飼料氨基酸的不同檢測(cè)方法在飼料生產(chǎn)中的比較研究

魏姜勉

（黃淮學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，河南駐馬店 463000）

隨著我國(guó)居民生活水平的不斷提升，人們對(duì)動(dòng)物蛋白質(zhì)的需求量不斷增加。動(dòng)物是人類食品中優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)的重要來(lái)源，發(fā)展畜牧養(yǎng)殖是一種快速提高畜禽類蛋白質(zhì)產(chǎn)量的重要科學(xué)手段（張浩然等，2021）。畜牧業(yè)的發(fā)展與飼料中蛋白質(zhì)的含量息息相關(guān)，飼料蛋白質(zhì)將會(huì)轉(zhuǎn)化為動(dòng)物蛋白質(zhì)，從而提高畜禽生長(zhǎng)速率，促進(jìn)飼料蛋白質(zhì)研究。蛋白質(zhì)是動(dòng)物飼料中的核心營(yíng)養(yǎng)成分，蛋白質(zhì)維持動(dòng)物機(jī)體組織更新和生命代謝活動(dòng)，是動(dòng)物組織細(xì)胞膜的重要組成物質(zhì)。因而，蛋白質(zhì)含量是衡量動(dòng)物飼料質(zhì)量的重要指標(biāo)，成為養(yǎng)殖戶的關(guān)注焦點(diǎn)（賀習(xí)文等，2021）。由于飼料中蛋白質(zhì)是由氨基酸組成，蛋白質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)代謝是以氨基酸代謝為主，氨基酸平衡是動(dòng)物代謝的關(guān)鍵點(diǎn)。

隨著動(dòng)物飼料質(zhì)量和安全性不斷提高，確定飼料中蛋白質(zhì)和氨基酸的合理配比，便于提高飼料蛋白質(zhì)的利用率。飼料中氨基酸比例和種類是衡量飼料質(zhì)量的重要參數(shù)（石長(zhǎng)波等，2021；辛娜等，2021；謝偉，2021）。飼料中氨基酸平衡會(huì)提高動(dòng)物對(duì)氨基酸的利用率，提高動(dòng)物生長(zhǎng)速率，進(jìn)而節(jié)約飼料資源。因此，飼料中氨基酸的結(jié)構(gòu)和組成是配制混合飼料的重要指標(biāo)，而快速、準(zhǔn)確測(cè)定動(dòng)物飼料中氨基酸含量已成為飼料研究熱點(diǎn)。魚(yú)粉中氨基酸比例極佳，與其他動(dòng)物氨基酸比例相似，飼料安全性好，便于消化，是重要的動(dòng)物蛋白質(zhì)來(lái)源，而豆粕是植物蛋白質(zhì)原料的代表，且抗?fàn)I養(yǎng)因子含量少，植物蛋白質(zhì)含量豐富，來(lái)源豐富，易于獲得，已成為理想的植物蛋白質(zhì)來(lái)源（謝偉，2021；孫播東等，2021；宋潔；2021）。因此，本研究選用魚(yú)粉和豆粕作為動(dòng)物飼料氨基酸的測(cè)定對(duì)象。飼料中含有的氨基酸比例和含量是檢測(cè)飼料質(zhì)量高低的重要指標(biāo)。目前，氨基酸的測(cè)定方法為常規(guī)化學(xué)分析、色譜分析和光譜分析等，利用鹽酸水解法測(cè)定氨基酸，該方法適用性強(qiáng)，易于蒸發(fā)，方便操作。本研究使用近紅外光譜儀對(duì)飼料樣品中氨基酸的含量進(jìn)行光譜掃描，準(zhǔn)確測(cè)定各種氨基酸的含量和常規(guī)成分分析，節(jié)約人力資源，對(duì)氨基酸進(jìn)行濕化學(xué)分析的數(shù)據(jù)作為基礎(chǔ)模型，對(duì)掃描樣品與濕化學(xué)分析結(jié)果對(duì)比，驗(yàn)證樣品模型的準(zhǔn)確性。本研究對(duì)氨基酸種類的處理方法和液相色譜儀分離進(jìn)行優(yōu)化，建立簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確的紫外檢測(cè)分析氨基酸方法，該方法分析速率快，靈敏度高，為分析飼料中氨基酸種類和含量提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 飼料樣品（大豆，豆粕，魚(yú)粉和混合飼料）

1.2 試驗(yàn)試劑 甲醇、氯化鈉、苯酚、雙氧水、甲酸、抗壞血酸、硝酸銀、茚三酮、乙二酸甲醚、2，4-二硝基氯苯、乙氰、碳酸氫鈉、乙酸鈉、冰乙酸、氫氧化鋰、苯酚、鹽酸、氫氧化鈉、低速離心機(jī)及乙酸-乙酸鈉緩沖溶液。

1.3 試驗(yàn)設(shè)備 氨基酸分析儀、剪刀、鑷子、飼料粉碎機(jī)、天平、恒溫箱、渦旋儀、濃縮儀和溫度控制儀、高效液相色譜儀、C18色譜柱、電子天平、電熱鼓風(fēng)干燥箱、pH酸度計(jì)、萬(wàn)用電爐、超聲波清洗儀、電熱加熱爐、水浴鍋以及真空抽水泵等。

1.4.1 飼料樣品的預(yù)處理 將飼料樣品放入飼料粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎，將其放入分析篩（40目），稱取0.2 g樣品放入安培瓶中，加入氫氧化鋰20 mL，馬上接入氮?dú)?，放入高溫水浴鍋中加熱?10℃水解，待其冷卻后將水解液放入100 mL容量瓶中加入乙酸鈉緩沖溶液定容，加入少量鹽酸進(jìn)行中和，調(diào)節(jié)液體pH，定容和搖勻，取25 mL溶液放入低速離心機(jī)中離心30 min，取試管中的上清液，取上清液過(guò)濾有機(jī)膜（0.45 um），放入高效液相色譜儀檢測(cè)。

1.4.2 飼料標(biāo)準(zhǔn)樣品的配置 稱量0.1 g（0.0001g）飼料中常見(jiàn)的 20種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)樣品，放置于250 mL容量瓶中，使用0.1 mol/L鹽酸定容，混勻，得到1000 mg/L的20種氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)液體，放入4℃冰箱中保存?zhèn)溆?。將原溶?000 mg/L 稀 釋 為 750、600、550、450、350、250、150、50和25mg/L的氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，放入4℃冰箱中備存。

1.4.3 飼料樣品曲線的制備 移取100 uL的750、600、550、450、350、250、150、50 和 25 mg/L的20種氨基酸的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液放入有機(jī)膜進(jìn)行過(guò)濾，進(jìn)樣量為10 uL，使用相關(guān)軟件進(jìn)行檢測(cè)。以20種氨基酸的濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制飼料樣品氨基酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4.4 高效色譜調(diào)節(jié)條件 高效液相色譜儀的調(diào)節(jié)條件為C18色譜柱，流動(dòng)相A為甲醇；B流動(dòng)相為乙酸-乙酸緩沖液，流動(dòng)相為1mol/min；進(jìn)樣品量為10 uL，柱溫度為32℃，紫外線波長(zhǎng)為280 nm，等度洗脫，A流動(dòng)相：B流動(dòng)相為=1：9。

1.5 微波水解-氨基酸分析方法 稱取一定量的飼料樣品，將其溶解于水中，加入1 mol/L的鹽酸溶液4.8 mL，當(dāng)飼料樣品全部濕潤(rùn)后沖入定量的氮?dú)?，固定瓶蓋，放入微波儀中，連接溫度傳感器，按照設(shè)定程序進(jìn)行操作，等待罐內(nèi)溫度降低到50℃取出水解液體，放入250 mL容量瓶中定容和過(guò)濾，將樣品放入氨基酸分析儀器中測(cè)定。

1.6 近紅外分析光譜法

1.6.1 飼料樣品預(yù)處理 本實(shí)驗(yàn)樣品均使用飼料粉碎儀進(jìn)行破碎，然后進(jìn)行混勻，放入4℃冰箱保存?zhèn)溆谩ｔ~(yú)粉樣品脫脂處理，然后烘干，再進(jìn)行粉碎。

1.6.2 樣品氨基酸測(cè)定 將飼料樣品加入蛋白質(zhì)裂解液后，制定標(biāo)準(zhǔn)氨基酸溶液和測(cè)定樣品氨基酸溶液，放入氨基酸分析儀中測(cè)定，采用梯度洗脫方式來(lái)洗脫氨基酸組成，組間加入氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液校正，對(duì)氨基酸樣品進(jìn)行定量測(cè)定，對(duì)所有樣品的氨基酸進(jìn)行濕化學(xué)測(cè)定。

為進(jìn)一步比較兩種快速檢測(cè)方法相對(duì)于原吸法檢測(cè)結(jié)果的一致性，明確兩種快速檢測(cè)方法各自的優(yōu)越性與局限性，本研究對(duì)三種方法針對(duì)同一批稻谷樣本的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)學(xué)上的初步分析，計(jì)算了三種方法之間的差異程度與相關(guān)性水平，探討了兩種快速檢測(cè)方法的實(shí)際應(yīng)用效果與使用范圍，以期對(duì)糧食收儲(chǔ)先檢后收工作提供幫助。

1.6.3 樣品模型建立 采用Win ISI III光譜分析軟件和OPUS軟件對(duì)19種氨基酸的化學(xué)測(cè)定值進(jìn)行相關(guān)聯(lián)性分析，建立豆粕和魚(yú)粉等飼料氨基酸和常規(guī)指標(biāo)含量分析預(yù)測(cè)模型。

1.6.4 檢驗(yàn)樣品的準(zhǔn)確性 采用近紅外光譜分析儀掃描驗(yàn)證樣品進(jìn)行預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)，與之前的數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)比，采用T檢驗(yàn)預(yù)測(cè)模型的正確性。

2 結(jié)果與分析

2.1 飼料氨基酸不同測(cè)定方法的水解條件對(duì)比分析 為了確定不同測(cè)量方法對(duì)飼料氨基酸水解時(shí)間的影響，選用魚(yú)粉和豆粕等試驗(yàn)樣品進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)，飼料樣品氨基酸水解方法按照不同測(cè)定方法條件設(shè)定的參數(shù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，對(duì)比結(jié)果如表1所示。微波水解處理飼料氨基酸樣品的溫度為165℃，處理時(shí)間為25 min，飼料樣品中水解氨基酸的值均超過(guò)標(biāo)準(zhǔn)水解條件氨基酸的值，高效液相色譜法水解飼料氨基酸樣品的溫度為150℃，水解時(shí)間為20 min，飼料中水解氨基酸的值接近標(biāo)準(zhǔn)條件的氨基酸值；近外光譜分析法水解飼料氨基酸的溫度為180℃，處理時(shí)間為28 min，飼料樣品中水解氨基酸的值遠(yuǎn)超過(guò)標(biāo)準(zhǔn)水解條件的氨基酸值；通過(guò)對(duì)比實(shí)驗(yàn)飼料氨基酸處理效果，高效液相色譜法水解氨基酸的時(shí)間最短，處理溫度最低，實(shí)驗(yàn)效果最佳。

表1 不同分析方法處理樣品氨基酸的對(duì)比分析

2.2 不同測(cè)定方法的水解鹽酸濃度飼料氨基酸峰面積的對(duì)比分析 將飼料樣品加入不同濃度梯度的鹽酸溶液（3、5、7、9、11mol/L）中，放入水浴鍋中水解后，取上清液過(guò)濾后放入氨基酸分析或高效液相色譜儀中測(cè)定氨基酸種類，以峰面積大小為指標(biāo)，確定最佳的鹽酸濃度。

在不同測(cè)定方法的飼料氨基酸樣品中分別加入不同濃度梯度的鹽酸，并測(cè)定氨基酸峰面積結(jié)果，分析結(jié)果如下圖1～3所示。試驗(yàn)結(jié)果表明，鹽酸溶液濃度從3 mol/L增加到7 mol/L時(shí)，隨著鹽酸濃度的增加，氨基酸的峰面積呈現(xiàn)遞增趨勢(shì)，其原因?yàn)辂}酸濃度太低，氨基酸沒(méi)有完全水解，當(dāng)濃度為7 mol/L時(shí)，氨基酸的峰面積最大，當(dāng)濃度從7 mol/L增加到11 mol/L時(shí)，氨基酸的峰面積呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，主要原因是鹽酸濃度較高，氨基酸結(jié)構(gòu)被破壞。通過(guò)對(duì)氨基酸峰面積的對(duì)比分析：高效液相色譜法的氨基酸峰面積較大，測(cè)定結(jié)果較好，而近外光譜分析法中氨基酸的峰面積較小，結(jié)果值較少。

圖1 微波水解-氨基酸自動(dòng)分析法的不同鹽酸濃度測(cè)定的氨基酸面積

圖2 高效液相色譜法的不同濃度鹽酸測(cè)定的氨基酸面積

圖3 近紅外光譜分析法的不同濃度鹽酸測(cè)定的氨基酸面積

2.3 不同分析方法對(duì)飼料氨基酸測(cè)定結(jié)果的影響 由表2可知，高效液相色譜測(cè)定飼料中氨基酸的組成與標(biāo)準(zhǔn)成分結(jié)果相似，各類氨基酸相似程度偏差范圍為0.01%～0.2%；微波處理方法測(cè)定飼料中氨基酸的組成與標(biāo)準(zhǔn)成分結(jié)果相差較大，各類氨基酸相似偏差范圍為2.34%～6.34%；近外光譜法測(cè)定飼料氨基酸的組成與標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定結(jié)果相差較小，偏差程度范圍為0.24%～0.98%；通過(guò)結(jié)果對(duì)比分析：高效液相色譜法測(cè)定飼料氨基酸的結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定結(jié)果相似，結(jié)果偏差程度較小。

表2 不同分析方法對(duì)飼料氨基酸的組成影響

2.4 不同分析方法對(duì)飼料氨基酸穩(wěn)定性分析 由表3可知，高效液相色譜測(cè)定飼料中氨基酸穩(wěn)定性與標(biāo)準(zhǔn)成分結(jié)果相似，各類氨基酸相似程度偏差范圍為0.01%～0.16%；微波處理方法測(cè)定飼料中氨基酸的穩(wěn)定性與標(biāo)準(zhǔn)成分結(jié)果相差較大，各類氨基酸相似偏差范圍為1.51%～4.55%；近外光譜法測(cè)定飼料氨基酸的穩(wěn)定性與標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定結(jié)果相差較小，偏差程度范圍為0.24%～0.68%；對(duì)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比分析發(fā)現(xiàn)，高效液相色譜法測(cè)定飼料氨基酸的穩(wěn)定性結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定結(jié)果相似，穩(wěn)定性較強(qiáng)。

表3 不同分析方法對(duì)飼料氨基酸穩(wěn)定性的影響

2.5 不同分析方法對(duì)不同飼料氨基酸總量測(cè)定結(jié)果比較分析 由表4可知，高效液相色譜法的測(cè)定結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定結(jié)果類似，變異系數(shù)與標(biāo)準(zhǔn)差最小，而微波水解處理方法測(cè)定其飼料氨基酸的總量高于飼料的標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定含量，變異系數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差較大，而近外光譜分析法對(duì)飼料氨基酸總量分析影響程度較小，標(biāo)準(zhǔn)差在0.13～0.26之間，綜合比較發(fā)現(xiàn)，3種檢測(cè)方法已達(dá)到檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，滿足飼料氨基酸檢測(cè)要求。

表4 不同分析方法對(duì)不同飼料氨基酸總量測(cè)定結(jié)果比較分析

3 討論

3.1 飼料氨基酸中不同分析方法的優(yōu)劣勢(shì)對(duì)比分析 本研究飼料樣品采用微波水解法進(jìn)行氨基酸測(cè)定。并確定微波水解條件為165℃，加熱25 min，該方式操作簡(jiǎn)單，縮短水解時(shí)間，提高飼料氨基酸的水解效率。飼料氨基酸的水解時(shí)間從原來(lái)20 h縮減為1 h，宋潔等（2021）對(duì)飼料蛋白質(zhì)烘箱加熱160℃進(jìn)行水解，水解時(shí)間為2 h；任曉宇等（2017）對(duì)飼料原料用加熱器進(jìn)行水解，加熱溫度為160℃，水解時(shí)間為50 min，這些結(jié)果證明，微波水解方法正確，160℃是氨基酸水解的合適溫度，能廣泛應(yīng)用于飼料氨基酸的檢測(cè)。微波是一種300MHz的電磁波，能被水和食品廣泛吸收，因而有機(jī)物能吸收電磁波能量而達(dá)到加熱效果，大大提高了反應(yīng)物的加熱效率，縮減加熱時(shí)間。水分子吸收微波能量效率極高，能快速完成飼料水解過(guò)程，提高飼料檢測(cè)效率，操作簡(jiǎn)單、節(jié)約能耗、安全環(huán)保、成本較低，且利用效率高。

本研究采用近紅外光譜分析法對(duì)飼料氨基酸樣品進(jìn)行分析，確定水解條件為175℃，加熱時(shí)間為28 min，應(yīng)用近紅外光譜分析技術(shù)對(duì)豆粕和魚(yú)粉等氨基酸含量建立預(yù)測(cè)模型，結(jié)果表明，近外光譜分析技術(shù)的基礎(chǔ)模型比較穩(wěn)定，對(duì)飼料氨基酸含量預(yù)測(cè)準(zhǔn)確，檢測(cè)時(shí)間快速。近紅外光譜分析技術(shù)是一種新型測(cè)定技術(shù)，可利用化學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)建立相關(guān)模型，可快速、準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)飼料氨基酸含量。石長(zhǎng)波等（2021）對(duì)食品檢測(cè)采用近紅外光譜分析方法，結(jié)果表明，近紅外光譜法可有效檢測(cè)食品質(zhì)量。謝偉等（2021）研究近紅外光譜分析技術(shù)在化工上的應(yīng)用分析，它能快速檢測(cè)結(jié)果，效率高，精準(zhǔn)度高，時(shí)效高，測(cè)試度數(shù)方便，檢測(cè)效果精準(zhǔn)（程傳民等，2020；張?jiān)傻龋?019）。這些結(jié)果表明，近紅外光譜分析法有效應(yīng)用于飼料氨基酸的檢測(cè)。

本研究采用高效色譜法對(duì)飼料氨基酸含量的測(cè)定，本方法水解溫度為160℃，時(shí)間為20 min，與前2種方法對(duì)比發(fā)現(xiàn)，該方法能有效縮短水解時(shí)間，提高水解效率，操作方便，檢測(cè)效率高，節(jié)約能量，降低工作強(qiáng)度，提高工作效率。因此，本研究采用高效液相色譜法對(duì)氨基酸的檢測(cè)效果更好。孫播東等（2021）發(fā)現(xiàn)，高效液相色譜法能精準(zhǔn)測(cè)定飼料中尼卡巴嗪含量，與本研究結(jié)果類似。本研究對(duì)色譜柱、流動(dòng)相及波長(zhǎng)進(jìn)行設(shè)定，建立氨基酸液相色譜法，且其氨基酸的測(cè)定含量在誤差范圍內(nèi)，精密度較高，說(shuō)明該方法的靈敏度、精準(zhǔn)度較高，能對(duì)飼料氨基酸進(jìn)行定量分析。

3.2 不同分析方法對(duì)飼料氨基酸測(cè)定的影響因素分析 本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同濃度的鹽酸對(duì)氨基酸峰面積有較大影響，鹽酸濃度過(guò)高，氨基酸峰面積下降，其原因可能是氨基酸被破壞；鹽酸濃度過(guò)低，氨基酸峰面積較小，其原因是氨基酸沒(méi)有被完全水解，使用高效液相光譜分析法測(cè)定氨基酸含量，向其樣品中加入不同濃度的鹽酸，氨基酸峰面積較高，這說(shuō)明該方法測(cè)定效率高，而近紅外光譜分析法中加入不同濃度氨基酸樣品，氨基酸峰面積較小，說(shuō)明飼料中氨基酸的含量測(cè)定與不同測(cè)定方法有關(guān)，也可能與樣品純度有關(guān)。

本研究不同分析方法對(duì)飼料氨基酸組成與穩(wěn)定性進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，高效液相色譜法對(duì)飼料氨基酸組成與穩(wěn)定性的分析精準(zhǔn)度較高，其結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)結(jié)果類似，偏差程度較小，而另外2種測(cè)定方法中飼料氨基酸的組成和穩(wěn)定性與標(biāo)準(zhǔn)結(jié)果誤差較大，偏差程度較大，但都在誤差范圍內(nèi)，這表明高效液相色譜法的精準(zhǔn)度較高，在一定程度上反映出飼料氨基酸含量。因此，對(duì)飼料樣品中進(jìn)行抽查氨基酸含量時(shí)，應(yīng)根據(jù)實(shí)際情況采用不同的分析方法。

目前，分析飼料中氨基酸的不同檢測(cè)方法發(fā)現(xiàn)，高效液相色譜法的測(cè)定結(jié)果較為精準(zhǔn)，但其也存在一定缺陷，如攜帶不方便、建立標(biāo)準(zhǔn)模型耗時(shí)；但近紅外光譜法的模型建立不太精準(zhǔn)，測(cè)定水平參差不齊。因而，對(duì)飼料樣品中氨基酸含量的檢測(cè)應(yīng)根據(jù)實(shí)際情況采用相應(yīng)方法進(jìn)行測(cè)定。

4 結(jié)論

本研究對(duì)微波水解法、近紅外光譜分析法和高效液相色譜法的優(yōu)劣勢(shì)進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高效液相色譜法操作方便，檢測(cè)精準(zhǔn)度高，檢測(cè)效率高，適用于飼料氨基酸含量的批量檢測(cè)。