淋病奈瑟菌對阿奇霉素的敏感性及mtrR基因突變分析*

廖 娟，林 瀅，方 鳳，詹文芳，劉繼來

福建中醫(yī)藥大學附屬人民醫(yī)院檢驗科，福建福州 350004

淋病奈瑟菌是性傳播疾病淋病的致病菌，其顯著特點是能迅速累積不同的突變，從而獲得對抗菌藥物的耐藥性[1]。自20世紀30年代中期開始使用磺胺類藥物以來，淋病奈瑟菌對用于治療淋病的大部分抗菌藥物都產(chǎn)生了耐藥性[2]。世界衛(wèi)生組織(WHO)推薦將頭孢菌素聯(lián)合阿奇霉素作為無并發(fā)癥淋病的一線藥物[3]，但不斷增加的耐藥性給淋病的治療帶來了巨大的挑戰(zhàn)，已經(jīng)出現(xiàn)淋病奈瑟菌對阿奇霉素耐藥的相關報道[4-5]。本文通過檢測淋病奈瑟菌對阿奇霉素的耐藥性并對其相關耐藥基因mtrR進行測序分析，以了解該菌的耐藥特征及耐藥機制，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1菌株來源 收集本院2018—2020年臨床分離的43株淋病奈瑟菌菌株，質控菌株為ATCC49226。

1.2方法

1.2.1藥敏試驗 采用瓊脂稀釋法檢測淋病奈瑟菌對阿奇霉素的最小抑菌濃度(MIC)，阿奇霉素購于上海陶素生化科技有限公司，GC瓊脂粉購于上海艾禮生物科技有限公司，無菌脫纖維羊血購于廣州鴻泉生物科技有限公司。藥敏試驗結果判斷標準參照美國臨床和實驗室標準化協(xié)會(CLSI)2020年標準[6]。

1.2.2mtrR基因擴增測序 選取對阿奇霉素非敏感的菌株(阿奇霉素非敏感組，MIC>1.000 μg/mL)和隨機挑選的10株對阿奇霉素敏感的菌株(阿奇霉素敏感組，MIC≤1.000 μg/mL)進行基因組DNA提取，采用天根生物有限公司的基因組提取試劑盒，提取DNA后經(jīng)核酸蛋白檢測儀確認DNA濃度和純度后保存于-20 ℃冰箱備用。參考文獻[7]，由上海生工生物有限公司合成引物(mtrR-F:5′-GCCAATCAACAGGCATTCTTA-3′;mtrR-R:5′-GTTGGAACAACGCGTCAAAC-3′)。PCR試劑盒購于Promega公司，反應體系參考試劑說明書，mtrR基因的擴增條件：94 ℃預變性4 min；94 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30個循環(huán)；然后72 ℃延伸10 min。1%瓊脂糖凝膠電泳獲取PCR產(chǎn)物后，送至上海生工生物有限公司進行測序。

1.3統(tǒng)計學處理 采用Bioedit軟件對測序結果進行分析，利用ORF Finder進行閱讀框架的翻譯；采用SPSS22.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計數(shù)資料以例數(shù)或百分率表示，組間比較采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1藥敏試驗結果 43株菌株中共檢出對阿奇霉素非敏感的菌株11株，對阿奇霉素敏感的菌株32株，阿奇霉素的非敏感率為25.6%(11/43)，其MIC結果見表1。

表1 淋病奈瑟菌對阿奇霉素的MIC結果

2.2mtrR基因的檢出情況及突變特點 選擇的21株菌株(11株對阿奇霉素非敏感，10株對阿奇霉素敏感)均擴增出mtrR基因，部分標本瓊脂糖凝膠電泳結果見圖1。其中阿奇霉素非敏感組在mtrR啟動子區(qū)13 bp反向重復序列中A堿基缺失突變的比例為45.5%(5/11),而阿奇霉素敏感組A堿基缺失突變的比例為70.0%(7/10),兩組之間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。阿奇霉素非敏感組在mtrR編碼區(qū)發(fā)生突變的比例為54.5%(6/11,分別為菌株18010080、18011026、18015369、20014066、20018372、20019431)。阿奇霉素敏感組在mtrR基因編碼區(qū)發(fā)生突變的比例為50.0%(5/10，分別為菌株18015432、19003706、19015308、20006226、20007603)，兩組之間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，但可見阿奇霉素非敏感組在mtrR基因編碼區(qū)存在多個位點的突變。見表2。

注：M為標志物；1～10分別為菌株18006276、18009808、18010080、18011026、18015369、18015432、19003706、19008415、19012656、19014501。

表2 mtrR基因突變情況

續(xù)表2 mtrR基因突變情況

3 討 論

淋病是由淋病奈瑟菌引起的一類性傳播疾病，男性的臨床表現(xiàn)為尿道炎，女性則表現(xiàn)為宮頸炎，嚴重者可導致盆腔炎、不孕癥及異位妊娠等不良后果。同時，淋病奈瑟菌感染還可能增強人類免疫缺陷病毒(HIV)的感染和傳播[8]。2014年歐洲疾病預防控制中心的報告顯示，在2013—2014年淋病奈瑟菌的感染率增長了25%[1]，由于目前還沒有針對淋病的疫苗，對淋病的控制主要依賴于流行病學監(jiān)測和抗菌藥物的使用[9]。為提高治療效果，許多國家推薦采用頭孢曲松聯(lián)合阿奇霉素作為無并發(fā)癥淋病的一線治療藥物[10]。然而阿奇霉素耐藥菌株，特別是高度耐藥菌株已經(jīng)時有報道，大大降低了聯(lián)合用藥的有效性。因此，監(jiān)測淋病奈瑟菌對阿奇霉素的耐藥性，了解其耐藥機制，將有利于預防淋病奈瑟菌的傳播，延緩耐藥性的發(fā)生。本研究中的43例菌株對阿奇霉素的非敏感率為25.6%，MIC最大值可達64.000 μg/mL。臨床應重視淋病奈瑟菌的耐藥性，根據(jù)藥敏試驗結果進行治療用藥的選擇。

阿奇霉素是大環(huán)內(nèi)酯類藥物，主要通過與細菌核糖體50S亞基的23S rRNA結合，干擾信使核糖核酸(mRNA)翻譯，通過阻斷轉肽酶的作用，從而抑制細菌蛋白質的合成。研究表明，淋病奈瑟菌對阿奇霉素的耐藥機制主要涉及兩個方面：一個是藥物外排的加強，另一個是藥物靶點的改變。其中藥物外排的加強主要是由于mtrR基因發(fā)生突變導致。mtrR基因編碼mtrR蛋白，此蛋白可以負向調(diào)控外排泵，當mtrR基因發(fā)生突變時，可以引起mtrR蛋白減少或缺失，從而導致細菌外排抗菌藥物的能力增強，使得細菌對阿奇霉素的敏感性下降[11]。有研究表明，mtrR基因啟動子區(qū)域的A堿基缺失突變與阿奇霉素的MIC提高有關[12]，而mtrR基因編碼區(qū)發(fā)生的G45D替換突變也與細菌對阿奇霉素高度耐藥有關[13]。本研究中阿奇霉素非敏感組和阿奇霉素敏感組中均出現(xiàn)A堿基缺失突變，兩組之間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。而與阿奇霉素敏感組比較，阿奇霉素非敏感組在mtrR基因編碼區(qū)可見多個位點的突變,這與文獻[14]報道相似。但編碼區(qū)的替換突變在兩組之間的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，可能的原因是淋病奈瑟菌對阿奇霉素的耐藥機制除了mtrR基因突變作用之外，還與23S rRNA基因突變密切相關，此外rpID、rpIV等基因突變也可導致細菌的耐藥性升高[15]。不同的mtrR基因突變方式對淋病奈瑟菌的耐藥性所起的作用也可能不同[16]，有研究表明，mtrR基因啟動子區(qū)發(fā)生的缺失突變在淋病奈瑟菌對阿奇霉素耐藥性中起的作用比mtrR基因編碼區(qū)發(fā)生的替換突變更為重要[17]。

綜上所述，淋病奈瑟菌對阿奇霉素的耐藥形勢較為嚴峻，mtrR基因發(fā)生突變可以使淋病奈瑟菌產(chǎn)生耐藥性，臨床應該重視阿奇霉素的敏感性監(jiān)測及mtrR基因檢測，并根據(jù)藥敏試驗結果合理選擇抗菌藥物，制訂合理措施來控制淋病奈瑟菌的播散。