视频| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 长腿黑丝高跟| 久久精品91无色码中文字幕| 桃色一区二区三区在线观看| 淫妇啪啪啪对白视频| 久久国产精品影院| 亚洲自拍偷在线| 视频区欧美日本亚洲| 麻豆av在线久日| 很黄的视频免费| 黄色a级毛片大全视频| 亚洲av五月六月丁香网| 91字幕亚洲| 波多野结衣高清作品| 搡老妇女老女人老熟妇| 日本一区二区免费在线视频| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 欧美又色又爽又黄视频| 久久久水蜜桃国产精品网| 成人午夜高清在线视频 | 久久香蕉精品热| 日韩成人在线观看一区二区三区| 99在线人妻在线中文字幕| 又大又爽又粗| 国产亚洲欧美精品永久| 久久国产亚洲av麻豆专区| 麻豆久久精品国产亚洲av| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 18禁美女被吸乳视频| 99精品久久久久人妻精品| 黄色丝袜av网址大全| 国产精品乱码一区二三区的特点| 嫩草影视91久久| 国产av不卡久久| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 国产精品永久免费网站| 老司机深夜福利视频在线观看| 日本五十路高清| 免费高清视频大片| 久久久久九九精品影院| 国产成人啪精品午夜网站| 美国免费a级毛片| www.自偷自拍.com| 国产午夜精品久久久久久| a级毛片在线看网站| 99久久综合精品五月天人人| 黑人操中国人逼视频| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 亚洲av中文字字幕乱码综合 | www.www免费av| 久久久久精品国产欧美久久久| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 国产亚洲精品第一综合不卡| 欧美激情极品国产一区二区三区| 91国产中文字幕| 国产高清videossex| 国产黄片美女视频| 巨乳人妻的诱惑在线观看| av在线天堂中文字幕| 美女 人体艺术 gogo| 成人精品一区二区免费| 成人av一区二区三区在线看| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 好男人在线观看高清免费视频 | 亚洲国产毛片av蜜桃av| 国产伦人伦偷精品视频| 国产区一区二久久| 亚洲国产精品合色在线| 日韩成人在线观看一区二区三区| 久久中文字幕人妻熟女| 狂野欧美激情性xxxx| 男男h啪啪无遮挡| av天堂在线播放| 久久久水蜜桃国产精品网| 午夜精品在线福利| av福利片在线| 成人三级做爰电影| 美女国产高潮福利片在线看| 人人妻人人澡欧美一区二区| 亚洲中文av在线| 免费在线观看亚洲国产| 精品国产国语对白av| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 淫秽高清视频在线观看| 国产国语露脸激情在线看| 黄色a级毛片大全视频| 老汉色∧v一级毛片| 88av欧美| 午夜免费激情av| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 白带黄色成豆腐渣| 午夜福利一区二区在线看| 亚洲五月天丁香| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 老司机在亚洲福利影院| avwww免费| 日本 欧美在线| 午夜久久久在线观看| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 日韩高清综合在线| 国产av一区在线观看免费| 一边摸一边做爽爽视频免费| 久久精品国产清高在天天线| 日韩大码丰满熟妇| 欧美一级a爱片免费观看看 | 一级a爱视频在线免费观看| 男女下面进入的视频免费午夜 | 成熟少妇高潮喷水视频| 亚洲国产精品合色在线| 在线观看一区二区三区| 丝袜人妻中文字幕| xxx96com| 999精品在线视频| 成人亚洲精品一区在线观看| 夜夜夜夜夜久久久久| 又黄又粗又硬又大视频| 久久久国产欧美日韩av| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 51午夜福利影视在线观看| 少妇的丰满在线观看| 不卡av一区二区三区| 精品国产一区二区三区四区第35| 日日干狠狠操夜夜爽| 老司机午夜福利在线观看视频| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 国产成人精品久久二区二区91| 欧美一级毛片孕妇| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 成人三级黄色视频| 久久亚洲真实| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 国产成人欧美| 欧美激情 高清一区二区三区| 亚洲中文av在线| 国产精品久久久av美女十八| 精品福利观看| 丁香六月欧美| 老司机午夜福利在线观看视频| 国产精品九九99| 草草在线视频免费看| 69av精品久久久久久| 国产精品一区二区免费欧美| 亚洲一区二区三区色噜噜| 90打野战视频偷拍视频| 精品欧美一区二区三区在线| 国语自产精品视频在线第100页| 男女床上黄色一级片免费看| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 国产亚洲精品一区二区www| 久久99热这里只有精品18| tocl精华| 久久久久久久久中文| 搡老岳熟女国产| 麻豆av在线久日| 国产精品野战在线观看| 亚洲成人精品中文字幕电影| 夜夜爽天天搞| 黄色a级毛片大全视频| 最好的美女福利视频网| 欧美zozozo另类| 国产精品一区二区免费欧美| 大型黄色视频在线免费观看| 性色av乱码一区二区三区2| 午夜成年电影在线免费观看| 亚洲精品国产区一区二| 天天添夜夜摸| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 一进一出抽搐gif免费好疼| 18禁美女被吸乳视频| 观看免费一级毛片| 国产精品影院久久| 人成视频在线观看免费观看| 制服人妻中文乱码| 免费看a级黄色片| 免费人成视频x8x8入口观看| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 男人舔奶头视频| 亚洲五月天丁香| 成人欧美大片| 亚洲国产精品999在线| 母亲3免费完整高清在线观看| 中文字幕最新亚洲高清| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 日本 欧美在线| 久久 成人 亚洲| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆 | 国产精品一区二区三区四区久久 | 亚洲专区字幕在线| 国产免费av片在线观看野外av| 女警被强在线播放| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 国产精品,欧美在线| 99久久国产精品久久久| 欧美精品亚洲一区二区| 亚洲无线在线观看| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 在线观看66精品国产| or卡值多少钱| 日本一区二区免费在线视频| netflix在线观看网站| 免费av毛片视频| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 一区二区三区国产精品乱码| 最好的美女福利视频网| 99riav亚洲国产免费| 中文字幕高清在线视频| 国产不卡一卡二| 日韩有码中文字幕| 亚洲最大成人中文| 哪里可以看免费的av片| 美女扒开内裤让男人捅视频| 老司机靠b影院| 一个人观看的视频www高清免费观看 | x7x7x7水蜜桃| 亚洲成人免费电影在线观看| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 久久青草综合色| 两个人免费观看高清视频| 国内精品久久久久久久电影| 日韩精品中文字幕看吧| 国产一区二区在线av高清观看| 99热这里只有精品一区 | 黄片小视频在线播放| 欧美色欧美亚洲另类二区| 欧美亚洲日本最大视频资源| 91av网站免费观看| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 欧美+亚洲+日韩+国产| 日本 欧美在线| 亚洲国产欧美网| 国产一卡二卡三卡精品| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 国产亚洲av高清不卡| 俄罗斯特黄特色一大片| 国产精品久久电影中文字幕| 国产一级毛片七仙女欲春2 | 亚洲一区二区三区不卡视频| 久久久久久久久久黄片| 中出人妻视频一区二区| 好男人电影高清在线观看| 露出奶头的视频| 免费人成视频x8x8入口观看| 免费在线观看日本一区| av欧美777| 国产精品亚洲av一区麻豆| 成人av一区二区三区在线看| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 久久 成人 亚洲| 精品国产一区二区三区四区第35| 国产麻豆成人av免费视频| 亚洲五月色婷婷综合| 一夜夜www| 免费一级毛片在线播放高清视频| 国产精品久久久久久精品电影 | 一进一出抽搐gif免费好疼| 男女视频在线观看网站免费 | 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 久久久久久久午夜电影| 亚洲在线自拍视频| 欧美黑人精品巨大| 两人在一起打扑克的视频| 久久久久久九九精品二区国产 | 亚洲五月婷婷丁香| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 女性生殖器流出的白浆| 人人澡人人妻人| 他把我摸到了高潮在线观看| 欧美成人免费av一区二区三区| 久久精品91蜜桃| 搡老妇女老女人老熟妇| 黑人操中国人逼视频| 欧美黄色片欧美黄色片| 午夜成年电影在线免费观看| 国产野战对白在线观看| 国产成人av教育| 久久婷婷成人综合色麻豆| 亚洲五月天丁香| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| АⅤ资源中文在线天堂| 欧美中文综合在线视频| 99国产极品粉嫩在线观看| 国产亚洲av嫩草精品影院| 免费无遮挡裸体视频| 性色av乱码一区二区三区2| 麻豆一二三区av精品| 日本精品一区二区三区蜜桃| 一本精品99久久精品77| 国产不卡一卡二| 成年免费大片在线观看| 午夜福利高清视频| 黄片大片在线免费观看| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 日韩欧美免费精品| 可以在线观看毛片的网站| 十八禁网站免费在线| 久久久久久久久免费视频了| 日韩欧美一区视频在线观看| 老司机福利观看| 国产又爽黄色视频| 欧美黄色淫秽网站| 亚洲精品一区av在线观看| 女警被强在线播放| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 久久九九热精品免费| 不卡一级毛片| 亚洲成av人片免费观看| 日韩中文字幕欧美一区二区| 一个人观看的视频www高清免费观看 | 欧美一级毛片孕妇| 亚洲自拍偷在线| av片东京热男人的天堂| 欧美日本亚洲视频在线播放| 亚洲欧美激情综合另类| 99国产极品粉嫩在线观看| 99热6这里只有精品| 日本免费一区二区三区高清不卡| 免费搜索国产男女视频| 美女国产高潮福利片在线看| 狠狠狠狠99中文字幕| 中文字幕精品免费在线观看视频| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 99久久99久久久精品蜜桃| 女性生殖器流出的白浆| 丁香六月欧美| 国产精品九九99| 人人妻人人看人人澡| 久久久国产精品麻豆| 波多野结衣巨乳人妻| 亚洲熟妇熟女久久| 精品久久久久久久久久免费视频| 精品国产美女av久久久久小说| 色av中文字幕| 国产真人三级小视频在线观看| 亚洲免费av在线视频| 久久久国产欧美日韩av| 两人在一起打扑克的视频| 国产亚洲精品第一综合不卡| aaaaa片日本免费| 亚洲成人免费电影在线观看| 欧美成人一区二区免费高清观看 | 人成视频在线观看免费观看| 曰老女人黄片| 最近最新免费中文字幕在线| 手机成人av网站| 日韩av在线大香蕉| 超碰成人久久| 欧美成人性av电影在线观看| 欧美日韩精品网址| 久久精品成人免费网站| 在线观看66精品国产| 高清毛片免费观看视频网站| 欧美日韩黄片免| 欧美色视频一区免费| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 欧美日韩福利视频一区二区| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站 | 12—13女人毛片做爰片一| 香蕉国产在线看| 国产成人欧美| 99精品久久久久人妻精品| 午夜福利高清视频| 很黄的视频免费| 美女大奶头视频| 国产久久久一区二区三区| 国产一卡二卡三卡精品| www.精华液| 国产精品久久久人人做人人爽| 最新在线观看一区二区三区| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 精品熟女少妇八av免费久了| 午夜视频精品福利| x7x7x7水蜜桃| 午夜福利18| 免费看日本二区| 丁香欧美五月| 日本三级黄在线观看| 日本精品一区二区三区蜜桃| 窝窝影院91人妻| 亚洲人成77777在线视频| 欧美精品啪啪一区二区三区| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 高清毛片免费观看视频网站| 少妇粗大呻吟视频| 操出白浆在线播放| 亚洲精品在线观看二区| 91麻豆av在线| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 免费电影在线观看免费观看| 国内精品久久久久精免费| 国产精品爽爽va在线观看网站 | 人人妻,人人澡人人爽秒播| 亚洲成国产人片在线观看| 亚洲美女黄片视频| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 18禁国产床啪视频网站| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 国产三级黄色录像| 99久久99久久久精品蜜桃| 欧美zozozo另类| 亚洲电影在线观看av| 无人区码免费观看不卡| 成人三级黄色视频| 国产av一区在线观看免费|