痘病毒編碼的蛋白對(duì)NF-κB信號(hào)通路調(diào)控作用研究進(jìn)展

王憲軍，向 華

（西南民族大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，四川 成都 610041）

NF-κB是機(jī)體先天性免疫和獲得性免疫的重要核轉(zhuǎn)錄因子，對(duì)機(jī)體免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)起關(guān)鍵性作用[1-2]。在病毒感染宿主的初期，病毒誘導(dǎo)宿主細(xì)胞NF-κB等信號(hào)通路的活化，產(chǎn)生以干擾素（IL）-1α、IL-6和IL-8細(xì)胞因子為主的信號(hào)分子，調(diào)節(jié)宿主天然免疫應(yīng)答。經(jīng)典的NF-κB信號(hào)通路激活方式與天然免疫反應(yīng)密切相關(guān)，即當(dāng)細(xì)胞受病毒感染時(shí)，經(jīng)過細(xì)胞質(zhì)內(nèi)一系列的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)后，最終將信號(hào)匯集到IκB激酶復(fù)合體（IKK），使其活化，導(dǎo)致IκBα磷酸化，以及泛素化，隨后在26s蛋白酶體的作用下IκBα發(fā)生降解，從而導(dǎo)致NF-κB的釋放。

盡管病毒的感染能引起宿主的免疫應(yīng)答，但目前研究已證實(shí)，在感染哺乳動(dòng)物的病毒中，痘病毒科、黃病毒科、皰疹病毒科、非洲豬瘟病毒科、呼腸孤病毒科和布尼病毒科家族等病毒擁有NF-κB活性的抑制劑，存在抑制NF-κB信號(hào)通路的現(xiàn)象[3-5]。痘病毒是目前已知基因序列大、復(fù)雜及宿主譜廣的病毒[6]，具有獨(dú)特的調(diào)節(jié)宿主各種免疫應(yīng)答過程的能力，特別是痘病毒編碼的蛋白對(duì)NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)進(jìn)行調(diào)控，有利于病毒在宿主細(xì)胞內(nèi)復(fù)制，進(jìn)而逃逸宿主的免疫應(yīng)答[7-8]。盡管在痘病毒科屬疾病防控中出現(xiàn)了一些有力的、典型的免疫反應(yīng)方面抗病毒的藥物，但正由于痘病毒存在逃逸宿主的免疫應(yīng)答的能力，導(dǎo)致病毒不斷地逃逸免疫保護(hù)，如在實(shí)際生產(chǎn)中羊群出現(xiàn)反復(fù)感染病毒的現(xiàn)象。因此探索痘病毒科編碼的蛋白調(diào)節(jié)NF-κB信號(hào)通路的機(jī)制已成為目前痘病毒研究的熱點(diǎn)。本研究主要綜述近些年痘病毒編碼的蛋白通過不同的途徑調(diào)節(jié)NF-κB信號(hào)通路的調(diào)控作用，為進(jìn)一步對(duì)宿主細(xì)胞早期抗病毒的免疫應(yīng)答方面的研究奠定基礎(chǔ)。

1 NF-κB信號(hào)通路及其調(diào)控機(jī)體天然免疫應(yīng)答的作用

在病毒感染宿主的初期，病毒誘導(dǎo)宿主細(xì)胞NF-κB等信號(hào)通路的活化，產(chǎn)生以細(xì)胞因子為主的信號(hào)分子，調(diào)節(jié)宿主天然免疫應(yīng)答。宿主細(xì)胞利用自身分泌的Ⅰ型干擾素IFNs（IFN-α和IFN-β）干擾病毒的復(fù)制。然而，病毒快速地進(jìn)化出獨(dú)特的致病機(jī)理，削弱宿主細(xì)胞天然抗病毒免疫，特別是針對(duì)在機(jī)體天然免疫早期起重要作用的NF-κB信號(hào)通路的抑制作用[9]。

NF-κB是一種廣泛存在于多種真核細(xì)胞的核轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控細(xì)胞一系列基因的表達(dá)，進(jìn)而影響機(jī)體先天免疫和獲得性免疫、細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)、細(xì)胞黏附、以及細(xì)胞凋亡和增殖[10-11]。哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)，NF-κB家族由NF-κB1（p50/p105）、NF-κB2（p52/p100）、RelA（p65）、RelB和c-Rel 5種相關(guān)聯(lián)的轉(zhuǎn)錄因子組成[12]，通常以二聚體的形式存在于細(xì)胞內(nèi)，不同的二聚體識(shí)別特異DNA調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄。RelA（p65）、RelB和c-Rel蛋白的N端為Rel同源結(jié)構(gòu)域（RHD），對(duì)二聚體的形成和DNA的結(jié)合發(fā)揮作用，而C端為調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的活性區(qū)域。NF-κB1（p50）、NF-κB2（p52）分別作為p105和p100的前體蛋白，N端為Rel同源結(jié)構(gòu)域（RHD），C端為錨蛋白重復(fù)序列區(qū)，對(duì)泛素依賴的蛋白酶解加工發(fā)揮著作用。NF-κB常見的組成形式是p50/p65異二聚體。大部分細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，IκB蛋白通過其N端的錨蛋白重復(fù)序列區(qū)與p50/p65異二聚體相結(jié)合，形成IκBα/p65/p50復(fù)合體，遮擋了NF-κB的核定位序列，從而導(dǎo)致NF-κB以非活性的形式存在于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)[13]。

NF-κB信號(hào)通路的活化是一個(gè)復(fù)雜的過程，且受多種刺激的影響，如細(xì)菌、病毒、細(xì)胞因子、DNA損傷、氧化應(yīng)激和輻射等[14]。目前對(duì)于NF-κB信號(hào)通路活化機(jī)制的研究已在人[15]、豬[16]、鼠[17]、兔[18]、牛[19]和羊[20]等物種中證實(shí)，且具有高度的物種保守性。NF-κB的激活途徑主要分經(jīng)典途徑和非經(jīng)典途徑，經(jīng)典途徑的激活方式與天然免疫反應(yīng)密切相關(guān)，即當(dāng)細(xì)胞受病毒感染或其他促炎介質(zhì)刺激時(shí)，經(jīng)過細(xì)胞質(zhì)內(nèi)一系列的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)后，最終將信號(hào)匯集到IκB激酶復(fù)合體（IKK），使其活化，導(dǎo)致IκBα磷酸化（在IκBα的Ser32、Ser36），隨后磷酸化的IκBα被泛素化，即在含有F-box結(jié)構(gòu)域的泛素連接酶復(fù)合物SCF（SkpI-Cull-FBP）作用下使IκBα的Lys21和Lys22上發(fā)生泛素化，隨后在26s蛋白酶體的作用下IκBα發(fā)生降解，從而導(dǎo)致NF-κB的釋放[21-22]。同時(shí)IKK也存在負(fù)調(diào)控的作用，主要是IKKβ上C端絲氨酸的磷酸化作用，從而抑制NF-κB信號(hào)通路的活化[23]。隨著NF-κB釋放到細(xì)胞核后，其連接到一個(gè)DNA共有序列5'-GGGACTTTCC-3'（κB成分），隨后在細(xì)胞核內(nèi)啟動(dòng)第二水平的轉(zhuǎn)錄活性調(diào)控，主要包括NF-κB的磷酸化和乙?；饔茫碦elA在蛋白激酶A（PKA）的作用下發(fā)生磷酸化，從而促進(jìn)NF-κB與轉(zhuǎn)錄因子CBP/p300的結(jié)合，有力地增強(qiáng)基因的反式激活作用。同時(shí)，糖原合成酶激酶（GSK-3β）對(duì)于NF-κB轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)節(jié)也具有作用，而NF-κB直接或可逆的乙?；幻枋鲎鳛镹F-κB活性額外的調(diào)節(jié)機(jī)制作用[24]。在NF-κB通路非經(jīng)典途徑中，NF-κB2（p100）與RelB形成異源二聚體，當(dāng)細(xì)胞受到淋巴毒素β受體（LTβR）、腫瘤壞死因子家族的B細(xì)胞活化因子（BAFF）、CD40配體等因子刺激時(shí)，p100的C端兩個(gè)位點(diǎn)磷酸化依賴的泛素化降解后加工成p52，一旦降解，p52的N端被釋放，導(dǎo)致p52-RelB二聚體的細(xì)胞核移位，啟動(dòng)靶基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)[25]。

阻礙NF-κB信號(hào)通路活化的病毒抑制劑分為兩類：一種為病毒分泌的配體，通過與可溶性的病毒受體或者細(xì)胞因子的相互作用來阻礙NF-κB活化信號(hào)的啟動(dòng)；另一種是細(xì)胞內(nèi)存在的NF-κB抑制劑，主要為病毒編碼的蛋白，這些蛋白往往存在錨蛋白重復(fù)序列（ankyrinrepeat,ANKs）和PYD域NF-κB抑制劑，在細(xì)胞內(nèi)影響NF-κB信號(hào)通路[4]。

2 痘病毒編碼的蛋白對(duì)NF-κB信號(hào)通路的調(diào)控作用

抑制細(xì)胞內(nèi)NF-κB活性的功能已在痘病毒家族內(nèi)存在，且NF-κB信號(hào)通路是痘病毒家族抑制和逃避宿主免疫應(yīng)答的主要靶點(diǎn)[26-27]。阻礙NF-κB信號(hào)通路活化的痘病毒抑制劑同樣包括病毒分泌的配體和細(xì)胞內(nèi)存在的NF-κB抑制劑，即病毒編碼的蛋白。例如，黏液瘤病毒（Myxoma virus,MYXV）分泌的可溶性T2蛋白，在1991年首次被鑒定為細(xì)胞因子TNF的受體（vTNFR），T2蛋白與TNF結(jié)合后抑制了宿主細(xì)胞質(zhì)內(nèi)NF-κB的激活[28]。天花病毒（Variola,VARV）、猴痘病毒（Monkeypow virus,MPXV）和豬痘病毒（Swinepox virus）編碼一種能與IL-18結(jié)合的蛋白，通過阻止NF-κB的激活來調(diào)節(jié)宿主的抗病毒能力[29]。細(xì)胞內(nèi)存在的NF-κB抑制劑，即病毒編碼的蛋白主要通過以下4種途徑抑制NF-κB信號(hào)通路。

2.1 抑制依賴宿主細(xì)胞內(nèi)Toll樣受體（Toll-like receptors,TLRs）介導(dǎo)的NF-κB的激活

如痘苗病毒（Vaccinia virus,VACV）編碼的蛋白A46和A52，兩者與TIR的胞漿內(nèi)結(jié)構(gòu)域具有氨基酸序列相似性。研究已證實(shí)，A52能通過TLR家族成員，包括IL-1R、IL-18R、TLR4和TLR3的調(diào)節(jié)作用，使得A52與IRAK2和TRAF6的結(jié)合，從而抑制轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的活化[30-31]。A46蛋白通過結(jié)合承接分子MyD88、MAL、TRIF和TRAM等蛋白阻止TIR結(jié)構(gòu)域和承接分子之間的相互作用，從而干擾下游MAPK和NF-κB的激活[32]。羊口瘡病毒（Orf virus,ORFV）編碼的002蛋白通過抑制MSK1介導(dǎo)的NF-κB p65 Ser276的磷酸化，從而抑制NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性[33]。VACA編碼的蛋白A52和K7能與腫瘤壞死因子受體相關(guān)分子6（TNF receptor-associated factor 6,TRAF6）相互作用，抑制其激酶活化，間接抑制NF-κB的激活[34]。

2.2 病毒編碼的蛋白通過與IKK復(fù)合物發(fā)生直接或間接的相互作用來抑制NF-κB信號(hào)通路

研究報(bào)道，VACV編碼的蛋白N1L能通過與IKKα、IKKβ、IKKγ、TBK1之間發(fā)生直接的相互作用，從而抑制NF-κB信號(hào)通路的活化[35]。傳染性軟疣病毒（Molluscum contagiosum virus,MCV）編碼的蛋白MC160，通過與Hsp90和蛋白酶-8的結(jié)合，抑制Hsp90與IKKα之間的相互作用，從而降低IKKα的穩(wěn)定性，抑制NF-κB活性[36]。2008年Chen等研究發(fā)現(xiàn)，VACV編碼的蛋白B14R，能通過特異性地與IKKβ相互作用，抑制IKKβ的Ser177和Ser181發(fā)生磷酸化，從而抑制NF-κB的活化[37]。VACV編碼的錨蛋白K1L可通過抑制IκBα的降解從而阻斷兔腎細(xì)胞（RK-13）TLR2、TLR4和TLR9介導(dǎo)的NF-κB信號(hào)通路[38]。在病毒感染的早期，ORFV 119基因編碼的蛋白以依賴視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白（retinoblastoma protein,pRb）抑制IκB激酶（IκB kinase,IKK）復(fù)合物的激活，從而抑制NF-κB信號(hào)通路[39]。ORFV073與MCV編碼的蛋白MC005都可通過與IKK亞基NEMO結(jié)合來抑制IKK復(fù)合物的活性，從而抑制NF-κB信號(hào)通路[40-41]。VACA編碼的蛋白B15，可通過與IKK復(fù)合物的結(jié)合抑制IκBα的磷酸化和降解。

2.3 病毒編碼的蛋白通過與SCFβ-TrCP復(fù)合物的相互作用來抑制NF-κB的活化

例如，VARV編碼的蛋白G1R，VACV編碼的蛋白CP77，其C末端的F-box樣結(jié)構(gòu)域與SCF復(fù)合物中的Skp1蛋白結(jié)合而阻止IκBα蛋白磷酸-泛素化降解而抑制NF-κB的活化[42-43]。

2.4 與轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的相互作用來影響NF-κB的信號(hào)通路

VACV編碼的CP77蛋白通過其末端的6個(gè)ANK重復(fù)基序以及C末端的F-Box樣結(jié)構(gòu)域共同結(jié)合NF-κB-p65而抑制NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)活性[44]；MYXV編碼的蛋白M150，被認(rèn)為是黏液瘤核轉(zhuǎn)錄因子（MNF），含有與IκBα的核定位信號(hào)序列（ANK重復(fù)序列）相似性，已顯示該蛋白與p65具有共區(qū)域化，從而削弱了p65的轉(zhuǎn)錄活性以及負(fù)向的調(diào)控依賴NF-κB活化信號(hào)因子的產(chǎn)生[45]。MCV編碼的M150R蛋白可通過其第8個(gè)ANK基序干擾NF-κB的核轉(zhuǎn)移，進(jìn)而影響其免疫調(diào)控活性[46]。在細(xì)胞漿，ORFV 121基因編碼的NF-κB抑制劑能和NF-κB-p65 發(fā)生物理性結(jié)合，抑制NF-κB-p65的磷酸化和核轉(zhuǎn)運(yùn)，從而阻止了免疫相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯[47]。

3 具有多個(gè)多錨蛋白重復(fù)（ANKs）基序的錨蛋白參與NF-κB信號(hào)通路調(diào)控的作用及展望

錨蛋白重復(fù)序列（ankyrin repeat,ANKs）是普遍存在于生物體中的一種由33個(gè)氨基酸殘基基序組成的蛋白質(zhì)序列模體，由兩個(gè)α螺旋和一個(gè)loop區(qū)構(gòu)成，在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞骨架完整性、細(xì)胞周期調(diào)控、免疫應(yīng)答、蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)等過程中均具有重要作用[48]。ANKs不僅存在于生物體，也存在于痘病毒編碼的蛋白，而其他病毒幾乎不編碼錨蛋白。錨蛋白作為痘病毒編碼的蛋白中最大的家族，其特征是具有ANKs的N末端和1個(gè)F-Box樣的C末端結(jié)構(gòu)域[49-51]。已有研究報(bào)道，與痘病毒編碼的蛋白相似，錨蛋白可通過多層次的方式來影響NF-κB信號(hào)通路。

例如，VARV編碼的蛋白G1R，VACV編碼的蛋白CP77，兩者均可通過其N端的ANK重復(fù)基序，分別與NF-κB1/p105，NF-κB p65蛋白直接或間接結(jié)合抑制宿主NF-κB的活化[42-43，52]。2014年Lamb等發(fā)現(xiàn)，MYXV編碼的錨蛋白M-T5、M148R、M149R和M150R均能抑制NF-κB p65蛋白從細(xì)胞質(zhì)遷移到細(xì)胞核，減少細(xì)胞核內(nèi)NF-κB p65的聚集，抑制或者降低NF-κB信號(hào)通路的活性[53]。同樣VACV編碼的蛋白K1L可通過對(duì)NF-κB信號(hào)途徑不同位點(diǎn)的作用而調(diào)控宿主的天然抗病毒免疫應(yīng)答[54]。對(duì)牛痘（Cowpox virus）ANK重復(fù)蛋白cpxv-006功能作用的敲除研究表明，cpxv-006突變體能夠誘導(dǎo)NF-κB p105亞單位的降解，這對(duì)NF-κB活性的調(diào)節(jié)有明顯的影響[43]。ORFV編碼5個(gè)結(jié)構(gòu)相似的錨蛋白，即ORF008、ORF123、ORF126、ORF128和ORF129，它們都具有個(gè)數(shù)不等的ANK基序和1個(gè)F-box-like結(jié)構(gòu)域[55]。對(duì)于ORFV編碼的5種錨蛋白，ORF008、ORF123能阻止經(jīng)TNF-α刺激NF-κB活化后IκBα蛋白磷酸化降解過程并能抑制NF-κB p65蛋白核移位，而影響NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[56]。ORF128蛋白在病毒感染早期表達(dá)且定位于宿主的細(xì)胞核，通過抑制IκBα蛋白磷酸化降解過程，阻止NF-κB p65蛋白核移位，進(jìn)而抑制宿主NF-κB信號(hào)通路的活化[57]。ORF126蛋白表達(dá)后靶向定位于線粒體內(nèi)，且ORF126編碼的AR8和AR9對(duì)錨蛋白定位于線粒體內(nèi)起著關(guān)鍵性的作用，對(duì)于ORF126蛋白的功能目前不清楚，仍需進(jìn)一步研究[48]。ORF129含有6個(gè)ANK基序的N末端和1個(gè)F-Box樣的C末端結(jié)構(gòu)域，由此推測(cè)ORFV編碼的ORF129蛋白也可能通過抑制NF-κB p65和SCF、E3泛素連接酶復(fù)合物，阻止NF-κB遷移至細(xì)胞核，以逃避宿主的天然免疫應(yīng)答[58]。因此，痘病毒編碼的蛋白，特別是痘病毒內(nèi)具有ANKs基序的錨蛋白，可能通過對(duì)NF-κB信號(hào)途徑的不同位點(diǎn)的作用而調(diào)控宿主的天然抗病毒免疫應(yīng)答，這也是豐富痘病毒感染宿主細(xì)胞的致病機(jī)理方面研究發(fā)展的方向。

4 小結(jié)

痘病毒編碼的蛋白通過影響與宿主天然免疫密切相關(guān)的NF-κB信號(hào)通路，有利于病毒在宿主細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制，導(dǎo)致病毒不斷地逃逸免疫保護(hù)而出現(xiàn)病毒的反復(fù)感染。因此，探索痘病毒編碼的蛋白調(diào)節(jié)NF-κB信號(hào)通路的機(jī)制已成為目前該科病毒屬研究的方向，將為進(jìn)一步闡明NF-κB信號(hào)通路對(duì)病毒感染的反應(yīng)、識(shí)別該途徑的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，從而開發(fā)針對(duì)該靶點(diǎn)潛在的治療藥物，以及疫苗候選株的培育提供科學(xué)依據(jù)。