• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    miR-663調(diào)控MMP11對(duì)妊娠滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲和遷移的影響

    2021-11-26 07:29:38段昆茂王世芳陳周紅
    關(guān)鍵詞:滋養(yǎng)層熒光素酶子癇

    段昆茂,王世芳△,陳周紅

    1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院綦江醫(yī)院產(chǎn)科,重慶 401420; 2.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院婦產(chǎn)科,重慶 401120

    子癇前期是妊娠期高血壓疾病的一種特殊類(lèi)型,一般表現(xiàn)為妊娠女性在妊娠20周以后出現(xiàn)水腫、蛋白尿、高血壓,在分娩以后血壓恢復(fù)正常[1]。目前尚不清楚子癇前期的具體發(fā)病機(jī)制和病因,已知滋養(yǎng)層細(xì)胞是胎盤(pán)的主要組成部分,在胎盤(pán)形成和胎兒正常發(fā)育過(guò)程中具有重要作用,滋養(yǎng)層細(xì)胞侵入子宮螺旋動(dòng)脈受限和過(guò)淺均可能夠誘導(dǎo)子癇前期的發(fā)生,改善滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲和遷移能力可能是抑制子癇前期的重要步驟[2]。微小RNA(miRNA)是一類(lèi)沒(méi)有編碼蛋白質(zhì)功能的RNA,可以通過(guò)與靶基因的3端非翻譯區(qū)(3′UTR)結(jié)合影響蛋白翻譯[3]。miRNA的功能很多,如調(diào)控細(xì)胞分化、凋亡、炎癥、衰老、氧化損傷、增殖等,還與很多疾病的發(fā)生有關(guān)[4]。既往研究顯示,子癇前期患者胎盤(pán)組織中miRNA表達(dá)異常,且影響滋養(yǎng)層細(xì)胞的功能[5]。miR-663是與腫瘤有關(guān)的調(diào)控因子,還與鼻息肉的產(chǎn)生、燙傷修復(fù)等過(guò)程密切相關(guān)[6-8]。研究顯示,miR-663在子癇前期患者中高表達(dá)[9]。目前尚不清楚miR-663在妊娠滋養(yǎng)層細(xì)胞遷移和侵襲中的作用。前期的預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),miR-663和基質(zhì)金屬蛋白酶11(MMP11)的3′UTR端有互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn),MMP11是基質(zhì)金屬蛋白酶家族成員,在細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、侵襲過(guò)程中發(fā)揮促進(jìn)作用[10]。本研究通過(guò)探討miR-663調(diào)控MMP11對(duì)妊娠滋養(yǎng)層細(xì)胞遷移和侵襲的影響及機(jī)制,以期為改善子癇前期的預(yù)后提供方向。

    1 資料與方法

    1.1一般資料 收集2018年7月至2020年7月重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院綦江醫(yī)院收治的妊娠期子癇前期患者行剖宮產(chǎn)留取的胎盤(pán)組織19例,同時(shí)收集健康妊娠女性行剖宮產(chǎn)留取的胎盤(pán)組織19例(對(duì)照組織)。

    1.2方法

    1.2.1實(shí)驗(yàn)細(xì)胞與試劑 妊娠滋養(yǎng)層JEG-3細(xì)胞購(gòu)自上海通派生物科技有限公司;DMEM培養(yǎng)液、CCK-8、二喹啉甲酸(BCA)蛋白檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司;miR-663 模擬物(mimics)和抑制劑(anti-miR-663)、模擬對(duì)照序列(miR-NC)及抑制劑對(duì)照序列(anti-miR-NC)由上海安必奇生物科技有限公司構(gòu)建;MMP11過(guò)表達(dá)載體及其小干擾RNA(si-MMP11)、空載體(vector)、小干擾RNA陰性對(duì)照(si-NC)、MMP11野生型(WT)和突變型(MUT)熒光素酶報(bào)告載體均由湖南豐暉生物科技有限公司構(gòu)建;MMP11、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體購(gòu)自上海齊一生物科技有限公司。

    1.2.2miR-663和MMP11 mRNA表達(dá)水平檢測(cè) 采用qRT-PCR檢測(cè)miR-663和MMP11 mRNA表達(dá)水平。采用Trizol試劑提取子癇前期患者胎盤(pán)組織和對(duì)照組織中的總RNA,利用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA水平和純度。然后利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,以cDNA為模板,行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)參數(shù)為:95 ℃預(yù)變性60 s;95 ℃變性30 s,60 ℃退火30 s,68 ℃延伸30 s,共40個(gè)循環(huán)。利用2-△△Ct法分析目的基因的表達(dá)變化,miR-663內(nèi)參為U6,MMP11 mRNA內(nèi)參為GAPDH。PCR引物為:U6上游引物5′-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3′,下游引物5′-GGAACGCTTCACGAATTTA-3′;miR-663上游引物5′-GTGCGTGTCGTGGAGTCG-3′,下游引物5′-TTTAGGCGGGGCG-3′;MMP11上游引物5′-TTCTACACCTTCCGCTACC-3′,下游引物5′-GGACTGGCTTCTCACCATCATAT-3′;GAPDH上游引物5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′,下游引物5′-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3′。

    1.2.3細(xì)胞培養(yǎng)和分組 復(fù)蘇JEG-3細(xì)胞,用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將2.5 mL對(duì)數(shù)期JEG-3細(xì)胞(5.0×104個(gè)/毫升)接種至6孔板中,用LipofectamineTM2000脂質(zhì)體法,分別轉(zhuǎn)染anti-miR-NC(anti-miR-NC組)、anti-miR-663(anti-miR-663組)、miR-NC(miR-NC組)、miR-663 mimics(miR-663組)、Vector(Vector組)、MMP11過(guò)表達(dá)載體(MMP11組),共轉(zhuǎn)染anti-miR-663與si-NC(anti-miR-663+si-NC組)、anti-miR-663與si-MMP11(anti-miR-663+si-MMP11組)。同時(shí)設(shè)置對(duì)照組(Control組):不進(jìn)行任何轉(zhuǎn)染操作,常規(guī)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染6 h后,更換新鮮培養(yǎng)液。培養(yǎng)24 h后,采用qRT-PCR檢測(cè)Control組、anti-miR-NC組和anti-miR-663組miR-663表達(dá)驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效果,具體方法同1.2.2;采用蛋白免疫印跡(Western blot)法檢測(cè)Control組、anti-miR-NC組、anti-miR-663組、miR-NC組和miR-663組細(xì)胞中MMP11蛋白表達(dá)水平,觀察miR-663對(duì)細(xì)胞中MMP11蛋白表達(dá)水平的影響,同時(shí)檢測(cè)Vector組、MMP11組、anti-miR-663+si-NC組、anti-miR-663+si-MMP11組MMP11蛋白表達(dá)驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效果。

    1.2.4細(xì)胞增殖檢測(cè) 采用CCK-8法檢測(cè)Control組、anti-miR-NC組、anti-miR-663組、Vector組、MMP11組、anti-miR-663+si-NC組和anti-miR-663+si-MMP11組細(xì)胞增殖情況。將0.2 mL各組細(xì)胞(5.0×104個(gè)/毫升)接種到96孔板,培養(yǎng)24 h后,每孔加10 μL CCK-8。孵育3 h,在酶標(biāo)儀上測(cè)定450 nm處吸光度(A)值。

    1.2.5細(xì)胞遷移和侵襲檢測(cè) 利用孔徑為8 μm的Transwell小室測(cè)定Control組、anti-miR-NC組、anti-miR-663組、Vector組、MMP11組、anti-miR-663+si-NC組和anti-miR-663+si-MMP11組細(xì)胞遷移及侵襲情況。侵襲實(shí)驗(yàn):預(yù)先在Transwell小室的上室添加人工基質(zhì)膠,自然晾干。然后于上室加100 μL各組細(xì)胞懸液(5.0×104個(gè)/毫升),下室中添加500 μL含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液。在培養(yǎng)箱中孵育24 h,將Transwell小室取出,擦掉沒(méi)有穿膜的細(xì)胞,放在4%多聚甲醛溶液中固定10 min,將小室取出,風(fēng)干后進(jìn)行蘇木精染色。選擇4個(gè)視野,計(jì)數(shù)細(xì)胞穿膜數(shù)量。遷移實(shí)驗(yàn):除不鋪基質(zhì)膠外,步驟與侵襲實(shí)驗(yàn)相同。

    1.2.6靶向關(guān)系預(yù)測(cè)及鑒定 采用生物信息學(xué)軟件targetscan分析miR-663的靶基因。以熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)鑒定二者的靶向關(guān)系。將miR-663 mimics、miR-NC分別和WT、MUT熒光素酶報(bào)告載體共轉(zhuǎn)染到JEG-3細(xì)胞,培養(yǎng)24 h后,用熒光素酶活性測(cè)定試劑盒分析細(xì)胞熒光素酶活性變化。

    1.2.7MMP11蛋白表達(dá)水平檢測(cè) 采用Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞中MMP11蛋白表達(dá)水平。將2.5 mL各組細(xì)胞(5.0×104個(gè)/毫升)接種至6孔板中,培養(yǎng)24 h后,棄培養(yǎng)液,用RIPA試劑提取細(xì)胞中總蛋白,用BCA法測(cè)定蛋白表達(dá)水平。用微量加樣器取25 μg的蛋白樣品分別加入SDS-PAGE凝膠樣品孔內(nèi),接通電源。前30 min,以70 V的電壓電泳,然后調(diào)整為100 V繼續(xù)電泳約1.5 h,肉眼可見(jiàn)藍(lán)色染料進(jìn)入到底部邊緣。取出凝膠,放在電轉(zhuǎn)液內(nèi)結(jié)合15 min。設(shè)置100 V的電壓轉(zhuǎn)膜1 h。電轉(zhuǎn)結(jié)束后,將分離蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜,并浸泡在含有5%脫脂奶粉的平皿內(nèi),在室溫孵育2 h。然后放在MMP11(1∶1 000)、GAPDH(1∶1 000)一抗溶液中于4 ℃冰箱中孵育過(guò)夜,洗膜后,再放在二抗(1∶2 000)溶液中室溫孵育2 h。滴加顯影液避光顯影,曝光拍照,分析條帶灰度值。以MMP11與GAPDH灰度值的比值表示MMP11蛋白表達(dá)水平。

    2 結(jié) 果

    2.1子癇前期患者胎盤(pán)組織和對(duì)照組織中miR-663表達(dá)水平比較 與對(duì)照組織比較,子癇前期患者胎盤(pán)組織中miR-663表達(dá)水平升高(P<0.05),miR-663在子癇前期患者胎盤(pán)組織中呈高表達(dá),見(jiàn)圖1。

    注:與對(duì)照組織比較,*P<0.05。

    2.2miR-663 inhibitor轉(zhuǎn)染后妊娠滋養(yǎng)層細(xì)胞中miR-663表達(dá)水平比較 與Control、anti-miR-NC組比較,anti-miR-663組妊娠滋養(yǎng)層細(xì)胞中miR-663表達(dá)水平降低(P<0.05),見(jiàn)表1。

    表1 miR-663 inhibitor轉(zhuǎn)染后妊娠滋養(yǎng)層細(xì)胞中miR-663表達(dá)水平比較

    2.3下調(diào)miR-663對(duì)妊娠滋養(yǎng)層細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響 與Control、anti-miR-NC組比較,anti-miR-663組妊娠滋養(yǎng)層細(xì)胞增殖活性升高,遷移和侵襲數(shù)目增加(P<0.05)。下調(diào)miR-663能促進(jìn)妊娠滋養(yǎng)層細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。見(jiàn)表2。

    表2 下調(diào)miR-663對(duì)妊娠滋養(yǎng)層細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響

    2.4miR-663與MMP11的關(guān)系 生物信息學(xué)軟件顯示miR-663和MMP11存在結(jié)合位點(diǎn),見(jiàn)圖2,提示miR-663和MMP11為靶向關(guān)系。與miR-NC組比較,miR-663 mimics和WT共轉(zhuǎn)染后的妊娠滋養(yǎng)層細(xì)胞熒光素酶活性降低(P<0.05),見(jiàn)表3。

    圖2 miR-663和MMP11結(jié)合位點(diǎn)

    表3 miR-663 mimics和MUT、WT共轉(zhuǎn)染后的妊娠滋養(yǎng)層細(xì)胞熒光素酶活性比較

    2.5miR-663對(duì)MMP11表達(dá)的調(diào)控作用 與Control、anti-miR-NC組比較,anti-miR-663組妊娠滋養(yǎng)層細(xì)胞中MMP11蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05);與miR-NC組比較,miR-663組妊娠滋養(yǎng)層細(xì)胞中MMP11蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05),提示miR-663負(fù)調(diào)控MMP11表達(dá)。見(jiàn)圖3、表4。

    表4 miR-663 inhibitor轉(zhuǎn)染后妊娠滋養(yǎng)層細(xì)胞中MMP11蛋白表達(dá)水平比較

    圖3 miR-663 inhibitor轉(zhuǎn)染后妊娠滋養(yǎng)層細(xì)胞中MMP11蛋白表達(dá)情況

    2.6子癇前期患者胎盤(pán)組織和對(duì)照組織中MMP11 mRNA表達(dá)水平比較 與對(duì)照組織比較,子癇前期患者胎盤(pán)組織MMP11 mRNA表達(dá)水平降低(P<0.05),提示MMP11 mRNA在子癇前期患者中表達(dá)下調(diào)。見(jiàn)圖4。

    注:與對(duì)照組織比較,*P<0.05。

    2.7抑制MMP11逆轉(zhuǎn)下調(diào)miR-663對(duì)妊娠滋養(yǎng)層細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的作用 與Control、Vector組比較,MMP11組妊娠滋養(yǎng)層細(xì)胞中MMP11蛋白表達(dá)水平升高,增殖活性升高,侵襲數(shù)目和遷移數(shù)目增加(P<0.05)。與anti-miR-663+si-NC組比較,anti-miR-663+si-MMP11組妊娠滋養(yǎng)層細(xì)胞中MMP11蛋白表達(dá)水平降低,增殖活性降低,侵襲數(shù)目和遷移數(shù)目減少(P<0.05)。見(jiàn)圖5、表5。

    圖5 Western blot檢測(cè)妊娠滋養(yǎng)層細(xì)胞中MMP11蛋白表達(dá)

    表5 各組妊娠滋養(yǎng)層細(xì)胞MMP11蛋白表達(dá)水平、增殖活性(A值)、侵襲數(shù)目、遷移數(shù)目比較

    續(xù)表5 各組妊娠滋養(yǎng)層細(xì)胞MMP11蛋白表達(dá)水平、增殖活性(A值)、侵襲數(shù)目、遷移數(shù)目比較

    3 討 論

    胚胎發(fā)育與功能性胎盤(pán)的形成有關(guān),囊胚期的胚胎細(xì)胞分化形成內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞,內(nèi)細(xì)胞團(tuán)分化形成胎兒,滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞分化形成不同的滋養(yǎng)層細(xì)胞,滋養(yǎng)層細(xì)胞不斷增殖分化,最終形成具有侵襲能力的多層絨毛外滋養(yǎng)層細(xì)胞,絨毛外滋養(yǎng)層細(xì)胞遷移、侵襲至子宮蛻膜,進(jìn)入母體的螺旋動(dòng)脈,維持子宮正常功能,為胚胎發(fā)育提供有利條件[11-12]。研究顯示,滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲、遷移受限是子癇前期發(fā)生的關(guān)鍵原因[13]。

    miRNA是一類(lèi)長(zhǎng)度在22 nt左右的非編碼RNA分子,這類(lèi)分子可在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控其靶基因的表達(dá)[14]。miRNA在進(jìn)化上極為保守,在不同組織和細(xì)胞中的表達(dá)豐度不同[15]。miRNA的異常表達(dá)常常與疾病有關(guān),如miRNA在腫瘤中可發(fā)揮類(lèi)似癌基因或抑癌基因的作用,通過(guò)影響細(xì)胞的增殖、凋亡等發(fā)揮作用[16]。現(xiàn)階段已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了數(shù)千個(gè)miRNA,影響人體內(nèi)30%的基因表達(dá),在生命進(jìn)程中發(fā)揮十分重要的作用[17]。miRNA在子癇前期中可通過(guò)調(diào)控滋養(yǎng)層細(xì)胞的遷移和侵襲發(fā)揮作用[18]。既往研究表明,子癇前期患者胎盤(pán)組織中miR-663表達(dá)水平升高,提示miR-663可能參與子癇前期的發(fā)病過(guò)程[9]。本研究結(jié)果顯示,miR-663在子癇前期患者中表達(dá)水平升高,并且下調(diào)miR-663可加快滋養(yǎng)層細(xì)胞的增殖,誘導(dǎo)細(xì)胞遷移和侵襲,miR-663可能具有加快子癇前期進(jìn)展的作用。

    miRNA的功能多樣性與其調(diào)控機(jī)制有關(guān),miRNA與靶基因的3′UTR端通過(guò)堿基互補(bǔ)結(jié)合,進(jìn)而影響靶蛋白的表達(dá),并且同一個(gè)miRNA可同時(shí)有多個(gè)靶基因,分別參與不同的生理、病理調(diào)控過(guò)程[19-20]。本研究發(fā)現(xiàn),miR-663與MMP11的3′UTR端互補(bǔ)結(jié)合,并且miR-663靶向負(fù)調(diào)控MMP11表達(dá)。MMP11是基質(zhì)金屬蛋白酶家族成員,而基質(zhì)金屬蛋白酶家族是細(xì)胞外基質(zhì)降解的關(guān)鍵蛋白酶[21-22]。細(xì)胞合成的基質(zhì)降解酶能夠?yàn)榧?xì)胞的運(yùn)動(dòng)、遷移和侵襲提供條件[23]。本研究發(fā)現(xiàn),子癇前期胎盤(pán)組織中MMP11表達(dá)水平降低,并且上調(diào)MMP11可增強(qiáng)滋養(yǎng)層細(xì)胞的侵襲、遷移和增殖能力,提示MMP11在子癇前期中可能發(fā)揮抑制作用。同時(shí)本研究還設(shè)置了逆轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn),證明抑制MMP11逆轉(zhuǎn)了下調(diào)miR-663對(duì)滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲、遷移和增殖的促進(jìn)作用,這進(jìn)一步說(shuō)明下調(diào)miR-663可使MMP11的表達(dá)下調(diào),從而促進(jìn)滋養(yǎng)層細(xì)胞的侵襲、遷移和增殖,miR-663在子癇前期中的作用機(jī)制可能與MMP11有關(guān)。

    綜上所述,miR-663可能具有促進(jìn)子癇前期發(fā)展的作用,并且下調(diào)miR-663可靶向促進(jìn)MMP11增強(qiáng)滋養(yǎng)層細(xì)胞的侵襲、遷移和增殖能力,目前尚不明確miR-663是否能通過(guò)其他途徑影響滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲,這些內(nèi)容會(huì)在以后的研究中進(jìn)一步探討。本研究為明確子癇前期的分子發(fā)生機(jī)制和靶向基因治療子癇前期提供了思路。

    猜你喜歡
    滋養(yǎng)層熒光素酶子癇
    微小miR-184在調(diào)控女性滋養(yǎng)層細(xì)胞凋亡中的作用及其分子機(jī)制探究
    NNMT基因啟動(dòng)子雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)的構(gòu)建及其與SND1靶向關(guān)系的驗(yàn)證
    不同雙熒光素酶方法對(duì)檢測(cè)胃癌相關(guān)miRNAs靶向基因TIAM1的影響
    重組雙熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒psiCHECK-2-Intron構(gòu)建轉(zhuǎn)染及轉(zhuǎn)染細(xì)胞螢火蟲(chóng)熒光素酶和海腎熒光素酶表達(dá)
    如何防范子癇
    Kisspeptin對(duì)早期胎盤(pán)滋養(yǎng)層細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用
    懷孕了發(fā)生子癇前期的9大元兇!
    媽媽寶寶(2017年4期)2017-02-25 07:01:24
    孕中期母血PAPPA與PIGF在預(yù)測(cè)子癇前期發(fā)生的作用
    滋養(yǎng)層干細(xì)胞研究進(jìn)展
    HSP70、NF-κB與子癇前期發(fā)病的關(guān)系
    我要看黄色一级片免费的| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 久久性视频一级片| 成人影院久久| 国产精品99久久99久久久不卡| 免费看a级黄色片| 久久久久精品人妻al黑| 这个男人来自地球电影免费观看| 国产片内射在线| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 欧美变态另类bdsm刘玥| 午夜福利在线观看吧| 成年女人毛片免费观看观看9 | 色综合欧美亚洲国产小说| 高潮久久久久久久久久久不卡| 岛国在线观看网站| 国产成人系列免费观看| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 日本黄色日本黄色录像| 一区在线观看完整版| 夫妻午夜视频| 国产精品久久久久成人av| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 捣出白浆h1v1| 国产极品粉嫩免费观看在线| 热re99久久国产66热| 妹子高潮喷水视频| 少妇被粗大的猛进出69影院| 1024视频免费在线观看| av天堂久久9| 手机成人av网站| 日韩成人在线观看一区二区三区| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 国产淫语在线视频| 亚洲成人免费电影在线观看| 免费日韩欧美在线观看| 亚洲av成人一区二区三| 久久 成人 亚洲| 午夜91福利影院| 岛国在线观看网站| 在线观看免费视频日本深夜| 久久久久久免费高清国产稀缺| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 国产高清视频在线播放一区| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 久久久精品免费免费高清| 久久中文字幕人妻熟女| 老司机福利观看| 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 91成年电影在线观看| 99精品久久久久人妻精品| 精品一区二区三区av网在线观看 | 亚洲九九香蕉| 亚洲国产av影院在线观看| 久久99热这里只频精品6学生| 一区二区三区激情视频| 捣出白浆h1v1| 两人在一起打扑克的视频| 成人精品一区二区免费| 国产日韩欧美亚洲二区| 精品国产乱码久久久久久男人| 亚洲国产av新网站| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| av线在线观看网站| 中文字幕色久视频| 午夜福利视频精品| av天堂在线播放| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 日韩有码中文字幕| 精品久久久精品久久久| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 99精国产麻豆久久婷婷| www.精华液| a级毛片黄视频| 成年动漫av网址| 国产成人精品久久二区二区91| 欧美成人免费av一区二区三区 | 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 日韩成人在线观看一区二区三区| 啪啪无遮挡十八禁网站| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看 | 纵有疾风起免费观看全集完整版| 日韩免费av在线播放| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| www.999成人在线观看| 久久人人97超碰香蕉20202| 在线观看66精品国产| 男女下面插进去视频免费观看| 国产精品九九99| 老汉色av国产亚洲站长工具| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区 | 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 成人av一区二区三区在线看| 亚洲美女黄片视频| 精品一品国产午夜福利视频| 欧美日本中文国产一区发布| 国产精品 国内视频| 久久久久国产一级毛片高清牌| 不卡av一区二区三区| 搡老岳熟女国产| 狠狠狠狠99中文字幕| 久久久国产一区二区| a级毛片黄视频| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 日韩人妻精品一区2区三区| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 在线观看66精品国产| 91麻豆精品激情在线观看国产 | 母亲3免费完整高清在线观看| 夫妻午夜视频| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 精品免费久久久久久久清纯 | 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 欧美午夜高清在线| tocl精华| 久久热在线av| 久久久国产一区二区| 成人免费观看视频高清| 大陆偷拍与自拍| 男女免费视频国产| 亚洲av日韩在线播放| 一级片免费观看大全| 欧美黄色淫秽网站| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 国产激情久久老熟女| av国产精品久久久久影院| 老司机亚洲免费影院| 美女视频免费永久观看网站| 考比视频在线观看| 美女高潮到喷水免费观看| 欧美精品一区二区大全| 国产熟女午夜一区二区三区| 91麻豆av在线| 一级黄色大片毛片| 91精品三级在线观看| 欧美精品一区二区免费开放| 高清av免费在线| 国产精品欧美亚洲77777| 久久国产精品人妻蜜桃| 日日夜夜操网爽| 不卡av一区二区三区| 纯流量卡能插随身wifi吗| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 女性生殖器流出的白浆| 高清毛片免费观看视频网站 | 国产精品久久久久久精品电影小说| 成人国产一区最新在线观看| 精品人妻在线不人妻| 五月开心婷婷网| 日本vs欧美在线观看视频| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 啦啦啦免费观看视频1| av网站免费在线观看视频| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 欧美亚洲日本最大视频资源| 最近最新中文字幕大全免费视频| xxxhd国产人妻xxx| 91成人精品电影| 最近最新中文字幕大全免费视频| xxxhd国产人妻xxx| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 国产精品 国内视频| 国产精品一区二区免费欧美| 日本欧美视频一区| 国产精品偷伦视频观看了| 久久 成人 亚洲| 午夜福利视频在线观看免费| 久久九九热精品免费| 真人做人爱边吃奶动态| 欧美在线黄色| 国产精品成人在线| 亚洲av片天天在线观看| 两个人看的免费小视频| 日韩免费av在线播放| 欧美激情高清一区二区三区| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 纯流量卡能插随身wifi吗| 国产精品av久久久久免费| 一本色道久久久久久精品综合| 少妇 在线观看| 日本黄色日本黄色录像| 多毛熟女@视频| 欧美日韩黄片免| 国产一区二区三区在线臀色熟女 | 极品人妻少妇av视频| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 精品视频人人做人人爽| 免费观看a级毛片全部| 午夜91福利影院| 午夜福利乱码中文字幕| 操出白浆在线播放| 午夜福利影视在线免费观看| 国产精品二区激情视频| 亚洲欧洲日产国产| 男人舔女人的私密视频| 母亲3免费完整高清在线观看| av国产精品久久久久影院| av天堂在线播放| 老鸭窝网址在线观看| 91老司机精品| 99久久人妻综合| 69av精品久久久久久 | 亚洲av电影在线进入| 亚洲综合色网址| 久热爱精品视频在线9| 啦啦啦 在线观看视频| 在线av久久热| 亚洲 国产 在线| 日本a在线网址| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 99香蕉大伊视频| 老司机亚洲免费影院| 人妻一区二区av| 国产97色在线日韩免费| 亚洲成人免费电影在线观看| 满18在线观看网站| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 午夜精品久久久久久毛片777| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 99精品欧美一区二区三区四区| 桃花免费在线播放| 一边摸一边做爽爽视频免费| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 午夜日韩欧美国产| 亚洲视频免费观看视频| 人人妻人人澡人人看| 美女国产高潮福利片在线看| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 国产激情久久老熟女| 久久人人97超碰香蕉20202| 国产精品久久久久久人妻精品电影 | 欧美精品高潮呻吟av久久| 又大又爽又粗| 热99国产精品久久久久久7| 99国产精品免费福利视频| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 国产精品1区2区在线观看. | 久久精品成人免费网站| 99久久99久久久精品蜜桃| 他把我摸到了高潮在线观看 | 国产亚洲精品第一综合不卡| 亚洲一区二区三区欧美精品| 91九色精品人成在线观看| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 两人在一起打扑克的视频| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 美女高潮到喷水免费观看| 成人三级做爰电影| 男人舔女人的私密视频| 十八禁人妻一区二区| 国产成人精品久久二区二区免费| 欧美黄色片欧美黄色片| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 不卡一级毛片| 国产精品久久久久久人妻精品电影 | 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 无人区码免费观看不卡 | 国产av又大| 亚洲专区字幕在线| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 亚洲人成电影免费在线| 亚洲成人手机| 免费看a级黄色片| 亚洲九九香蕉| 两人在一起打扑克的视频| 午夜91福利影院| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 国产亚洲欧美在线一区二区| 久久这里只有精品19| 色播在线永久视频| 男人舔女人的私密视频| 90打野战视频偷拍视频| 日本wwww免费看| 亚洲av成人一区二区三| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 视频区欧美日本亚洲| 最新在线观看一区二区三区| 日韩免费高清中文字幕av| 极品少妇高潮喷水抽搐| 亚洲熟妇熟女久久| 三级毛片av免费| 啦啦啦在线免费观看视频4| 亚洲伊人色综图| 亚洲性夜色夜夜综合| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 国产又色又爽无遮挡免费看| 亚洲av欧美aⅴ国产| 高清在线国产一区| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 久久av网站| 日韩有码中文字幕| 精品卡一卡二卡四卡免费| 丁香六月天网| 国产成人精品久久二区二区91| 色尼玛亚洲综合影院| 亚洲三区欧美一区| 免费在线观看完整版高清| 欧美日韩成人在线一区二区| 黄色a级毛片大全视频| 国产高清视频在线播放一区| 日本a在线网址| 午夜免费鲁丝| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 久久精品国产99精品国产亚洲性色 | 国产欧美日韩一区二区三| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 国产一区二区三区视频了| 亚洲精华国产精华精| 国产成人精品久久二区二区免费| 亚洲成人国产一区在线观看| 亚洲精品国产色婷婷电影| 欧美一级毛片孕妇| 18禁观看日本| 欧美日韩一级在线毛片| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 后天国语完整版免费观看| 国产精品久久久久成人av| 女人久久www免费人成看片| 一级毛片电影观看| 国产精品久久久av美女十八| 99热网站在线观看| 老汉色∧v一级毛片| 老鸭窝网址在线观看| 午夜91福利影院| 亚洲精品粉嫩美女一区| 国产一区二区 视频在线| 99re在线观看精品视频| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 亚洲国产成人一精品久久久| 在线观看免费日韩欧美大片| 久热爱精品视频在线9| 天堂中文最新版在线下载| 亚洲中文日韩欧美视频| 国产午夜精品久久久久久| 高清在线国产一区| 国产成人系列免费观看| 中文字幕色久视频| 老熟女久久久| 三级毛片av免费| 免费在线观看影片大全网站| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 国产日韩欧美视频二区| 久久免费观看电影| 国产精品久久久久久精品电影小说| 极品教师在线免费播放| 精品少妇内射三级| 十八禁网站免费在线| 久久久久精品国产欧美久久久| 国产xxxxx性猛交| 99久久国产精品久久久| 日韩免费av在线播放| 男人操女人黄网站| 女同久久另类99精品国产91| 麻豆av在线久日| 超碰成人久久| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 一区二区三区国产精品乱码| 国产在线免费精品| 国产成人av激情在线播放| 人妻 亚洲 视频| 老司机午夜福利在线观看视频 | 午夜精品久久久久久毛片777| 亚洲精品在线美女| 色精品久久人妻99蜜桃| 国产精品久久久久久精品电影小说| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 久久精品人人爽人人爽视色| 91精品国产国语对白视频| 男女床上黄色一级片免费看| xxxhd国产人妻xxx| 日本黄色日本黄色录像| 高潮久久久久久久久久久不卡| 人妻一区二区av| av一本久久久久| 国产真人三级小视频在线观看| 最新在线观看一区二区三区| 91成人精品电影| 性少妇av在线| 国产深夜福利视频在线观看| 国产麻豆69| 欧美+亚洲+日韩+国产| 久久久国产成人免费| 激情视频va一区二区三区| 老鸭窝网址在线观看| 手机成人av网站| 亚洲七黄色美女视频| 一区二区三区乱码不卡18| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 黄色毛片三级朝国网站| 十八禁网站网址无遮挡| xxxhd国产人妻xxx| 国产欧美亚洲国产| 91精品国产国语对白视频| 日本黄色日本黄色录像| 国产精品电影一区二区三区 | 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 美女视频免费永久观看网站| 69精品国产乱码久久久| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 18禁观看日本| 日本vs欧美在线观看视频| 嫩草影视91久久| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 啪啪无遮挡十八禁网站| 久久国产精品影院| 超色免费av| 亚洲熟女毛片儿| 日韩大码丰满熟妇| 麻豆成人av在线观看| 久久免费观看电影| 在线观看免费视频日本深夜| 久久午夜亚洲精品久久| 纯流量卡能插随身wifi吗| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 亚洲国产成人一精品久久久| 三级毛片av免费| 嫩草影视91久久| 国产国语露脸激情在线看| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 日韩大片免费观看网站| 国产一区有黄有色的免费视频| 国产亚洲欧美精品永久| 日韩欧美一区视频在线观看| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 国产1区2区3区精品| 黄色视频,在线免费观看| 亚洲专区字幕在线| 国产成人精品久久二区二区91| 欧美精品亚洲一区二区| 亚洲人成电影观看| 欧美日韩亚洲高清精品| 日本vs欧美在线观看视频| 妹子高潮喷水视频| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 2018国产大陆天天弄谢| 免费在线观看日本一区| 国产xxxxx性猛交| 青草久久国产| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 久久久水蜜桃国产精品网| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 自线自在国产av| 又大又爽又粗| 老司机深夜福利视频在线观看| 欧美日本中文国产一区发布| 男女高潮啪啪啪动态图| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 男女边摸边吃奶| 亚洲专区字幕在线| 99re6热这里在线精品视频| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 亚洲伊人色综图| 一区二区三区精品91| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 夜夜爽天天搞| 中文亚洲av片在线观看爽 | www.熟女人妻精品国产| 亚洲第一青青草原| xxxhd国产人妻xxx| 女人久久www免费人成看片| 91九色精品人成在线观看| 满18在线观看网站| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 人成视频在线观看免费观看| 亚洲熟女毛片儿| 后天国语完整版免费观看| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 老司机午夜十八禁免费视频| 日本欧美视频一区| 国产精品 欧美亚洲| 亚洲av美国av| 啦啦啦在线免费观看视频4| 国产成人精品在线电影| av电影中文网址| 啪啪无遮挡十八禁网站| 国产精品久久久久久精品古装| 在线观看免费午夜福利视频| 三上悠亚av全集在线观看| 亚洲国产av新网站| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 90打野战视频偷拍视频| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 这个男人来自地球电影免费观看| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 国产成人欧美在线观看 | 精品免费久久久久久久清纯 | 考比视频在线观看| 国产一区二区 视频在线| 国产欧美亚洲国产| 成人永久免费在线观看视频 | 男人舔女人的私密视频| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 一区福利在线观看| 国产高清国产精品国产三级| 色94色欧美一区二区| 五月天丁香电影| 欧美日韩成人在线一区二区| 大型黄色视频在线免费观看| 精品久久蜜臀av无| 少妇被粗大的猛进出69影院| 国产成人免费无遮挡视频| 国产一区二区三区在线臀色熟女 | 国产1区2区3区精品| 黄频高清免费视频| 成人特级黄色片久久久久久久 | 欧美日韩亚洲高清精品| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 国产主播在线观看一区二区| 国产成人免费无遮挡视频| 性色av乱码一区二区三区2| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| av视频免费观看在线观看| 久久国产亚洲av麻豆专区| 69av精品久久久久久 | 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 18禁国产床啪视频网站| 色播在线永久视频| 中亚洲国语对白在线视频| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 岛国毛片在线播放| 成年人午夜在线观看视频| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 搡老岳熟女国产| 高潮久久久久久久久久久不卡| 一夜夜www| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 国产97色在线日韩免费| 亚洲av美国av| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 欧美成狂野欧美在线观看| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 午夜免费鲁丝| 满18在线观看网站| 老司机靠b影院| 精品欧美一区二区三区在线| 亚洲熟妇熟女久久| 岛国在线观看网站| 国产熟女午夜一区二区三区| 精品视频人人做人人爽| 91精品国产国语对白视频| a级毛片在线看网站| 亚洲专区中文字幕在线| 亚洲国产中文字幕在线视频| 一个人免费在线观看的高清视频| 日韩一区二区三区影片| 操美女的视频在线观看| 人妻一区二区av| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 男人舔女人的私密视频| 国产单亲对白刺激| 人妻一区二区av| 91九色精品人成在线观看| 在线看a的网站| 一级a爱视频在线免费观看| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 成人精品一区二区免费| 又大又爽又粗| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| av国产精品久久久久影院| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 99国产极品粉嫩在线观看| 搡老乐熟女国产| 色94色欧美一区二区| 在线观看免费视频日本深夜| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 国产欧美日韩精品亚洲av| 色老头精品视频在线观看| 黄色片一级片一级黄色片| 国产欧美日韩一区二区三| 中文字幕精品免费在线观看视频| 美女主播在线视频| 99re在线观看精品视频| 中文字幕av电影在线播放| 亚洲精华国产精华精| 精品亚洲成a人片在线观看| 色视频在线一区二区三区| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 男女无遮挡免费网站观看| 亚洲 国产 在线| 亚洲色图av天堂| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| av网站在线播放免费| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 色在线成人网| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 高清欧美精品videossex| 在线永久观看黄色视频| 两人在一起打扑克的视频| 国产精品影院久久| 超色免费av| 高清欧美精品videossex| 午夜福利在线免费观看网站| 91老司机精品| 午夜福利视频精品| 女性被躁到高潮视频| 黄色视频,在线免费观看| 9191精品国产免费久久| 久久久欧美国产精品|