五丹胃福顆粒對胃癌前病變大鼠組織病理學(xué)及VEGF和HIF-1α的影響研究

祁向爭，胡建功，馬志豪，李志強(qiáng)，姬壯壯，徐旭

(1.天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院,天津 300150；2.天津藥物研究院有限公司,天津 300193)

胃癌是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，臨床預(yù)后極差，病死率居各類腫瘤第二位[1]。胃癌前病變(PLGC)指慢性萎縮性胃炎(CAG)伴腸上皮化生、上皮內(nèi)瘤變的病理狀態(tài)，是慢性發(fā)病過程[2]。現(xiàn)代研究表明胃癌前病變中的腸上皮化生和瘤變是胃炎向胃癌轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵步驟，對其干預(yù)治療可顯著降低胃癌的發(fā)病率[3]。本次實(shí)驗通過五丹胃福顆粒干預(yù)胃癌前病變大鼠，觀察VEGF、HIF-1α指標(biāo)及胃黏膜組織病理學(xué)變化，證實(shí)五丹胃福顆粒對PLGC的預(yù)防和治療作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗動物

健康清潔級雄性SD大鼠，80只，鼠齡15 d，體質(zhì)量(20±5)g，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。

1.2 藥物與制劑

雷尼替丁(天津太平洋制藥有限公司)；N-甲基-N′-硝基-N-亞硝基胍(MNNG，F(xiàn)luka公司)，每周用雙蒸水配成1 g/L的母液，4 ℃避光儲存，臨用時用雙蒸水配成100 μg/mL(每天配1次)，供大鼠自由飲用，飲水瓶用油漆涂黑避光；五丹胃福顆粒購自天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院藥房，大鼠用藥量根據(jù)人和動物間按體表面積折算的等效劑量以及高、中、低劑量計算法確定，即高劑量1.44 g/mL，中劑量組0.72 g/mL，低劑量組0.36 g/mL。葉酸購自天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院藥房(天津力生制藥股份有限公司)。

1.3 分組與給藥

造模成功大鼠56只，隨機(jī)分為模型組(A組)、五丹低劑量組(B組)、五丹中劑量組(C組)、五丹高劑量組(D組)、理氣組(E組)、祛瘀組(F組)、葉酸組(G組)。各中藥組分別給予高中低不同濃度的3組中藥顆粒劑，2 mL/次，2次/日，共12周。祛瘀組與理氣組是五丹胃福顆粒的拆方，分別為丹參飲與五磨飲子為主組成。西藥對照組給予葉酸，劑量根據(jù)《藥理實(shí)驗方法學(xué)》人和動物間按體表面積折算的等效劑量，0.72 g/mL。

1.4 病理組織學(xué)檢測標(biāo)準(zhǔn)

治療12周后進(jìn)行病理組織學(xué)檢測，HE染色觀察胃黏膜病理變化，包括炎癥、萎縮、腸化、瘤變的病理情況。參照《慢性萎縮性胃炎中醫(yī)診療共識意見》[4]給予量化，主要變量是炎癥、萎縮、腸化、瘤變。無病理組織學(xué)改變計為0分。炎癥按“輕、中、重”三個級度分別計1、2、3分。萎縮、腸化按“輕、中、重”三個級度分別記3、6、9分。瘤變按“輕、重”二個程度分別記為3、9分。

1.5 檢測指標(biāo)

1.5.1 大鼠的一般情況

大鼠整體狀態(tài)、精神狀態(tài)、皮毛光澤度、反應(yīng)能力、飲食情況。

1.5.2 VEGF、HIF-1α

干預(yù)12周末，停藥2 d后，免疫印跡法檢測大鼠VEGF、HIF-1α水平。

1.5.3 大鼠胃黏膜病理變化

動物處死后，取全胃，沿胃大彎剪開，取胃竇和胃體部。4%多聚甲醛浸潤固定12 h以上，沖水24 h，50%、75%、95%、100%乙醇脫水，二甲苯透明，浸蠟后，石蠟包埋。切片厚5 μm，常規(guī)蘇木精-伊紅染色病理學(xué)檢查。觀察指標(biāo)及病情分級標(biāo)準(zhǔn)：腺體炎癥、萎縮病理組織學(xué)分級標(biāo)準(zhǔn)、腸上皮化生及上皮內(nèi)瘤變分度標(biāo)準(zhǔn)。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

統(tǒng)計分析采用SPSS22.0統(tǒng)計軟件。計數(shù)資料組間比較使用χ2檢驗，等級資料組間比較使用秩和檢驗，以P<0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般情況

分組干預(yù)期間，大鼠經(jīng)造模后，整體狀態(tài)明顯變差。經(jīng)五丹胃福顆粒低劑量、中劑量、高劑量、理氣組、祛瘀組和葉酸治療后，一般狀態(tài)有不同程度好轉(zhuǎn)。

2.2 采用Western Blot法檢測VEGF、HIF-1α結(jié)果

治療12周，與A組比較，其他組胃竇部黏膜VEGF、HIF-1α顯著降低(P<0.05)；B組、C組與D組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；E組、F組與D組相比，差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，但VEGF降低趨勢在F組比E組更明顯，HIF-1α降低趨勢在E組比F組更明顯。E組與F組比較，差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1 各組大鼠胃竇黏膜VEGF、HIF-1α水平

2.3 胃竇黏膜病理結(jié)果

經(jīng)12周藥物干預(yù)后，A組可見胃壁彈性差，黏膜淡白、紅白相間，或紫暗，皺襞低平或粗大，走向紊亂，皺襞減少甚至消失，黏膜表面粗糙，黏液減少，或可見散在糜爛出血點(diǎn)，可見單個或多個小結(jié)節(jié)。B、C、D、E、F、G組大鼠胃壁彈性尚可，黏膜呈粉紅色，表面光澤，被覆較多黏液，黏膜皺襞平整光滑，走向基本規(guī)則，見圖1。

圖1 各組大鼠胃黏膜組織病理變化(HE染色)

各組間炎癥積分比較：B組、C組、D組、G組與A組比較，炎癥積分減低(P<0.05)。B組、C組與D組比較，P>0.05，見表2。

表2 各組大鼠胃黏膜炎癥程度積分比較(分)

各組間萎縮程度積分比較：B組、C組、D組與A組比較，積分減少(P<0.05)。B組、C組與D組比較，P>0.05，見表3。

表3 各組大鼠胃黏膜萎縮程度積分比較(分)

各組間腸化程度，僅模型組可見腸化，余治療組未見腸化表現(xiàn)，各組間沒有差異，見表4。

表4 各組大鼠胃黏膜腸化程度積分比較(分)

各組間瘤變程度積分比較：D組、G組與A組比較，積分減低(P<0.05)，見表5。

3 討論

3.1 PLGC中醫(yī)認(rèn)識

胃癌前病變大多是由胃黏膜慢性炎癥反應(yīng)發(fā)展而來，與人們生活節(jié)奏變快、作息不規(guī)律、暴飲暴食等相關(guān)，患者多有胃脘脹痛等表現(xiàn)，嚴(yán)重影響生活質(zhì)量，此期應(yīng)該積極防治，以防止發(fā)生癌變[5-6]。

PLGC患者臨床癥狀主要有心下痞滿、胃脘脹痛、嘈雜吞酸、嘔惡納呆等，故多屬中醫(yī)“胃痞”“胃痛”等范疇，病位以胃為主，與肝脾相關(guān)[6]。因脾胃同居中焦，一臟一腑，以膜相連，互為表里，故脾病多及于胃。脾氣升宣水谷精氣，布施五臟為用；胃腑通降陰濁，和調(diào)六腑。升降相因，動靜相和，故而以成中焦升降之變化，精微得化，氣血得生[7-8]。肝為剛臟性喜條達(dá)而主疏泄，肝的疏泄功能促進(jìn)和協(xié)調(diào)脾胃氣機(jī)的升降，二者聯(lián)系緊密[9]。

然胃為六腑之大主，多血多氣，寒熱痰瘀之邪，無一不先犯胃土，使胃氣逆上，脾胃氣血失和，而生脹痛。所以認(rèn)為PLGC這一慢性病變過程主要是胃氣郁滯，氣郁日久，久病及血，而使胃絡(luò)失和，導(dǎo)致瘀血阻于胃絡(luò)。劉宇旻[10]等認(rèn)為胃絡(luò)瘀阻是貫穿PLGC胃黏膜屏障損傷的關(guān)鍵病理因素。張強(qiáng)[11]等認(rèn)為氣滯血瘀病機(jī)是PLGC 基本病理過程?，F(xiàn)代實(shí)驗研究認(rèn)為PLGC血瘀證患者多存在微循環(huán)障礙，多有微循環(huán)血管內(nèi)皮舒張功能和通透性異常，血管內(nèi)皮受損，血細(xì)胞凝聚，血液呈高凝狀態(tài)[12]。

3.2 五丹胃福顆粒作用機(jī)理

五丹胃福顆粒是天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院名老中醫(yī)邵祖燕教授自創(chuàng)經(jīng)驗方，為傳統(tǒng)名方五磨飲子與丹參飲化裁而成?，F(xiàn)代研究表明五丹胃福湯可增加胃黏膜血流量，促進(jìn)大鼠胃運(yùn)動，使炎癥因子表達(dá)降低，從而能有效治療CAG，并延緩PLGC的發(fā)生發(fā)展[13-16]。方中木香可以促進(jìn)胃排空，增強(qiáng)胃腸運(yùn)動[17]；木香藥理成分木香烴內(nèi)酯(CO)、去氫木香內(nèi)酯(DE)能抑制炎癥因子腫瘤因子，使胃組織損傷減小[18]。沉香提取液降低氧化因子微量丙二醛(MDA)、及抗氧化因子超氧化物歧化酶(SOD)、微量還原性谷胱甘肽(GSH)的活性，保護(hù)胃黏膜[19]。檳榔藥理成分檳榔堿，可促進(jìn)胃腸運(yùn)動[20]。枳實(shí)可以促進(jìn)胃腸動力[21]。丹參可以改善微循環(huán)，抑制胃酸分泌，減少胃黏膜損傷的作用[22]。丹參中丹參酮ⅡA有抗氧化、抗炎以及抗腫瘤的作用[23]。檀香加強(qiáng)胃腸蠕動[24]。砂仁具有保護(hù)胃黏膜、抗炎等作用[25]。從上可得此方劑主要通過理氣和胃、化瘀通絡(luò)的功效，進(jìn)而改善胃黏膜炎癥、調(diào)整胃腸運(yùn)動、保護(hù)胃黏膜，治療胃癌前病變，延緩腸上皮化生或不典型增生繼續(xù)向胃癌的演變。

3.3 實(shí)驗結(jié)果分析

各治療組均能有效降低VEGF及HIF-1α，不同劑量組及拆方組之間，治療效果沒有明顯區(qū)別。在VEGF改善方面，祛瘀組略優(yōu)。在HIF-1α改善方面，理氣組略優(yōu)。改善病理炎癥方面，各治療組均有療效，改善萎縮方面，中藥各治療組均有療效，改善瘤變方面，中藥高劑量組與葉酸組有治療效果。通過以上實(shí)驗結(jié)果可得五丹胃福顆粒可顯著HIF-1α和VEGF，其中祛瘀組改善 VEGF方面略優(yōu)，理氣組在HIF-1α改善方面略優(yōu)。這個空間架構(gòu)與中醫(yī)的“證”類似，反應(yīng)為時間橫斷面上的空間變化。中醫(yī)認(rèn)為，氣的運(yùn)動是人生命的根本，在氣的運(yùn)動中，生命能量交換，物質(zhì)代謝，所以氣是維持人體生命活動之動力。正常情況下，人體處于氣血和調(diào)的狀態(tài)，一旦氣的運(yùn)動在各種因素干擾下，出現(xiàn)運(yùn)行緩慢甚至停滯，人體會表現(xiàn)一定的癥狀，久之，則氣滯血瘀，絡(luò)脈瘀阻。五丹胃福顆粒通過理氣活血降低PLGC大鼠的VEGF及HIF-1α表達(dá)，從而使胃黏膜病理積分顯著降低，延緩了PLGC向胃癌的進(jìn)展。