LMP2A、YAP及P27蛋白在鼻咽癌中的表達及與臨床病理特征、預后的關系

王 瑩，蘭艷麗，蘭小嬌，趙 維

鼻咽癌(NPC)是指發(fā)生于鼻咽腔側(cè)壁、頂部的惡性腫瘤，在我國有極高的發(fā)生率[1]。NPC可影響患者聽覺、視覺，并損傷顱神經(jīng)，引起涕中帶血、鼻塞、耳鳴、復視及頭痛等癥狀，嚴重影響患者生活質(zhì)量，而腫瘤轉(zhuǎn)移可致患者死亡[2-5]。NPC發(fā)生發(fā)展的分子機制引起了學者們的廣泛關注[6]。在腫瘤細胞轉(zhuǎn)移及侵襲過程中，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)起著重要的作用。相關文獻表明，外源性表達潛伏膜蛋白2A(LMP2A)在NPC細胞EMT和腫瘤干細胞自我增殖過程中起促進作用，然而其與NPC的關系鮮有報道[7]。Yes相關蛋白(YAP)是近年發(fā)現(xiàn)的一種原癌基因，在多種腫瘤中異常表達。此外，P27蛋白作為一種重要的抑癌基因，也是國外學者研究較多的一種預后因子[8]。本研究就LMP2A、YAP及P27蛋白在NPC中的表達及與臨床病理特征、預后的關系進行分析，旨在為臨床治療提供新思路。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2016年1月—2018年1月我院行手術治療的NPC 90例活檢術石蠟標本。納入標準：術前病理診斷為NPC或鼻咽黏膜慢性炎；患者行手術聯(lián)合放化療；臨床資料無缺失。排除標準：合并血液系統(tǒng)疾病者；存在除NPC以外其他原發(fā)性惡性腫瘤者；合并自身免疫性疾病者。最終81例納入作為NPC組。同時選取50例本院病理科保存的鼻咽黏膜慢性炎組織標本，排除臨床資料不完整、合并其他感染性疾病、合并自身免疫性疾病者，最終46例納入對照組。2組基線資料比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2研究方法 收集所有患者臨床資料，比較LMP2A、YAP及P27蛋白在2組中的表達情況；分析LMP2A、YAP及P27蛋白與NPC患者各病理參數(shù)間的關系；記錄NPC患者在隨訪時間內(nèi)是否死亡，采用多因素Logistic回歸分析探討影響NPC患者預后生存的因素，繪制Kaplan-Meier生存曲線研究3項指標對患者預后的影響。

1.3觀察指標

1.3.1檢測方法：組織標本利用石蠟處理，切成厚5 μm薄片置于載玻片上，37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，二甲苯脫蠟2次，每次10 min。PBS液漂洗3次，每次3 min，蘇木素染色2 min，置于顯微鏡下觀察并計算2組LMP2A、YAP及P27蛋白表達情況。已知陽性組織切片為陽性對照，已知陰性組織切片為陰性對照，PBS液代替一抗為空白對照。

1.3.2LMP2A、YAP及P27蛋白表達判定標準[9]：LMP2A陽性表達定位于胞膜和胞質(zhì)，YAP、P27蛋白陽性表達定位于胞質(zhì)和胞核。免疫組織化學染色評判標準：①按陽性細胞占細胞總數(shù)的百分比計分：<5%、5%～25%、25%～50%、50%～75%、≥75%分別計為0～4分；②染色強度評估：無著色、淡黃色、棕黃色、棕褐色分別計為1～3分；③將①的分值乘以②的分值即為實驗結(jié)果：陰性(-)表達0分，弱陽性(+)表達1～4分，中度陽性(++)表達4～8分，強陽性(+++)表達8～12分，以(-)及(+)作為低表達，(++)及(+++)作為高表達。

1.4隨訪方法 自患者手術結(jié)束開始隨訪，共隨訪2年，截止時間為2020年1月31日或患者死亡?？偵鏁r間為患者手術至死亡的時長[10]。

2 結(jié)果

2.12組LMP2A、YAP及P27蛋白表達情況 NPC組LMP2A、YAP高表達率、P27蛋白低表達率高于對照組(P<0.01)，見表1。

表1 鼻咽癌和鼻咽黏膜慢性炎患者LMP2A、YAP及P27蛋白表達比較[例(%)]

2.2相關蛋白與NPC患者病理參數(shù)的關系 組織高分化、淋巴結(jié)無轉(zhuǎn)移、TNM分期Ⅰ+Ⅱ期、無遠處轉(zhuǎn)移、非角化性未分化型的NPC患者LMP2A、YAP高表達率及P27蛋白低表達率較組織中低分化、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期Ⅲ+Ⅳ期、遠處轉(zhuǎn)移、非角化性分化型NPC患者低(P<0.05，P<0.01)，見表2。

表2 LMP2A、YAP及P27蛋白與NPC患者病理參數(shù)的關系(例)

2.381例NPC患者預后情況 截至隨訪結(jié)束，81例NPC生存54例，死亡27例，病死率為33.33%。

2.4影響NPC患者預后生存的多因素Logistic回歸分析 組織分化程度、病理分型、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及LMP2A、YAP、P27蛋白表達情況為NPC患者預后生存的獨立危險因素(P<0.05，P<0.01)，見表3。

表3 影響NPC患者預后生存的多因素Logistic回歸分析

2.5LMP2A、YAP及P27蛋白對NPC患者預后生存的影響 LMP2A低表達組平均生存時間為(36.55±0.28)個月，高表達組平均生存時間為(31.55±0.22)個月，LMP2A低表達組平均生存時間長于高表達組(P<0.01)。YAP低表達組平均生存時間為(35.98±0.24)個月，高表達組平均生存時間為(31.13±0.24)個月，YAP低表達組平均生存時間長于高表達組(P<0.01)。P27蛋白低表達組平均生存時間為(33.02±0.27)個月，高表達組平均生存時間為(36.93±0.20)個月，P27蛋白高表達組平均生存時間長于低表達組(P<0.01)。見圖1。

圖1 LMP2A、YAP及P27蛋白對NPC患者預后生存的影響LMP2A為潛伏膜蛋白2A，YAP為Yes相關蛋白,NPC為鼻咽癌

3 討論

NPC在我國南方高發(fā)區(qū)位居頭頸部惡性腫瘤首位，居所有惡性腫瘤的第8位。因NPC病理類型以非角化型為主，對放療敏感，但易發(fā)生局部和遠處轉(zhuǎn)移[11]。近年，隨手術及放療技術發(fā)展，NPC生存率顯著提高，但近期生存率仍低于80%。本研究顯示，截至隨訪結(jié)束，81例NPC病死率為33.33%，說明NPC仍是威脅大眾健康的重要疾病[12]。

轉(zhuǎn)移是NPC患者預后不良的主要原因，目前認為NPC的病情進展、預后生存與EB病毒感染關系密切[13]。LMP2A是靜止B細胞中唯一可被檢查到的EB病毒潛伏感染基因[14]。研究表明，LMP2A在調(diào)控細胞一系列生理活動及維持腫瘤干細胞特性等方面均起重要作用，且還能參與Wnt/β-cate-nin、PI3K/Akt、MAPK、ERK和Hedge-hogn等多條信號通路的調(diào)控[15]。本研究顯示，LMP2A在NPC組織中高表達率顯著高于鼻咽黏膜慢性炎組織，說明LMP2A參與了NPC的惡性進展。

YAP是一種多功能的細胞內(nèi)連接蛋白和轉(zhuǎn)錄共激活因子，為Hippo抑癌基因通路的主要效應子，在細胞正常生長發(fā)育過程中起重要作用[16]。通過YAP進行的Hippo信號傳導可調(diào)控干細胞和祖細胞的增殖活性。同時YAP作為一種有效的致癌基因，其表達水平異常會引起腫瘤發(fā)生[17]。據(jù)相關研究顯示，在大腸癌[18]等多種癌細胞中YAP均異常表達。生物學研究表明，過高的YAP表達在腫瘤細胞生長與增殖中均起一定促進作用，且其速度與YAP表達呈正相關[19]。本研究結(jié)果顯示，YAP在NPC組織中高表達率顯著高于鼻咽黏膜慢性炎組織，說明其對NPC的發(fā)生、發(fā)展及預后有重要影響。

NPC是一種高頻率基因CpG島甲基化腫瘤，腫瘤相關基因的甲基化改變參與了細胞周期調(diào)控、DNA修復、細胞凋亡及腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移等過程。當P27蛋白表達降低或缺失時，可失去負性調(diào)控能力，使細胞周期正調(diào)控因子活性增強，引起細胞過度增殖甚至癌變[20]。有研究證明，P27蛋白在多種腫瘤中異常表達[21]。本研究采用免疫組織化學染色法鑒定P27蛋白在NPC組織中的表達特性，結(jié)果顯示，P27蛋白陽性表達定位于胞質(zhì)及胞核中，與鼻咽黏膜慢性炎組織相比，其在NPC組織中呈顯著低表達，證明了P27蛋白在NPC發(fā)展過程中的調(diào)節(jié)作用。

本研究還顯示：LMP2A、YAP及P27蛋白與NPC患者組織分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、遠處轉(zhuǎn)移及病理分型呈顯著相關性，且不同LMP2A、YAP及P27蛋白表達情況下Keplan-Meier生存曲線明顯不同，LMP2A、YAP低表達組平均生存時間長于高表達組，P27蛋白高表達組平均生存時間長于低表達組，進一步提示LMP2A、YAP及P27蛋白與NPC患者病情惡化程度關系密切，可作為臨床評估NPC患者預后的有效指標及潛在治療靶點。此外，組織分化程度、病理分型、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及LMP2A、YAP、P27蛋白表達情況為NPC患者預后生存的獨立危險因素，提示在NPC患者治療中，應對伴有高危因素者進行針對性干預，以減緩患者病情進展、改善患者預后、延長患者生存時間。

綜上，LMP2A、YAP在NPC患者中表達升高，P27蛋白表達降低；LMP2A、YAP高表達及P27蛋白低表達與NPC發(fā)生、病情進展及預后有密切聯(lián)系，可作為預測NPC患者預后的分子標志物和潛在治療靶點。