右美托咪定對膿毒癥小鼠中樞神經(jīng)炎癥反應(yīng)的調(diào)控及機(jī)制研究

肖秀英

膿毒癥可誘發(fā)膿毒癥相關(guān)性腦病等嚴(yán)重并發(fā)癥，嚴(yán)重影響患者預(yù)后[1]。膿毒癥導(dǎo)致的中樞神經(jīng)系統(tǒng)過度炎癥反應(yīng)為患者長期神經(jīng)功能認(rèn)知障礙的發(fā)生機(jī)制，而小膠質(zhì)細(xì)胞活化在其發(fā)生及演變過程中扮演著重要的角色[2-3]。外科手術(shù)引發(fā)的外周血炎性因子顯著升高，其進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)后可導(dǎo)致小膠質(zhì)細(xì)胞異常激活，呈現(xiàn)M1狀態(tài)，進(jìn)一步加劇炎癥反應(yīng)[4]。研究證實，在全身炎癥反應(yīng)發(fā)生及演變環(huán)節(jié)中，炎癥反應(yīng)及中樞神經(jīng)系統(tǒng)小膠質(zhì)細(xì)胞活化后均可嚴(yán)重破壞血腦屏障正常功能[5]。右美托咪定(Dex)目前已被證實可降低術(shù)后患者神經(jīng)認(rèn)知功能障礙發(fā)生風(fēng)險，顯著抑制炎癥反應(yīng),可能是其保護(hù)神經(jīng)認(rèn)知功能的主要機(jī)制[6]。本研究旨在探究Dex通過減輕膿毒癥小鼠外周血和大腦海馬區(qū)神經(jīng)炎癥反應(yīng)對神經(jīng)認(rèn)知功能恢復(fù)的影響。

1 材料與方法

1.1實驗動物 51只6～8周CD1小鼠購于北京泰澤嘉業(yè)科技發(fā)展有限公司，實驗動物許可證號：SCXK(京)2020-0018。所有小鼠分籠飼養(yǎng)，每籠3只，并置于SPF級動物房中飼養(yǎng)，每12小時晝夜更替，并予充足食物及水，隔日更換墊料1次。

1.2主要試劑與儀器 Dex購于上海吉至生化科技有限公司；伊文氏藍(lán)(EB)購于ChemeGen中國；高遷移率族蛋白1(HMGB1)、晚期糖基化終末產(chǎn)物受體(RAGE)抗體購于武漢益普生物科技有限公司；小鼠腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)等試劑盒購于上海江萊生物科技有限公司。

1.3實驗方法

1.3.1造模與分組：將51只CD1小鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、膿毒癥組、Dex組各17只。假手術(shù)組小鼠僅行開腹手術(shù)及盲腸暴露操作，余2組采用盲腸結(jié)扎及穿孔方式建立膿毒癥小鼠模型，具體方法：采用異氟烷麻醉小鼠并暴露腹部，剃毛后消毒，由劍突下緣沿腹中線做1 cm切口。分離盲腸并暴露，取4-0手術(shù)線于盲腸基底部與盲端連線中點結(jié)扎。后通過21 G注射器針頭于結(jié)扎處與盲端中點實施穿透式穿刺，同時于穿刺點通過無損傷鑷子擠出少量糞便。將小鼠盲腸回納入腹腔，并取6-0絲線縫合，關(guān)閉腹腔[7]。建模成功后，Dex組小鼠采用50 μg/kg Dex腹腔注射，建模成功后5 min首次注射，后每隔2 h注射1次，共3次。假手術(shù)組、膿毒癥組小鼠于相同時間采用6.25 ml/kg生理鹽水腹腔注射。

1.3.2巴恩斯迷宮(Barns Maze)測試：術(shù)后2周每組隨機(jī)抽取7只小鼠行Barns Maze測試，分析其空間學(xué)習(xí)記憶能力(進(jìn)入目標(biāo)盒時間)，時間設(shè)置為4 d，每日進(jìn)行2輪，時間為3 min。

1.3.3條件恐懼實驗：Barns Maze測試結(jié)束后第2日各組隨機(jī)抽取7只小鼠行條件恐懼實驗，比較各組小鼠在環(huán)境及聲音條件下的僵直時間。

1.3.4血腦屏障通透性檢測：術(shù)后24 h每組取10只小鼠采用EB實施血腦屏障通透性檢測。異氟烷麻醉，斷頭處死小鼠分離腦組織，冰上快速分離雙側(cè)海馬組織，經(jīng)蛋白裂解液裂解后于冰上研磨成組織勻漿，離心后取上清液待檢。采用BCA蛋白檢測試劑盒測定各組小鼠海馬組織蛋白濃度，Western blot法檢測HMGB1、RAGE蛋白表達(dá)水平。

1.3.5小膠質(zhì)細(xì)胞活化程度：每組取10只小鼠檢測小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)大腦海馬區(qū)Iba-1表達(dá)水平。

1.3.6炎性因子檢測：術(shù)后24 h于各組10只小鼠右心室取血，離心后取血清采用ELISA法測定各組小鼠外周血及海馬組織TNF-α、IL-6、IL-1β水平。

2 結(jié)果

2.1各組小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力比較 1、2、3、4 d時，膿毒癥組小鼠進(jìn)入目標(biāo)盒時間顯著長于假手術(shù)組(P<0.05)；Dex組小鼠進(jìn)入目標(biāo)盒時間顯著短于膿毒癥組(P<0.05)。見表1。

表1 各組小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力比較

2.2各組小鼠條件恐懼實驗僵直時間比較 在環(huán)境及聲音條件恐懼實驗中，膿毒癥組小鼠僵直時間均顯著短于假手術(shù)組，Dex組小鼠僵直時間均顯著長于膿毒癥組(P<0.05)。見表2。

表2 各組小鼠條件恐懼實驗僵直時間比較

2.3各組小鼠大腦海馬區(qū)EB含量及HMGB1、RAGE蛋白表達(dá)水平 假手術(shù)組、膿毒癥組和Dex組小鼠大腦海馬區(qū)EB含量分別為(49.96±9.98)、(72.96±15.99)及(56.99±11.23)μg/g，膿毒癥組小鼠大腦海馬區(qū)EB含量顯著高于假手術(shù)組，Dex組小鼠EB含量顯著低于膿毒癥組(P<0.05)。膿毒癥組小鼠大腦海馬區(qū)HMGB1、RAGE蛋白表達(dá)水平顯著高于假手術(shù)組，Dex組小鼠HMGB1、RAGE蛋白表達(dá)水平顯著低于膿毒癥組(P<0.05)。見圖1。

圖1 各組小鼠大腦海馬區(qū)HMGB1、RAGE蛋白表達(dá)水平Dex為右美托咪定，HMGB1為高遷移率族蛋白1，RAGE為晚期糖基化終末產(chǎn)物受體；與假手術(shù)組比較，aP<0.05；與膿毒癥組比較，bP<0.05

2.4各組小鼠大腦海馬區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞活化程度比較 假手術(shù)組、膿毒癥組和Dex組小鼠大腦海馬區(qū)Iba-1表達(dá)水平分別為(1.76±0.20)、(6.08±0.35)和(2.49±0.11)μg/g。膿毒癥組小鼠大腦海馬區(qū)Iba-1表達(dá)水平顯著高于假手術(shù)組，Dex組小鼠Iba-1表達(dá)水平顯著低于膿毒癥組(P<0.05)。

2.5各組小鼠外周血及大腦海馬區(qū)TNF-α、IL-6、IL-1β水平比較 膿毒癥組小鼠外周血及大腦海馬區(qū)TNF-α、IL-6、IL-1β水平均顯著高于假手術(shù)組(P<0.05)；Dex組小鼠外周血及大腦海馬區(qū)IL-6、IL-1β水平均顯著低于膿毒癥組(P<0.05)。見表3。

表3 各組小鼠外周血及大腦海馬區(qū)TNF-α、IL-6、IL-1β水平比較

3 討論

PRESCOTT和ANGUS[8]研究顯示，血腦屏障損傷在膿毒癥相關(guān)性腦病病理生理過程中扮演著重要角色，其通透性升高可導(dǎo)致大量炎性介質(zhì)進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，增強(qiáng)中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)[9]。小膠質(zhì)細(xì)胞處于M1狀態(tài)時被公認(rèn)為是中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)的“效應(yīng)放大器”[10]。WANG等[11]研究顯示，小膠質(zhì)細(xì)胞活化后可分泌HMGB1，并作為RAGE配體存在；HMGB1可激活血管內(nèi)皮細(xì)胞中的RAGE蛋白，并進(jìn)一步加劇血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)，最終導(dǎo)致血腦屏障破壞。

有學(xué)者分別采用丙泊酚及Dex對區(qū)域阻滯髖關(guān)節(jié)手術(shù)患者進(jìn)行干預(yù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)Dex干預(yù)患者較丙泊酚干預(yù)患者術(shù)后神經(jīng)認(rèn)知功能恢復(fù)佳[12]。KONG等[13]發(fā)現(xiàn)Dex可顯著減少脂多糖誘導(dǎo)的膿毒癥動物模型中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)，同時可抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)小膠質(zhì)細(xì)胞活化。MEI等[14]研究證實，Dex可顯著緩解外源性HMGB1誘發(fā)的神經(jīng)認(rèn)知功能障礙，有利于改善血腦屏障損傷。GAO等[15]研究顯示，Dex可阻斷激活后的小膠質(zhì)細(xì)胞分泌炎性因子，且該功能可被α2腎上腺素受體阻斷劑逆轉(zhuǎn)，說明Dex可直接調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞功能。

本結(jié)果顯示，膿毒癥可誘發(fā)小鼠大腦海馬區(qū)神經(jīng)炎癥反應(yīng)，并導(dǎo)致血腦屏障通透性升高，外周血及大腦海馬區(qū)TNF-α、IL-6、IL-1β水平和中樞神經(jīng)系統(tǒng)小膠質(zhì)細(xì)胞活化程度升高，除此之外，大腦海馬區(qū)HMGB1、RAGE蛋白表達(dá)水平亦顯著增加，加重了神經(jīng)功能障礙。XING等[16]研究顯示，中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥可誘發(fā)學(xué)習(xí)記憶能力障礙。QIU等[17]報道表明，采用剖腹探查術(shù)及異氟烷麻醉可加劇中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)，進(jìn)而導(dǎo)致小鼠神經(jīng)認(rèn)知功能障礙。而本實驗發(fā)現(xiàn)Dex經(jīng)腹腔注射后不僅可明顯緩解膿毒癥小鼠外周炎癥反應(yīng)，還可改善小鼠大腦海馬區(qū)炎癥反應(yīng)，此時大腦海馬區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞活化程度及HMGB1、RAGE蛋白表達(dá)水平隨之降低。除此之外，我們還發(fā)現(xiàn)Dex可改善膿毒癥誘發(fā)的血腦屏障損傷，有利于促進(jìn)小鼠神經(jīng)認(rèn)知功能恢復(fù)。

綜上，Dex可改善膿毒癥小鼠外周和大腦海馬區(qū)神經(jīng)炎癥反應(yīng)，減輕膿毒癥導(dǎo)致的血腦屏障通透性升高程度，有利于促進(jìn)神經(jīng)認(rèn)知功能的恢復(fù)。