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    膠體金免疫層析法檢測隱球菌莢膜抗原的診斷價值及隱球菌病患者的臨床特征分析*

    2021-11-26 06:18:58張曉慧陸燕飛許雨喬劉根焰夏文穎
    國際檢驗醫(yī)學(xué)雜志 2021年22期
    關(guān)鍵詞:檢測研究

    張曉慧,陸燕飛,許雨喬,倪 芳,劉根焰,夏文穎

    南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗學(xué)部,江蘇南京 210029

    隱球菌病是由隱球菌引起的一種亞急性或慢性深部真菌病。隱球菌屬中對人致病的主要是新生隱球菌和格特隱球菌。格特隱球菌感染好發(fā)于免疫功能正常的人群,且具有明顯的地域性,如熱帶、亞熱帶地區(qū),我國則以新生隱球菌感染為主[1]。新生隱球菌為條件致病菌,廣泛存在于土壤、干鴿糞、灰塵、人體體表、口腔和腸道中,可經(jīng)呼吸道侵入人體,隨血流播散至腦及腦膜,也可侵犯皮膚、骨和其他臟器[2]。

    新生隱球菌菌體周圍有一圈肥厚的莢膜,是其主要的致病物質(zhì)。作為其特有的分泌物,隱球菌莢膜多糖抗原的檢測可為隱球菌感染的診斷提供依據(jù)。膠體金免疫層析法(CrAg-LFA)是近年新興的一種輔助診斷隱球菌病的檢測方法,具有簡單、快速、特異度高、靈敏度高等特點[3]。本研究應(yīng)用CrAg-LFA檢測隱球菌莢膜多糖抗原,探討其在隱球菌病診斷中的應(yīng)用價值,同時對隱球菌病患者的臨床特征進(jìn)行了分析。

    1 資料與方法

    1.1一般資料 選取2018年6月至2020年6月于南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院行隱球菌莢膜抗原檢測的住院患者1 623例作為研究對象,其中男968例,女655例,送檢血清1 349例,腦脊液(CSF)226例,同時送檢血清和CSF 48例。隱球菌病診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《侵襲性真菌病定義共識的修訂和更新(2019年歐洲癌癥研究和治療組織/侵襲性真菌感染協(xié)作組第三版指南更新)》[4]《隱球菌病處理臨床實踐指南(2010年美國感染病學(xué)會更新)》[5]和《肺隱球菌病診治浙江省專家共識》[1]。確診患者均有病原學(xué)證據(jù),包括活組織病理檢查、病灶穿刺標(biāo)本涂片和培養(yǎng)、CSF墨汁染色、真菌培養(yǎng)及莢膜抗原陽性。結(jié)合患者臨床表現(xiàn)及典型的影像學(xué)檢查,血清CrAg-LFA檢測陽性可臨床診斷為肺隱球菌病,并可作為開始抗隱球菌治療的依據(jù)。

    1.2試劑與儀器 隱球菌莢膜多糖抗原檢測試劑盒(膠體金法)購自美國Immuno-Mycologics公司;BACTECTMFX400全自動血液培養(yǎng)儀(美國BD公司);法國生物梅里埃公司VITEK2-COMPACT全自動微生物分析儀及其配套的YST鑒定卡。操作步驟嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。

    1.3方法

    1.3.1資料收集 收集隱球菌病患者一般資料、臨床表現(xiàn)、實驗室檢查指標(biāo),一般資料包括性別、年齡、吸煙史、動物接觸史等;臨床表現(xiàn)包括無癥狀、發(fā)熱、咳嗽、胸悶/胸痛、頭痛、惡心、嘔吐等;實驗室檢查指標(biāo)包括白細(xì)胞計數(shù)(WBC)、C反應(yīng)蛋白(CRP)、IgE測定水平、(1,3)-β-D葡聚糖檢測(G試驗)、半乳甘露聚糖抗原檢測(GM試驗)以及墨汁染色、培養(yǎng)結(jié)果等。

    1.3.2隱球菌莢膜抗原檢測(膠體金法) 將1滴標(biāo)本稀釋液加入小試管內(nèi),再加入40 μL標(biāo)本(血清或CSF),將試紙條的白端沒入到標(biāo)本液中,10 min后讀取結(jié)果。結(jié)果判讀:僅出現(xiàn)1個對照條帶表明檢測結(jié)果為陰性,出現(xiàn)2個條帶(檢測條帶和對照條帶)表明檢測結(jié)果為陽性,若對照條帶未出現(xiàn)說明檢測無效,需重新檢測。

    2 結(jié) 果

    2.1CrAg-LFA對隱球菌病的檢測結(jié)果 結(jié)果顯示,CrAg-LFA檢測總陽性數(shù)48例,其中39例最終診斷為隱球菌病(肺隱球菌病35例,隱球菌腦膜炎2例,隱球菌敗血癥1例,播散性隱球菌病1例),剩余9例未行進(jìn)一步確診檢查,均以“肺部感染”為出院診斷。在1 575例CrAg-LFA陰性患者中有7例確診為隱球菌病(肺隱球菌病6例,髂骨隱球菌感染1例),剩余1 568例均排除隱球菌感染。CrAg-LFA對隱球菌病診斷的靈敏度為84.8%(39/46),特異度為99.4%(1 568/1 577)。其中,血清CrAg-LFA在肺隱球菌病診斷中的靈敏度為85.4%(35/41),特異度為100.0%(1 356/1 356),陽性預(yù)測值為100.0%(35/35),陰性預(yù)測值為99.6%(1 356/1 362),而CSF CrAg-LFA在隱球菌腦膜炎診斷中的靈敏度(2/2)和特異度(272/272)均為100.0%。見表1。

    表1 CrAg-LFA對隱球菌病患者的檢測結(jié)果

    2.2隱球菌病患者臨床特征分析

    2.2.1一般資料 46例隱球菌病患者中65.2%(30/46)存在基礎(chǔ)疾病,有27例肺隱球菌病患者有基礎(chǔ)病史,按比例依次為高血壓病(48.1%)、慢性肝病(29.6%)、糖尿病(25.9%)、自身免疫性疾病(14.8%)、惡性腫瘤(14.8%)。此外,有14例肺隱球菌病患者無基礎(chǔ)疾病。41例肺隱球菌病患者中,33例患者通過經(jīng)皮肺穿刺活檢病理結(jié)果得以確診,8例通過CrAg-LFA檢測、典型影像學(xué)特征、臨床表現(xiàn)及治療效果等被臨床診斷為肺隱球菌病。41例肺隱球菌病患者中,男24例,女17例,年齡18~80歲,平均(47.0±12.8)歲。其中有11例患者有吸煙史,2例有明確鴿子接觸史。隱球菌腦膜炎患者共2例,男、女各1例,年齡分別為29歲和63歲,未有明顯的動物接觸史。另有播散性隱球菌病、隱球菌敗血癥、髂骨隱球菌感染各1例,年齡分別為49歲、30歲、47歲,既往均無吸煙史及動物接觸史。

    2.2.2臨床表現(xiàn)及實驗室檢查 在41例肺隱球菌病患者中,有23例患者因出現(xiàn)癥狀而就診,常見癥狀依次為咳嗽、胸悶/胸痛及發(fā)熱。在18例無癥狀的患者中,有14例在體檢時發(fā)現(xiàn)肺部病變,均以“肺部病灶性質(zhì)待查”為初步診斷收治入院。78%的患者就診時無明顯異常的肺部體征,部分患者可出現(xiàn)干濕啰音、呼吸音減低等。2例隱球菌腦膜炎患者中,其中1例因“發(fā)熱伴頭痛”入院,體格檢查巴賓斯基征呈陽性,CSF檢查中WBC、葡萄糖及蛋白升高、氯化物降低。另1例因“狼瘡性腎炎”在住院期間出現(xiàn)頭痛癥狀,CSF檢查中僅出現(xiàn)蛋白升高及氯化物降低,余正常。2例患者的CSF培養(yǎng)、墨汁染色及CrAg-LFA檢測均為陽性。見表2。

    表2 主要隱球菌病患者臨床表現(xiàn)及實驗室檢查[n/n(%)]

    除以上41例肺隱球病和2例隱球菌腦膜炎外,本研究另觀察到3例隱球菌特殊感染患者。1例播散性隱球菌病患者僅有頭痛癥狀,腦膜刺激征為陰性,CSF培養(yǎng)及墨汁染色均未見到隱球菌,但其血清和CSF CrAg-LFA檢測呈陽性,且肺穿刺組織病理檢查見到隱球菌;1例患者因隱球菌感染發(fā)生敗血癥,外周血、CSF及骨髓中均培養(yǎng)出新生隱球菌,且CSF墨汁染色及血清CrAg-LFA檢測均為陽性;1例患者因“右下肢疼痛伴活動受限”入院,血清CrAg-LFA檢測呈陰性,經(jīng)外科手術(shù)后病理活檢結(jié)果提示為隱球菌感染。

    2.2.3治療 46例隱球菌病患者中,43例接受了抗真菌治療。肺隱球菌病患者中35例使用氟康唑,2例服用伏立康唑,病情均好轉(zhuǎn),出院后予以序貫治療;余2例因病情危重采用了聯(lián)合治療(氟康唑+兩性霉素B),1例患者主動放棄治療,另1例患者回當(dāng)?shù)蒯t(yī)院治療,后隨訪患者死亡。2例隱球菌腦膜炎患者中1例因強(qiáng)烈要求出院未用藥,另1例采用了聯(lián)合治療(氟康唑+兩性霉素B脂質(zhì)體),癥狀好轉(zhuǎn),出院后續(xù)用氟康唑。3例隱球菌特殊感染患者均采用聯(lián)合治療,播散性隱球菌病患者予以兩性霉素B脂質(zhì)體聯(lián)合氟胞嘧啶治療,出院后繼續(xù)口服氟康唑,預(yù)后良好;隱球菌敗血癥患者經(jīng)氟康唑聯(lián)合兩性霉素B脂質(zhì)體治療不久后死亡;髂骨隱球菌感染患者手術(shù)后予以兩性霉素B脂質(zhì)體聯(lián)合伏立康唑治療,病情好轉(zhuǎn)。

    3 討 論

    既往流行病學(xué)統(tǒng)計發(fā)現(xiàn),新生隱球菌最常見的感染部位是中樞神經(jīng)系統(tǒng),但近年來肺隱球菌病的發(fā)病率呈逐年上升趨勢[6]。肺隱球菌病成為繼肺曲霉菌病之后最常見的肺部真菌病變,占20%左右。由于隱球菌病患者的臨床表現(xiàn)及影像學(xué)檢查無特異性,故實驗室病原學(xué)檢測和組織學(xué)檢查尤為重要。目前臨床開展的實驗室檢測方法主要有墨汁染色、真菌培養(yǎng)、莢膜抗原血清學(xué)檢測,如膠乳凝集試驗、酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)等。本研究中肺隱球菌病患者痰涂片及培養(yǎng)均未檢出隱球菌,考慮可能是病灶多分布在外周,送檢標(biāo)本菌量少及標(biāo)本采集時間錯過最佳培養(yǎng)時間等原因。有研究將傳統(tǒng)的鏡檢及培養(yǎng)法與抗原檢測進(jìn)行了比較,結(jié)果顯示前者對隱球菌的檢出率極低[7]。近年研究發(fā)現(xiàn)CrAg-LFA對隱球菌病檢測的靈敏度和特異度均高于膠乳凝集試驗和ELISA,其對實驗室設(shè)備的要求不高,操作簡便、快速,10 min即可出結(jié)果,逐漸應(yīng)用于臨床[8]。

    本研究對1 623例行CrAg-LFA檢測的住院患者進(jìn)行統(tǒng)計,發(fā)現(xiàn)共有48例為陽性,其中39例完善檢查后最終診斷為隱球菌病。本研究有7例血清CrAg-LFA檢測出現(xiàn)假陰性(6例肺隱球菌病,1例髂骨隱球菌感染),考慮原因有肺外隱球菌負(fù)荷量較低、隱球菌莢膜缺失或感染處于早期等[9-10]。此外,日本一項研究發(fā)現(xiàn)在免疫功能正常的肺隱球菌病患者中,血清CrAg-LFA檢測的陽性率較低[11],本研究中6例假陰性肺隱球菌病患者中有4例免疫功能正常。因此,對于免疫功能正常的肺隱球菌病患者需結(jié)合臨床表現(xiàn)、影像學(xué)和病理學(xué)檢查綜合診斷,以防漏診。

    本研究發(fā)現(xiàn)CrAg-LFA檢測CSF標(biāo)本的靈敏度和特異度均為100.0%。1例播散性隱球菌病患者CSF培養(yǎng)及墨汁染色均未見到隱球菌,但CSF CrAg-LFA檢測為陽性,給予抗真菌治療后患者的病情有明顯好轉(zhuǎn),考慮原因為CSF中隱球菌量較少,傳統(tǒng)實驗室檢查方法無法檢出。歐洲癌癥研究和治療組織/侵襲性真菌感染協(xié)作組和世界衛(wèi)生組織已推薦將CSF CrAg-LFA檢測作為隱球菌腦膜炎的首選檢查[12],且其陽性結(jié)果作為隱球菌腦膜炎的確診標(biāo)準(zhǔn)[4]。同時,有研究表明CrAg-LFA滴度的檢測可用于評估預(yù)后以及監(jiān)測療效[7,13]。本研究中有1例隱球菌腦膜炎患者入院時CSF墨汁染色、培養(yǎng)及CrAg-LFA檢測均陽性,進(jìn)行抗真菌治療后,隨著臨床癥狀好轉(zhuǎn),墨汁染色及培養(yǎng)菌量減少直至轉(zhuǎn)陰,CrAg-LFA滴度持續(xù)下降,直至完全治愈轉(zhuǎn)陰。

    G試驗和GM試驗作為臨床真菌感染的重要實驗室檢測指標(biāo),其診斷范圍并不包括隱球菌感染。對于懷疑肺部真菌感染的患者,當(dāng)出現(xiàn)G試驗和GM試驗均陰性時,應(yīng)高度懷疑是否存在隱球菌的感染,但本研究中有1例患者出現(xiàn)G試驗陽性,考慮可能是因隱球菌莢膜丟失導(dǎo)致細(xì)胞壁中少量(1,3)-β-D葡聚糖成分暴露。此外,本研究發(fā)現(xiàn)55.6%的肺隱球菌病患者出現(xiàn)了總IgE的升高,國外一項研究發(fā)現(xiàn)IgE除了在對抗寄生蟲方面的經(jīng)典作用外,還具有潛在的防御真菌的作用(如隱球菌)[14]。故IgE水平的升高可作為隱球菌病診斷的輔助檢查。

    隱球菌感染可出現(xiàn)在各年齡階段,本研究中肺隱球菌病患者年齡主要集中在40~50歲,且男性較女性多見,提示中年男性是肺隱球菌病的高發(fā)人群。隱球菌病起病多隱匿,臨床表現(xiàn)及體征均無特異性。2010年美國感染病學(xué)會更新的《隱球菌病處理臨床實踐指南》[5]中指出,隱球菌病的易感人群主要包括:人類免疫缺陷病毒感染者,器官移植患者,接受大劑量激素和/或免疫抑制劑治療的患者,其他有基礎(chǔ)疾病的患者。同時研究發(fā)現(xiàn),對于免疫功能低下的患者,隱球菌更易播散至CSF、血液甚至骨髓中。

    關(guān)于隱球菌病的治療,《隱球菌感染診治專家共識》[15]中指出肺隱球菌病的治療目標(biāo)是治愈感染,防止感染播散到中樞神經(jīng)系統(tǒng)。對于免疫功能正?;虬Y狀較輕的肺隱球菌病患者可采用氟康唑,而免疫抑制伴彌散性感染或嚴(yán)重肺炎的患者治療方案同隱球菌腦膜炎,即聯(lián)合應(yīng)用兩性霉素B和氟康唑。本研究中35例肺隱球菌病患者使用氟康唑,另有6例隱球菌病患者接受了聯(lián)合治療。

    綜上所述,隱球菌病的發(fā)病率不斷升高,免疫功能低下的患者易播散至血液或CSF,因此需要做到早診斷、早治療。CrAg-LFA檢測具有無創(chuàng)、準(zhǔn)確率高、快速簡便的特點,在隱球菌病的診斷中具有很高的臨床應(yīng)用價值。G試驗、GM試驗和IgE水平可輔助診斷隱球菌病。對于累及不同部位和不同免疫狀態(tài)的隱球菌病患者,需嚴(yán)格按照指南用藥。

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