接觸環(huán)氧乙烷醫(yī)務(wù)人員尿液中N-乙?；?S-(2-羥乙基)-L-半胱氨酸水平測定方法研究*

熊曉蕓，姜秋霞，楊飛朋

1.江蘇省疾病預(yù)防控制中心職業(yè)病防治所檢驗(yàn)科，江蘇南京 210028；2.江蘇省中醫(yī)院大外科，江蘇南京 210004

環(huán)氧乙烷(EO)，又名氧化乙烯，是一種最簡單的環(huán)醚，在常溫下為無色帶有刺激性氣味的氣體，蒸汽壓高，30 ℃時(shí)可達(dá)141 kPa。高蒸汽壓特性使得EO作為消毒劑熏蒸消毒時(shí)穿透力較強(qiáng)，且不損害滅菌物品，被醫(yī)療機(jī)構(gòu)廣泛應(yīng)用于醫(yī)療用品諸如繃帶、縫線及手術(shù)器具等的消毒中。但EO具有致突變性、胎兒毒性和致畸特性，對睪丸功能具有不良影響，并能對體內(nèi)多個(gè)器官系統(tǒng)產(chǎn)生損傷。人體長期少量接觸EO可引起神經(jīng)衰弱綜合征和植物神經(jīng)功能紊亂。世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機(jī)構(gòu)已將EO列為1類致癌物。消毒后的醫(yī)療用品會(huì)有一定水平的EO殘留，《醫(yī)療器械生物學(xué)評價(jià)第7部分：環(huán)氧乙烷滅菌殘留量》[1]中規(guī)定，短期、長期和持久接觸器械EO殘留量的平均日劑量不應(yīng)超過4 mg/d、2 mg/d和0.1 mg/d。我國醫(yī)護(hù)群體近880萬人，該群體在日常工作中長期、頻繁接觸EO消毒后的醫(yī)療用品，導(dǎo)致的職業(yè)暴露、職業(yè)損傷時(shí)有報(bào)道[2-7]。國內(nèi)外都制定了EO職業(yè)接觸限值，《工作場所空氣有毒物質(zhì)測定方法：環(huán)氧化合物》[8]中規(guī)定了工作場所空氣中EO的采集和測定方法，通過個(gè)體采樣的方式可有效評估醫(yī)務(wù)人員經(jīng)呼吸道吸入的EO暴露量，未考慮皮膚、黏膜等接觸產(chǎn)生的暴露，本研究通過測定EO在尿液中的生物標(biāo)志物N-乙酰基-S-(2-羥乙基)-L-半胱氨酸(HEMA)水平以評估該群體實(shí)際內(nèi)暴露水平。已有多項(xiàng)研究報(bào)道了尿液中HEMA測定的方法[9-11]。本研究參考已報(bào)道的方法，根據(jù)國內(nèi)同類實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)況，優(yōu)化了尿液中HEMA的測定方法，初步應(yīng)用于評估接觸EO醫(yī)務(wù)人員的職業(yè)暴露情況。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2020年8月江蘇省中醫(yī)院日常工作中接觸、使用EO消毒醫(yī)療用品的12名手術(shù)室器械護(hù)士作為試驗(yàn)組，均為女性，年齡21～33歲；另選取同期未接觸EO消毒醫(yī)療用品的12名放射科醫(yī)護(hù)志愿者作為對照組，均為女性，年齡23～35歲，兩組年齡比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

1.2儀器與試劑 超高效液相色譜儀(UPLC)(30A，日本島津公司)，配備三重四極桿質(zhì)譜(QTRAP 5500，美國AB公司)；Acquity UPLC BEH C18液相色譜柱(100 mm ×2.1 mm，1.7 μm，美國Waters公司)；Millipore純水機(jī)；SIGMA臺式離心機(jī)。HEMA標(biāo)準(zhǔn)品(純度大于98%，美國TRC公司)；甲醇(色譜純，德國Merck公司)；甲酸(A.R，南京化學(xué)試劑有限公司)；乙腈(色譜純，德國Merck公司)、乙酸(色譜純，上海Aladdin公司)；流動(dòng)相用水為去離子水。

1.3方法

1.3.1溶液配制 (1)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(1 000 μg/mL)：稱取10 mg HEMA標(biāo)準(zhǔn)品于10 mL容量瓶中，用10%甲醇溶液溶解，定容后-20 ℃冷凍避光保存。(2)標(biāo)準(zhǔn)中間液(100 μg/mL)：取1 mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于10 mL容量瓶中，用10%甲醇溶液稀釋，定容后4 ℃冷藏避光保存。(3)0.2%乙酸水溶液：2 mL乙酸用去離子水定容至1 L，用作流動(dòng)相水相。

1.3.2標(biāo)本制備 收集兩組研究對象工作日24 h尿液(甲苯防腐)，分別混勻后取出部分尿樣分裝到5支10 mL標(biāo)本管中，與剩余尿樣一并冷凍保存；測定前取其中1支分裝至標(biāo)本管，室溫下解凍，混合均勻后取1.0 mL的尿液，加20 μL的甲酸酸化，12 000 r/min離心10 min，上清液過0.22 μm微孔濾膜；移取200 μL濾液至棕色進(jìn)樣瓶中，加800 μL 0.2%甲酸水溶液，混勻后待測。

1.3.3儀器條件 (1)色譜條件：流動(dòng)相為0.2%乙酸水溶液和乙腈，采用梯度洗脫程序，乙腈的體積分?jǐn)?shù)在0.0～<1.0 min內(nèi)為5%，1.0～<4.0 min內(nèi)線性增加至95%，4.0～<5.0 min內(nèi)維持在95%，5.0～5.5 min內(nèi)線性減少至5%，平衡至6.0 min結(jié)束；流量為0.5 mL/min；柱溫箱設(shè)定為40 ℃；進(jìn)樣2.0 μL，保留時(shí)間為1.74 min。(2)質(zhì)譜條件：采用電噴霧離子源，負(fù)離子掃描，多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式；將10 μg/mL HEMA標(biāo)準(zhǔn)溶液注入三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀的一級質(zhì)譜中并進(jìn)行掃描，選擇確定化合物分子離子峰豐度最大的質(zhì)譜條件；再在二級質(zhì)譜中進(jìn)行子離子掃描，調(diào)整優(yōu)化碰撞能量，在保證子離子分辨率的前提下獲得最佳靈敏度；HEMA分子結(jié)構(gòu)中存在羧基，電離方式采取電噴霧離子源質(zhì)譜；根據(jù)色譜條件優(yōu)化后的保留時(shí)間(1.74 min)截取1.0～2.5 min流動(dòng)相進(jìn)質(zhì)譜儀；噴霧電壓-4.5 kV；離子源溫度540 ℃；霧化氣流量8.4 L/min，氣簾氣流量30.5 L/min，輔助霧化氣流量6.8 L/min，錐孔電壓為-40 V；母離子m/z為206，子離子m/z分別為75和77(定量離子)，碰撞能量分別為-34 eV和-18 eV。

1.3.4定量方式 分別使用去離子水和空白尿液(經(jīng)上述標(biāo)本制備程序處理，HEMA水平小于方法檢測限)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線和工作曲線，HEMA在0.1～100.0 μg/mL內(nèi)，工作曲線的斜率為標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率的70%，存在較強(qiáng)的基質(zhì)效應(yīng)，確定采用工作曲線法來定量。

1.3.5方法學(xué)參數(shù)測定 按照《職業(yè)衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)制定指南第5部分:生物材料中化學(xué)物質(zhì)測定方法》[12]中“測定方法性能指標(biāo)的試驗(yàn)”相關(guān)要求進(jìn)行方法學(xué)參數(shù)的確定。線性范圍、檢出限:用上述空白尿液繪制工作曲線,以定量離子峰面積與HEMA水平作工作曲線?；厥章逝c精密度:用空白尿液加標(biāo),添加水平至5.0、20.0、80.0 μg/mL(方法測定范圍內(nèi)低、中、高水平),各做6個(gè)平行,經(jīng)前處理后上機(jī)測定。

2 結(jié) 果

2.1質(zhì)量色譜圖 在上述色譜、質(zhì)譜條件下，HEMA峰型良好，保留時(shí)間為1.74 min，見圖1。

圖1 HEMA加標(biāo)樣品質(zhì)量色譜圖

2.2方法學(xué)參數(shù)測定結(jié)果 HEMA的線性范圍為在0.1 ～100.0 μg/mL ,相關(guān)系數(shù)為0.999 1;3倍信噪比計(jì)算的方法檢出限為0.03 μg/mL,10倍信噪比計(jì)算的方法定量限為0.1 μg/mL。當(dāng)加標(biāo)水平為5.0、20.0、80.0 μg/mL時(shí)，加標(biāo)回收率為91.6%～94.7%,批內(nèi)精密度為4.7%～7.2%,連續(xù)測定3 d的批間精密度為4.5%～8.1%。

2.3試驗(yàn)組與對照組尿液中HEMA水平比較 對照組尿液中HEMA的水平為(1.44±0.29) μg/g肌酐，試驗(yàn)組尿液中HEMA水平為(2.30±1.45) μg/g肌酐，兩組HEMA水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 對照組、試驗(yàn)組尿液中HEMA水平比較

3 討 論

《工作場所有害因素職業(yè)接觸限值第1部分：化學(xué)有害因素》[13]中EO的時(shí)間加權(quán)平均容許水平(PC-TWA)為2 mg/m3，且提示EO除通過吸入接觸外，還可通過皮膚、黏膜和眼睛直接接觸，經(jīng)完整的皮膚吸收而引起全身效應(yīng)，即使空氣中EO的水平≤PC-TWA，勞動(dòng)者仍有可能通過皮膚接觸而引起過量接觸。醫(yī)護(hù)人員在日常工作中，皮膚、黏膜會(huì)長期、頻繁接觸消毒后醫(yī)療用品殘留的EO及其蒸氣，現(xiàn)有的測定方法僅關(guān)注吸入接觸，無法完整評估醫(yī)護(hù)群體的實(shí)際暴露水平?，F(xiàn)有研究普遍認(rèn)為，HEMA是EO在尿液中的主要代謝產(chǎn)物，丙烯腈、1,2-二溴乙烷和氯乙烯也可以通過代謝產(chǎn)生HEMA，但醫(yī)護(hù)人員一般不會(huì)接觸[9-11]。本研究將HEMA作為醫(yī)護(hù)人員EO職業(yè)暴露的生物標(biāo)志物，通過測定其在尿液中的水平來評估該群體真實(shí)內(nèi)暴露水平。

健康人24 h尿量為0.8～2.0 L，收集研究對象工作日24 h尿液(甲苯防腐)，測定其中的HEMA水平，可準(zhǔn)確評估其EO內(nèi)暴露水平；混勻后采取小體積分裝方式冷凍保存便于單指標(biāo)重復(fù)測定及多指標(biāo)測定的開展，避免大體積標(biāo)本的反復(fù)凍融造成待測物損失及標(biāo)本基質(zhì)情況的改變。目前主流UPLC配備的色譜柱填料粒徑普遍不超過2 μm(本研究所用色譜柱填料粒徑為1.7 μm)，分離能力得到極大提升，搭配三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜，可有效控制質(zhì)譜檢測的離子抑制現(xiàn)象并降低待測物的檢出限，為在樣品前處理方式中采取酸化、離心、過濾、稀釋后直接上機(jī)測定的方法提供了技術(shù)支撐，為國內(nèi)未購置自動(dòng)固相萃取儀的實(shí)驗(yàn)室開展相關(guān)檢測提供簡便、有效的解決方案。以去離子水搭配有機(jī)溶劑作為流動(dòng)相時(shí)，HEMA峰型較差；在水相中加入乙酸并逐步提高比例至0.2%時(shí)，峰型得到最佳優(yōu)化；在甲醇、乙腈兩種常用有機(jī)溶劑作為有機(jī)相過程中，使用乙腈與使用甲醇響應(yīng)值無明顯區(qū)別，但乙腈因具有較強(qiáng)的洗脫能力，在縮短分析時(shí)間的同時(shí)能實(shí)現(xiàn)基線較好分離。本研究結(jié)果顯示，試驗(yàn)組與對照組的尿液中HEMA水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，提示兩種可能：(1)對照組檢出水平反映了人群尿液中HEMA基礎(chǔ)水平，試驗(yàn)組EO內(nèi)暴露水平極低，后續(xù)可通過擴(kuò)大試驗(yàn)組崗位類別及調(diào)查范圍進(jìn)一步評估該群體EO內(nèi)暴露水平；(2)對照組檢出水平未能反映人群尿液中HEMA基礎(chǔ)水平，對照組對象存在其他行為造成非EO接觸導(dǎo)致的HEMA水平升高，除接觸丙烯腈、1,2-二溴乙烷和氯乙烯等化學(xué)物質(zhì)外，有文獻(xiàn)報(bào)道吸煙也可導(dǎo)致尿液中HEMA水平升高[14]，后續(xù)可通過問卷調(diào)查的方式全面了解擬納入人群是否有可能影響HEMA水平升高的生活方式和相關(guān)化學(xué)物質(zhì)的接觸可能，確保研究中對照組檢出水平能真實(shí)反映人群尿液中HEMA基礎(chǔ)水平，再通過擴(kuò)大試驗(yàn)組崗位類別及調(diào)查范圍等方式保證該群體EO真實(shí)內(nèi)暴露水平得到準(zhǔn)確評估。

本研究通過建立簡便實(shí)用、便于推廣的方法測定接觸EO醫(yī)務(wù)人員尿液中HEMA水平，初步獲得12名接觸EO醫(yī)務(wù)人員尿液中的HEMA水平，為準(zhǔn)確評估研究群體EO真實(shí)內(nèi)暴露水平提供了可靠的技術(shù)方案，暴露水平的準(zhǔn)確評估能為衛(wèi)生健康管理部門的決策提供參考，也為我國醫(yī)療機(jī)構(gòu)建設(shè)相關(guān)防護(hù)設(shè)施，配備相關(guān)防護(hù)用品，更好地保護(hù)接觸EO醫(yī)護(hù)群體健康提供準(zhǔn)確數(shù)據(jù)支撐。

綜上所述，通過優(yōu)化前處理方式、色譜條件、質(zhì)譜參數(shù)及定量方式，本研究所使用方法的線性范圍、檢出限、回收率與精密度等主要性能指標(biāo)均滿足《職業(yè)衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)制定指南第5部分：生物材料中化學(xué)物質(zhì)測定方法》的要求，適用于接觸EO醫(yī)務(wù)人員尿液中HEMA水平的測定，所需儀器設(shè)備均較常見，便于推廣。