膠體金免疫層析法檢測(cè)隱球菌莢膜抗原的診斷價(jià)值及隱球菌病患者的臨床特征分析*

張曉慧，陸燕飛，許雨喬，倪 芳，劉根焰，夏文穎

南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)學(xué)部，江蘇南京 210029

隱球菌病是由隱球菌引起的一種亞急性或慢性深部真菌病。隱球菌屬中對(duì)人致病的主要是新生隱球菌和格特隱球菌。格特隱球菌感染好發(fā)于免疫功能正常的人群，且具有明顯的地域性，如熱帶、亞熱帶地區(qū)，我國(guó)則以新生隱球菌感染為主[1]。新生隱球菌為條件致病菌，廣泛存在于土壤、干鴿糞、灰塵、人體體表、口腔和腸道中，可經(jīng)呼吸道侵入人體，隨血流播散至腦及腦膜，也可侵犯皮膚、骨和其他臟器[2]。

新生隱球菌菌體周圍有一圈肥厚的莢膜，是其主要的致病物質(zhì)。作為其特有的分泌物，隱球菌莢膜多糖抗原的檢測(cè)可為隱球菌感染的診斷提供依據(jù)。膠體金免疫層析法(CrAg-LFA)是近年新興的一種輔助診斷隱球菌病的檢測(cè)方法，具有簡(jiǎn)單、快速、特異度高、靈敏度高等特點(diǎn)[3]。本研究應(yīng)用CrAg-LFA檢測(cè)隱球菌莢膜多糖抗原，探討其在隱球菌病診斷中的應(yīng)用價(jià)值，同時(shí)對(duì)隱球菌病患者的臨床特征進(jìn)行了分析。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2018年6月至2020年6月于南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院行隱球菌莢膜抗原檢測(cè)的住院患者1 623例作為研究對(duì)象，其中男968例，女655例,送檢血清1 349例，腦脊液(CSF)226例，同時(shí)送檢血清和CSF 48例。隱球菌病診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《侵襲性真菌病定義共識(shí)的修訂和更新(2019年歐洲癌癥研究和治療組織/侵襲性真菌感染協(xié)作組第三版指南更新)》[4]《隱球菌病處理臨床實(shí)踐指南(2010年美國(guó)感染病學(xué)會(huì)更新)》[5]和《肺隱球菌病診治浙江省專家共識(shí)》[1]。確診患者均有病原學(xué)證據(jù)，包括活組織病理檢查、病灶穿刺標(biāo)本涂片和培養(yǎng)、CSF墨汁染色、真菌培養(yǎng)及莢膜抗原陽(yáng)性。結(jié)合患者臨床表現(xiàn)及典型的影像學(xué)檢查，血清CrAg-LFA檢測(cè)陽(yáng)性可臨床診斷為肺隱球菌病，并可作為開始抗隱球菌治療的依據(jù)。

1.2試劑與儀器 隱球菌莢膜多糖抗原檢測(cè)試劑盒(膠體金法)購(gòu)自美國(guó)Immuno-Mycologics公司；BACTECTMFX400全自動(dòng)血液培養(yǎng)儀(美國(guó)BD公司)；法國(guó)生物梅里埃公司VITEK2-COMPACT全自動(dòng)微生物分析儀及其配套的YST鑒定卡。操作步驟嚴(yán)格按照說(shuō)明書進(jìn)行。

1.3方法

1.3.1資料收集 收集隱球菌病患者一般資料、臨床表現(xiàn)、實(shí)驗(yàn)室檢查指標(biāo)，一般資料包括性別、年齡、吸煙史、動(dòng)物接觸史等；臨床表現(xiàn)包括無(wú)癥狀、發(fā)熱、咳嗽、胸悶/胸痛、頭痛、惡心、嘔吐等；實(shí)驗(yàn)室檢查指標(biāo)包括白細(xì)胞計(jì)數(shù)(WBC)、C反應(yīng)蛋白(CRP)、IgE測(cè)定水平、(1,3)-β-D葡聚糖檢測(cè)(G試驗(yàn))、半乳甘露聚糖抗原檢測(cè)(GM試驗(yàn))以及墨汁染色、培養(yǎng)結(jié)果等。

1.3.2隱球菌莢膜抗原檢測(cè)(膠體金法) 將1滴標(biāo)本稀釋液加入小試管內(nèi)，再加入40 μL標(biāo)本(血清或CSF)，將試紙條的白端沒(méi)入到標(biāo)本液中，10 min后讀取結(jié)果。結(jié)果判讀：僅出現(xiàn)1個(gè)對(duì)照條帶表明檢測(cè)結(jié)果為陰性，出現(xiàn)2個(gè)條帶(檢測(cè)條帶和對(duì)照條帶)表明檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，若對(duì)照條帶未出現(xiàn)說(shuō)明檢測(cè)無(wú)效，需重新檢測(cè)。

2 結(jié) 果

2.1CrAg-LFA對(duì)隱球菌病的檢測(cè)結(jié)果 結(jié)果顯示，CrAg-LFA檢測(cè)總陽(yáng)性數(shù)48例，其中39例最終診斷為隱球菌病(肺隱球菌病35例，隱球菌腦膜炎2例，隱球菌敗血癥1例，播散性隱球菌病1例)，剩余9例未行進(jìn)一步確診檢查，均以“肺部感染”為出院診斷。在1 575例CrAg-LFA陰性患者中有7例確診為隱球菌病(肺隱球菌病6例，髂骨隱球菌感染1例)，剩余1 568例均排除隱球菌感染。CrAg-LFA對(duì)隱球菌病診斷的靈敏度為84.8%(39/46)，特異度為99.4%(1 568/1 577)。其中，血清CrAg-LFA在肺隱球菌病診斷中的靈敏度為85.4%(35/41)，特異度為100.0%(1 356/1 356)，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為100.0%(35/35)，陰性預(yù)測(cè)值為99.6%(1 356/1 362)，而CSF CrAg-LFA在隱球菌腦膜炎診斷中的靈敏度(2/2)和特異度(272/272)均為100.0%。見表1。

表1 CrAg-LFA對(duì)隱球菌病患者的檢測(cè)結(jié)果

2.2隱球菌病患者臨床特征分析

2.2.1一般資料 46例隱球菌病患者中65.2%(30/46)存在基礎(chǔ)疾病，有27例肺隱球菌病患者有基礎(chǔ)病史，按比例依次為高血壓病(48.1%)、慢性肝病(29.6%)、糖尿病(25.9%)、自身免疫性疾病(14.8%)、惡性腫瘤(14.8%)。此外，有14例肺隱球菌病患者無(wú)基礎(chǔ)疾病。41例肺隱球菌病患者中，33例患者通過(guò)經(jīng)皮肺穿刺活檢病理結(jié)果得以確診，8例通過(guò)CrAg-LFA檢測(cè)、典型影像學(xué)特征、臨床表現(xiàn)及治療效果等被臨床診斷為肺隱球菌病。41例肺隱球菌病患者中，男24例，女17例，年齡18～80歲，平均(47.0±12.8)歲。其中有11例患者有吸煙史，2例有明確鴿子接觸史。隱球菌腦膜炎患者共2例，男、女各1例，年齡分別為29歲和63歲，未有明顯的動(dòng)物接觸史。另有播散性隱球菌病、隱球菌敗血癥、髂骨隱球菌感染各1例，年齡分別為49歲、30歲、47歲，既往均無(wú)吸煙史及動(dòng)物接觸史。

2.2.2臨床表現(xiàn)及實(shí)驗(yàn)室檢查 在41例肺隱球菌病患者中，有23例患者因出現(xiàn)癥狀而就診，常見癥狀依次為咳嗽、胸悶/胸痛及發(fā)熱。在18例無(wú)癥狀的患者中，有14例在體檢時(shí)發(fā)現(xiàn)肺部病變，均以“肺部病灶性質(zhì)待查”為初步診斷收治入院。78%的患者就診時(shí)無(wú)明顯異常的肺部體征，部分患者可出現(xiàn)干濕啰音、呼吸音減低等。2例隱球菌腦膜炎患者中，其中1例因“發(fā)熱伴頭痛”入院，體格檢查巴賓斯基征呈陽(yáng)性，CSF檢查中WBC、葡萄糖及蛋白升高、氯化物降低。另1例因“狼瘡性腎炎”在住院期間出現(xiàn)頭痛癥狀，CSF檢查中僅出現(xiàn)蛋白升高及氯化物降低，余正常。2例患者的CSF培養(yǎng)、墨汁染色及CrAg-LFA檢測(cè)均為陽(yáng)性。見表2。

表2 主要隱球菌病患者臨床表現(xiàn)及實(shí)驗(yàn)室檢查[n/n(%)]

除以上41例肺隱球病和2例隱球菌腦膜炎外，本研究另觀察到3例隱球菌特殊感染患者。1例播散性隱球菌病患者僅有頭痛癥狀，腦膜刺激征為陰性，CSF培養(yǎng)及墨汁染色均未見到隱球菌，但其血清和CSF CrAg-LFA檢測(cè)呈陽(yáng)性，且肺穿刺組織病理檢查見到隱球菌；1例患者因隱球菌感染發(fā)生敗血癥，外周血、CSF及骨髓中均培養(yǎng)出新生隱球菌，且CSF墨汁染色及血清CrAg-LFA檢測(cè)均為陽(yáng)性；1例患者因“右下肢疼痛伴活動(dòng)受限”入院，血清CrAg-LFA檢測(cè)呈陰性，經(jīng)外科手術(shù)后病理活檢結(jié)果提示為隱球菌感染。

2.2.3治療 46例隱球菌病患者中，43例接受了抗真菌治療。肺隱球菌病患者中35例使用氟康唑，2例服用伏立康唑，病情均好轉(zhuǎn)，出院后予以序貫治療；余2例因病情危重采用了聯(lián)合治療(氟康唑+兩性霉素B)，1例患者主動(dòng)放棄治療，另1例患者回當(dāng)?shù)蒯t(yī)院治療，后隨訪患者死亡。2例隱球菌腦膜炎患者中1例因強(qiáng)烈要求出院未用藥，另1例采用了聯(lián)合治療(氟康唑+兩性霉素B脂質(zhì)體)，癥狀好轉(zhuǎn)，出院后續(xù)用氟康唑。3例隱球菌特殊感染患者均采用聯(lián)合治療，播散性隱球菌病患者予以兩性霉素B脂質(zhì)體聯(lián)合氟胞嘧啶治療，出院后繼續(xù)口服氟康唑，預(yù)后良好；隱球菌敗血癥患者經(jīng)氟康唑聯(lián)合兩性霉素B脂質(zhì)體治療不久后死亡；髂骨隱球菌感染患者手術(shù)后予以兩性霉素B脂質(zhì)體聯(lián)合伏立康唑治療，病情好轉(zhuǎn)。

3 討 論

既往流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，新生隱球菌最常見的感染部位是中樞神經(jīng)系統(tǒng)，但近年來(lái)肺隱球菌病的發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)[6]。肺隱球菌病成為繼肺曲霉菌病之后最常見的肺部真菌病變，占20%左右。由于隱球菌病患者的臨床表現(xiàn)及影像學(xué)檢查無(wú)特異性，故實(shí)驗(yàn)室病原學(xué)檢測(cè)和組織學(xué)檢查尤為重要。目前臨床開展的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法主要有墨汁染色、真菌培養(yǎng)、莢膜抗原血清學(xué)檢測(cè)，如膠乳凝集試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)等。本研究中肺隱球菌病患者痰涂片及培養(yǎng)均未檢出隱球菌，考慮可能是病灶多分布在外周，送檢標(biāo)本菌量少及標(biāo)本采集時(shí)間錯(cuò)過(guò)最佳培養(yǎng)時(shí)間等原因。有研究將傳統(tǒng)的鏡檢及培養(yǎng)法與抗原檢測(cè)進(jìn)行了比較，結(jié)果顯示前者對(duì)隱球菌的檢出率極低[7]。近年研究發(fā)現(xiàn)CrAg-LFA對(duì)隱球菌病檢測(cè)的靈敏度和特異度均高于膠乳凝集試驗(yàn)和ELISA，其對(duì)實(shí)驗(yàn)室設(shè)備的要求不高，操作簡(jiǎn)便、快速，10 min即可出結(jié)果，逐漸應(yīng)用于臨床[8]。

本研究對(duì)1 623例行CrAg-LFA檢測(cè)的住院患者進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)共有48例為陽(yáng)性，其中39例完善檢查后最終診斷為隱球菌病。本研究有7例血清CrAg-LFA檢測(cè)出現(xiàn)假陰性(6例肺隱球菌病，1例髂骨隱球菌感染)，考慮原因有肺外隱球菌負(fù)荷量較低、隱球菌莢膜缺失或感染處于早期等[9-10]。此外，日本一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)在免疫功能正常的肺隱球菌病患者中，血清CrAg-LFA檢測(cè)的陽(yáng)性率較低[11]，本研究中6例假陰性肺隱球菌病患者中有4例免疫功能正常。因此，對(duì)于免疫功能正常的肺隱球菌病患者需結(jié)合臨床表現(xiàn)、影像學(xué)和病理學(xué)檢查綜合診斷，以防漏診。

本研究發(fā)現(xiàn)CrAg-LFA檢測(cè)CSF標(biāo)本的靈敏度和特異度均為100.0%。1例播散性隱球菌病患者CSF培養(yǎng)及墨汁染色均未見到隱球菌，但CSF CrAg-LFA檢測(cè)為陽(yáng)性，給予抗真菌治療后患者的病情有明顯好轉(zhuǎn)，考慮原因?yàn)镃SF中隱球菌量較少，傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室檢查方法無(wú)法檢出。歐洲癌癥研究和治療組織/侵襲性真菌感染協(xié)作組和世界衛(wèi)生組織已推薦將CSF CrAg-LFA檢測(cè)作為隱球菌腦膜炎的首選檢查[12]，且其陽(yáng)性結(jié)果作為隱球菌腦膜炎的確診標(biāo)準(zhǔn)[4]。同時(shí)，有研究表明CrAg-LFA滴度的檢測(cè)可用于評(píng)估預(yù)后以及監(jiān)測(cè)療效[7,13]。本研究中有1例隱球菌腦膜炎患者入院時(shí)CSF墨汁染色、培養(yǎng)及CrAg-LFA檢測(cè)均陽(yáng)性，進(jìn)行抗真菌治療后，隨著臨床癥狀好轉(zhuǎn)，墨汁染色及培養(yǎng)菌量減少直至轉(zhuǎn)陰，CrAg-LFA滴度持續(xù)下降，直至完全治愈轉(zhuǎn)陰。

G試驗(yàn)和GM試驗(yàn)作為臨床真菌感染的重要實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)指標(biāo)，其診斷范圍并不包括隱球菌感染。對(duì)于懷疑肺部真菌感染的患者，當(dāng)出現(xiàn)G試驗(yàn)和GM試驗(yàn)均陰性時(shí)，應(yīng)高度懷疑是否存在隱球菌的感染，但本研究中有1例患者出現(xiàn)G試驗(yàn)陽(yáng)性，考慮可能是因隱球菌莢膜丟失導(dǎo)致細(xì)胞壁中少量(1,3)-β-D葡聚糖成分暴露。此外，本研究發(fā)現(xiàn)55.6%的肺隱球菌病患者出現(xiàn)了總IgE的升高，國(guó)外一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)IgE除了在對(duì)抗寄生蟲方面的經(jīng)典作用外，還具有潛在的防御真菌的作用(如隱球菌)[14]。故IgE水平的升高可作為隱球菌病診斷的輔助檢查。

隱球菌感染可出現(xiàn)在各年齡階段，本研究中肺隱球菌病患者年齡主要集中在40～50歲，且男性較女性多見，提示中年男性是肺隱球菌病的高發(fā)人群。隱球菌病起病多隱匿，臨床表現(xiàn)及體征均無(wú)特異性。2010年美國(guó)感染病學(xué)會(huì)更新的《隱球菌病處理臨床實(shí)踐指南》[5]中指出，隱球菌病的易感人群主要包括：人類免疫缺陷病毒感染者，器官移植患者，接受大劑量激素和/或免疫抑制劑治療的患者，其他有基礎(chǔ)疾病的患者。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)于免疫功能低下的患者，隱球菌更易播散至CSF、血液甚至骨髓中。

關(guān)于隱球菌病的治療，《隱球菌感染診治專家共識(shí)》[15]中指出肺隱球菌病的治療目標(biāo)是治愈感染，防止感染播散到中樞神經(jīng)系統(tǒng)。對(duì)于免疫功能正?；虬Y狀較輕的肺隱球菌病患者可采用氟康唑，而免疫抑制伴彌散性感染或嚴(yán)重肺炎的患者治療方案同隱球菌腦膜炎，即聯(lián)合應(yīng)用兩性霉素B和氟康唑。本研究中35例肺隱球菌病患者使用氟康唑，另有6例隱球菌病患者接受了聯(lián)合治療。

綜上所述，隱球菌病的發(fā)病率不斷升高，免疫功能低下的患者易播散至血液或CSF，因此需要做到早診斷、早治療。CrAg-LFA檢測(cè)具有無(wú)創(chuàng)、準(zhǔn)確率高、快速簡(jiǎn)便的特點(diǎn)，在隱球菌病的診斷中具有很高的臨床應(yīng)用價(jià)值。G試驗(yàn)、GM試驗(yàn)和IgE水平可輔助診斷隱球菌病。對(duì)于累及不同部位和不同免疫狀態(tài)的隱球菌病患者，需嚴(yán)格按照指南用藥。