應(yīng)用酶聯(lián)抗體檢測系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者血清抗體的有效性分析*

賴立川，吳榮才，蒙丹麗，王浜琴△

廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院：1.檢驗科；2.風(fēng)濕免疫科，廣西南寧 530021

我國系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)發(fā)病率約為70/10萬，20～40歲育齡期女性是其高發(fā)人群[1-4]。SLE的發(fā)病機制較為復(fù)雜，大量研究證實，SLE患者體內(nèi)存在多種自身抗體，故自身抗體檢測已逐漸成為診斷SLE及評估腎功能損害的參考項目之一[5-7]。其中抗雙鏈DNA(dsDNA)抗體、抗史密斯(Sm)抗體已被證實可用于SLE的診斷。而抗核小體抗體(AnuA)與核小體可形成免疫復(fù)合物，參與機體免疫炎性反應(yīng)，同時，抗磷脂抗體可刺激機體免疫系統(tǒng)，但關(guān)于酶聯(lián)抗體檢測上述血清抗體對SLE疾病活動度的評估價值研究較少?；诖?，本研究應(yīng)用酶聯(lián)抗體檢測SLE多個血清抗體，并量化分析各抗體診斷SLE及評估疾病活動度的價值，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2018年1月至2020年3月本院收治的88例SLE患者(SLE組)及88例體檢健康者(對照組)為研究對象。根據(jù)系統(tǒng)性紅斑狼瘡疾病活動性指數(shù)(SLEDAI)評分將SLE組分為輕度活動組(46例)、中度活動組(27例)、重度活動組(15例)，輕度活動為臨床穩(wěn)定，無明顯內(nèi)臟損害，SLEDAI評分<10分；中度活動為SLE明顯累及重要臟器且需治療，SLEDAI評分為10～14分；重度活動為SLE累及重要臟器，SLEDAI評分≥15分。SLE組男43例，女45例，平均年齡(43.66±12.15)歲，平均體質(zhì)量指數(shù)(BMI)為(23.49±2.25)kg/m2；對照組男40例，女48例，平均年齡(45.09±11.86)歲，平均BMI為(23.61±2.14)kg/m2。兩組間年齡、性別、BMI等一般資料比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。納入標準：(1)SLE組均符合SLE診斷標準[8]，滿足以下11項中4項或4項以上即可確診，包括頰部紅斑、盤狀紅斑、光過敏、口腔潰瘍、關(guān)節(jié)炎、漿膜炎、腎臟病變、神經(jīng)病變、血液學(xué)疾病、免疫學(xué)異常、抗核抗體陽性；(2)對照組無自身免疫性疾病、血栓事件等。排除標準：(1)急慢性感染者；(2)處于妊娠期、產(chǎn)褥期或哺乳期等特殊時期的女性；(3)合并類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎或其他風(fēng)濕性疾病者；(4)合并肝、腎等重要臟器器質(zhì)性病變者；(5)伴有再生障礙性貧血、白血病或其他血液系統(tǒng)疾病者；(6)近14 d內(nèi)服用過激素、免疫抑制劑等影響檢測結(jié)果的藥物；(7)合并嚴重聽力障礙、失語或精神行為異常者。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準，所有研究對象均簽署知情同意書。

1.2方法 兩組研究對象入院后24 h內(nèi)于清晨8:00空腹抽取靜脈血5 mL，1 000×g離心20 min(離心半徑10 cm)，分離取血清，置于-20 ℃低溫保存，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測血清抗dsDNA抗體、AnuA、抗Sm抗體、抗β2糖蛋白1(β2GP1)抗體、抗心磷脂抗體(ACA)，嚴格參照南京賽泓瑞生物科技有限公司提供的試劑盒說明書操作，具體過程如下。(1)準備工作：將所需試劑及標本均平衡放置在20～26 ℃室溫下，充分混勻，以1∶40對辣根過氧化物酶(HRP)清洗濃縮液進行稀釋，并設(shè)置復(fù)孔。(2)標本檢測：將預(yù)先稀釋的抗dsDNA抗體(1 mL)、AnuA(1 mL)、抗Sm抗體(1 mL)及抗磷脂抗體ELISA低值陽性對照、高值陽性對照、陰性對照及稀釋后血清標本分別置入微孔板，室溫條件下孵育30 min。棄去孔內(nèi)液體，并于各孔內(nèi)加入稀釋后洗滌液(300 μL)，吸除液體。重復(fù)上述清洗步驟2次后，于各孔內(nèi)均加入HRP IgG酶結(jié)合物(100 μL)，室溫條件下孵育30 min，重復(fù)上述清洗步驟。各孔內(nèi)均加入3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺底物液(100 μL)，室溫條件下避光孵育30 min。最后各孔內(nèi)均加入HRP終止液(100 μL)，終止反應(yīng)后60 min內(nèi)于450 nm處讀取各孔吸光度值。

1.3觀察指標 (1)比較兩組血清抗dsDNA抗體、AnuA、抗Sm抗體、IgG-β2GP1、IgM-β2GP1、IgG-ACA、IgM-ACA水平。(2)分析血清抗dsDNA抗體、AnuA、抗Sm抗體、IgG-β2GP1、IgM-β2GP1、IgG-ACA、IgM-ACA對SLE的診斷效能。(3)比較SLE組不同疾病活動度患者血清抗dsDNA抗體、AnuA、抗Sm抗體、IgG-β2GP1、IgM-β2GP1、IgG-ACA、IgM-ACA水平。(4)分析血清抗dsDNA抗體、AnuA、抗Sm抗體、IgG-β2GP1、IgM-β2GP1、IgG-ACA、IgM-ACA水平與SLEDAI評分的相關(guān)性。(5)分析血清抗dsDNA抗體、AnuA、抗Sm抗體、IgG-β2GP1、IgM-β2GP1、IgG-ACA、IgM-ACA評估SLE疾病活動度的效能。

2 結(jié) 果

2.1兩組血清抗體水平比較 SLE組抗dsDNA抗體、AnuA、抗Sm抗體、IgG-β2GP1、IgM-β2GP1、IgG-ACA、IgM-ACA水平高于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 兩組血清抗體水平比較

2.2各血清抗體診斷SLE的效能 ROC曲線分析顯示，抗Sm 抗體、IgG-β2GP1、AnuA、IgG-ACA、抗dsDNA 抗體、IgM-ACA、IgM-β2GP1診斷SLE 的曲線下面積(AUC)分別為0.839、0.837、0.831、0.811、0.809、0.761、0.741，特異度分別為87.50%、90.91%、90.91%、94.32%、90.91%、90.91%、93.18%。見圖1。

注：A為AnuA、抗dsDNA抗體、抗Sm抗體診斷SLE的ROC曲線；B為IgG-ACA 、IgG-β2GP1、IgM-ACA、 IgM-β2GP1診斷SLE的ROC曲線。

2.3SLE組不同疾病活動度患者血清抗體水平比較 抗dsDNA抗體、AnuA、IgG-β2GP1、IgM-β2GP1、IgG-ACA、IgM-ACA水平比較，重度活動組高于中度、輕度活動組，中度活動組高于輕度活動組(P<0.05)；抗Sm抗體在不同疾病活動度患者間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 SLE組疾病不同活動度患者各血清抗體水平比較

2.4各血清抗體與SLEDAI評分的相關(guān)性 Pearson相關(guān)分析顯示，抗dsDNA抗體(r=0.782)、AnuA(r=0.752)、IgG-β2GP1(r=0.913)、IgM-β2GP1(r=0.938)、IgG-ACA(r=0.940)、IgM-ACA(r=0.975)均與SLEDAI評分呈正相關(guān)(P<0.05)。

2.5各血清抗體評估SLE疾病活動度的效能 ROC曲線分析顯示，抗dsDNA抗體評估輕、中度活動的AUC為0.780，重度活動的AUC為0.819；AnuA評估輕、中度活動的AUC為0.791，重度活動的AUC為0.801；IgG-β2GP1評估輕、中度活動的AUC為0.744，重度活動的AUC為0.792；IgM-β2GP1評估輕、中度活動的AUC為0.708，重度活動的AUC為0.750；IgG-ACA評估輕、中度活動的AUC為0.771，重度活動的AUC為0.792；IgM-ACA評估輕、中度活動的AUC為0.783，重度活動的AUC為0.815。見圖2、3。

注：A為AnuA、抗dsDNA抗體評估輕、中度活動的ROC曲線； B為IgG-ACA 、IgG-β2GP1、IgM-ACA、 IgM-β2GP1評估輕、中度活動的ROC曲線。

注：A為AnuA、抗dsDNA抗體評估重度活動的ROC曲線； B為IgG-ACA 、IgG-β2GP1、IgM-ACA、 IgM-β2GP1評估重度活動的ROC曲線。

3 討 論

SLE的發(fā)病機制迄今尚未完全闡明，研究顯示，SLE的發(fā)病過程中往往伴有T細胞參與和B細胞活化，一定程度上會侵犯多個器官與組織，產(chǎn)生多種免疫復(fù)合物，引起機體免疫調(diào)節(jié)紊亂，導(dǎo)致局部或全身性損傷[9-10]。同時，SLE患者外周血凋亡淋巴細胞會過度釋放自身抗原，產(chǎn)生一系列自身抗體[11-12]。因此，早期檢測自身抗體水平對輔助診治SLE具有積極作用。

抗Sm抗體是公認的SLE標記性抗體，在臨床應(yīng)用較為廣泛。本研究經(jīng)ROC曲線分析發(fā)現(xiàn)，抗Sm抗體診斷SLE的效能優(yōu)于抗dsDNA抗體、AnuA及抗磷脂抗體，特異度可達87.50%，與張樹君[13]研究結(jié)果一致。但SLE患者中抗Sm抗體陽性者僅約30%，故抗Sm抗體陰性時無法排除SLE診斷，且單純檢測抗Sm抗體具有一定局限性，靈敏度較低[14-15]。同時，本研究結(jié)果顯示抗Sm抗體與SLE患者疾病活動度無關(guān)，與張宗瑋等[16]研究結(jié)果不一致，可能與納入患者數(shù)量及SLE病情有關(guān)，有待進一步研究。

抗dsDNA抗體是SLE的分類標準之一，2012年通過SLE國際臨床協(xié)作組(SLICC)驗證成為獨立診斷SLE的血清免疫學(xué)指標，并作為監(jiān)測疾病進展的重要指標[17]。AnuA是SLE診斷的標記性抗體，國內(nèi)動物實驗表明，核小體能刺激機體產(chǎn)生AnuA，并誘導(dǎo)抗dsDNA抗體與組蛋白抗體生成[18]。本研究結(jié)果顯示，SLE患者血清抗dsDNA抗體、AnuA水平升高，與王之青等[19]、邢紅宇等[20]研究觀點相似，分析機制在于，抗dsDNA抗體通過與腎小球系膜細胞結(jié)合，參與細胞核內(nèi)成分反應(yīng)，誘導(dǎo)細胞凋亡，損傷腎臟，誘發(fā)狼瘡性腎炎，同時SLE患者機體免疫系統(tǒng)異常，導(dǎo)致核小體在體內(nèi)異常堆積，繼而刺激機體產(chǎn)生AnuA，從而引起腎組織損傷。進一步經(jīng)Pearson相關(guān)性分析可知，抗dsDNA抗體、AnuA均與SLEDAI評分呈正相關(guān)，結(jié)合孫佳瑩等[21]、麻貞貞等[22]研究推測機制在于，細胞死亡過程中會促使碎片結(jié)構(gòu)釋放，產(chǎn)生免疫逃逸，而抗原可刺激自身免疫淋巴細胞、漿細胞的分化，誘導(dǎo)自身抗體產(chǎn)生并形成免疫復(fù)合物，隨血液循環(huán)在腎小球基底膜及系膜區(qū)大量沉積，進而刺激補體系統(tǒng)釋放大量相關(guān)細胞因子，過度消耗補體，從而增加急性腎功能衰竭的發(fā)生風(fēng)險，加重病情。因此，早期明確SLE患者血清抗dsDNA抗體、AnuA水平，可為臨床制訂個性化診療方案、控制疾病活動度提供有效輔助手段。最后，本研究經(jīng)ROC曲線還發(fā)現(xiàn)，抗dsDNA抗體、AnuA診斷SLE的特異度均為90.91%，與李和軍等[23]采用免疫印跡法檢測的研究結(jié)果具有一致性，有力佐證了ELISA應(yīng)用于抗dsDNA抗體、AnuA檢測與免疫印跡法具有相似的特異度，但ELISA更加簡便，易于批量操作，獲取客觀結(jié)果。

另外，由于抗磷脂抗體臨床表現(xiàn)缺乏特異性，故診斷依賴于ACA、抗β2GP1抗體等實驗室檢測。根據(jù)2006年抗磷脂綜合征(APS)悉尼國際分類標準，IgG、IgM亞型的ACA、抗β2GP1抗體均為APS的診斷標志物[24]。本研究通過對比研究可知，與體檢健康者比較，SLE患者IgG-β2GP1、IgM-β2GP1、IgG-ACA、IgM-ACA水平更高，這可能是由于SLE患者存在廣泛血管病變，血管壁損傷會刺激凝血系統(tǒng)，增強纖溶酶原激活抑制物活性，改變血栓調(diào)節(jié)蛋白活性，抑制蛋白C活化，引發(fā)獲得性抗活化蛋白C現(xiàn)象[25-26]。同時，本研究結(jié)果還表明，隨著SLE疾病活動度加重，血清IgG-β2GP1、IgM-β2GP1、IgG-ACA、IgM-ACA水平出現(xiàn)升高趨勢，這與廖永強等[27]觀點相似，可能歸因于SLE患者體內(nèi)存在較強的補體活化，補體C3、C4水平顯著降低，從而參與炎性反應(yīng)，上調(diào)體內(nèi)多種炎癥因子表達，引發(fā)內(nèi)皮損傷，加重凝血-纖溶系統(tǒng)紊亂，引起繼發(fā)性APS，表現(xiàn)為反復(fù)形成動靜脈血栓、紅細胞功能異常等，加重組織與器官損傷[28]。進一步經(jīng)ROC曲線分析可知，ACA、抗β2GP1抗體對SLE疾病活動度具有較高的評估價值。說明早期采用酶聯(lián)抗體檢測抗磷脂抗體水平，對評估SLE疾病活動度、預(yù)防臟器損傷具有指導(dǎo)意義。但其是否能作為反映SLE患者疾病嚴重程度及預(yù)后的生物標志物，今后仍需進行大樣本量、多中心的研究。

綜上所述，SLE患者血清抗dsDNA抗體、AnuA、抗Sm抗體及抗磷脂抗體水平明顯升高，且抗dsDNA抗體、AnuA及抗磷脂抗體水平與SLEDAI評分呈正相關(guān)，早期采用酶聯(lián)抗體檢測上述自身抗體水平，對SLE的診斷、疾病活動度評估具有重要意義。