榛蘑總皂苷純化工藝優(yōu)化及抑制酶活性

佟喜旺，羅亞楠，寧波，于麗穎

吉林化工學(xué)院（吉林 132022）

東北榛蘑是我國東北的主要特產(chǎn)之一，故名東北榛蘑。其多生長在大興安嶺原始森林，在吉林、河北、山西、甘肅、青海、四川、浙江、云南一帶也有分布。在針葉樹和闊葉樹的根部，我們都能看到它的身影，每年7—8月就可以采收[1]。資料顯示，榛蘑為真菌植物門真菌蜜環(huán)菌的子實(shí)體，是迄今為止為數(shù)不多的被人們所認(rèn)知但仍然無法人工培育的野生菌類，在東北大興安嶺地區(qū)，榛蘑是僅次于人參、鹿茸、貂皮的“大東北第四寶”，營養(yǎng)價(jià)值極高，堪稱名副其實(shí)的“山珍”。食用榛蘑滑嫩爽口、味道鮮美、營養(yǎng)豐富，具有平肝明目、溫胃養(yǎng)肺、祛風(fēng)活絡(luò)等功效[2]。經(jīng)常食用，對身體具有很好的滋補(bǔ)和輔助治療疾病作用。因此被一些發(fā)達(dá)國家列為一類保健食品。

近些年研究表明，榛蘑含有的化學(xué)成分具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖、降糖、降脂、抗衰老、利肝等保健效果[3-7]，是一種潛在的保健品開發(fā)產(chǎn)品。榛蘑總皂苷作為化學(xué)成分之一，但對榛蘑總皂苷的純化卻少有報(bào)道。純化皂苷的方法主要有乙酰精制法、大孔吸附樹脂法、中性氧化鋁法等。其中大孔樹脂純化方法具有成本低、效率高、可循環(huán)利用、操作簡單等優(yōu)點(diǎn)，能高效地純化天然產(chǎn)物中的有效成分，是天然產(chǎn)物研究過程中不可或缺的分離提取技術(shù)[8-12]。

以回收率為指標(biāo)，對6種不同類型的大孔吸附樹脂進(jìn)行考察，優(yōu)化出最佳純化榛蘑總皂苷條件。因此，開發(fā)利用東北天然榛蘑菌類資源，優(yōu)化榛蘑總皂苷純化工藝條件，對開發(fā)榛蘑類保健品和帶動?xùn)|北天然資源經(jīng)濟(jì)有著重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

東北榛蘑（產(chǎn)于東北長白山）；菝葜皂苷元（純度99%，上海源葉生物有限公司）；甲醇（分析純）；高氯酸（分析純，天津大茂試劑廠）；大孔吸附樹脂（HPD-500、HPD-300、HPD-100、AB-8、D101、NKA-9，中國東鴻化工有限公司）。

SHZ-D循環(huán)水式多用真空泵（上海力辰邦西儀器科技有限公司）；電熱恒溫震蕩箱（上海天呈實(shí)驗(yàn)儀器制造有限公司）；TU-1950型紫外分光光度計(jì)（天津普析儀器有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密稱取19 mg菝葜皂苷元標(biāo)準(zhǔn)品，定容至50 mL，分別取2，4，6，8和10 mL母液甲醇定容至10 mL，分別取1 mL置于容量瓶中，水浴加熱，揮干甲醇后，加入5 mL高氯酸，在70 ℃下加熱15 min后，冷卻至室溫測其吸光度，甲醇作空白對照。繪制出菝葜皂苷元濃度（y）-吸光度（x）的標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性方程為y=0.453 8x-0.147 1（R2=0.999 8），榛蘑皂苷濃度在0.076~0.38 mg/mL范圍內(nèi)，吸光度呈現(xiàn)良好線性關(guān)系。

1.2.2 榛蘑總皂苷的制備和含量測定

取干燥至恒重的榛蘑，粉碎機(jī)粉碎，過0.180 mm（80目）孔徑篩，稱取一定量榛蘑粉末，在一定條件下進(jìn)行水熱提取，過濾，濾液旋干，加入80%乙醇水溶液醇沉12 h，再次過濾、旋干，蒸餾水溶解后倒入分液漏斗中，加入一定量正丁醇萃取，旋干，得到榛蘑總皂苷。

采用高氯酸比色法[13]，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線，測定榛蘑提取物中總皂苷含量。

1.3 大孔吸附樹脂篩選和靜態(tài)吸附-解析試驗(yàn)

1.3.1 大孔吸附樹脂預(yù)處理

稱取適量的HPD-500、HPD-300、HPD-100、AB-8、D101、NKA-9這6種大孔吸附樹脂，置于錐形瓶中，加入高于樹脂3 cm的95%以上的乙醇浸漬4 h，蒸餾水淋洗至流出液用水稀釋不渾濁即可，用水反復(fù)洗到無明顯醇味時(shí)為止，樹脂表面上保持2~5 mm液體，以免干柱，備用。

1.3.2 最佳大孔吸附樹脂篩選

稱取3 g不同型號的大孔樹脂置于錐形瓶中，加入一定濃度的榛蘑皂苷提取液，放在搖床中，30 ℃，200 r/min，振蕩2 h，靜止吸附24 h，測定吸附后溶液中的榛蘑皂苷含量，通過式（1）算出吸附率。將過濾出的樹脂重新放回至錐形瓶中，加入甲醇，于30 ℃200 r/min，振蕩2 h，靜止解析24 h，過濾，測定濾液中榛蘑皂苷的含量。通過式（2）和（3）計(jì)算出解析率和回收率。

式中：m0為榛蘑皂苷的質(zhì)量，mg；me為吸附達(dá)到飽和后榛蘑皂苷質(zhì)量，mg；Qe為吸附率，%；Dd為解析率，%；R為回收率，%。

1.3.3 靜態(tài)吸附-解析單因素試驗(yàn)

確定最佳的大孔吸附樹脂類型后，以解析液體積（20，30，40，50和60 mL）、吸附液質(zhì)量濃度（4，5，6，7和8 mg/mL）、吸附液體積（20，30，40，50和60 mL）為考察因素，榛蘑總皂苷回收率（%）為考察指標(biāo)，進(jìn)行榛蘑總皂苷靜態(tài)吸附-解析單因素試驗(yàn)。

1.3.4 靜態(tài)吸附-解析曲面響應(yīng)試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)，以解析液體積（A）、吸附液質(zhì)量濃度（B）、吸附液體積（C）為因素，皂苷回收率為考察指標(biāo)，設(shè)計(jì)出榛蘑皂苷靜態(tài)吸附-解析因素水平表。見表1，并進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

表1 榛蘑皂苷靜態(tài)吸附-解析響應(yīng)面因素水平設(shè)計(jì)表

1.4 酶活性抑制試驗(yàn)

1.4.1α-葡萄糖苷酶活性抑制試驗(yàn)

在黃盼盼等[14]的方法上進(jìn)行改進(jìn)，以PNPG（對硝基苯-α-葡萄糖苷）為底物。在PBS（0.10 mol/L pH 6.8）緩沖體系中，阿卡波糖為陽性對照。將榛蘑總皂苷溶于甲醇中，取試劑瓶分別加入2.5 mL PBS溶液0.25 mL、2.5 U/mL的α-葡萄糖苷酶溶液、0.5 mL不同濃度的待測樣品，在37 ℃下保溫15 min后，加入1 mL 1 mmol/L的PNPG溶液，在37 ℃下保溫30 min后，加入2.5mL 5 mmol/L的Na2CO3終止反應(yīng)，在405 nm處測定吸光度，按照式（4）計(jì)算抑制率。

式中：A為抑制率，%；A0為空白對照組試驗(yàn)吸光度；A1為不同濃度總皂苷試驗(yàn)吸光度；A2為不同濃度總皂苷干擾試驗(yàn)吸光度。

1.4.2α-淀粉酶活性抑制試驗(yàn)

在包瑞敏等[15]的方法上進(jìn)行改進(jìn)，通過碘-淀粉比色法測定榛蘑總皂苷對α-淀粉酶活性抑制效果。試驗(yàn)在0.1 mol/L pH 7.0的磷酸鉀緩沖體系進(jìn)行酶活性的測定。取試劑瓶，分別加入2 mL磷酸鉀緩沖液、100 μL不同濃度的待測樣品、2 mL 0.4 g/L的淀粉溶液。在37 ℃下保溫5 min后加入100 μL 0.01 mg/mLα-淀粉酶，在37 ℃下保溫10 min，加入0.01 mol/L碘液。在660 nm處測定吸光度，按照式（5）計(jì)算抑制率。

式中：B為抑制率，%；B0為空白對照組試驗(yàn)吸光度；B1為不同濃度總皂苷試驗(yàn)吸光度；B2為不同濃度總皂苷干擾試驗(yàn)吸光度。

2 結(jié)果與討論

2.1 篩選大孔吸附樹脂的型號

不同型號大孔吸附樹脂對榛蘑總皂苷吸附-解析能力見表2。

由表2可知，不同大孔吸附樹脂對榛蘑總皂苷的吸附能力不同，D101型大孔吸附樹脂的吸附率、解析率和回收率均高于其他類型樹脂，因此選擇D101型大孔樹脂進(jìn)行純化榛蘑提取物總皂苷純化的試驗(yàn)。

表2 不同類型大孔吸附樹脂對榛蘑總皂苷的吸附-解析能力 單位：%

2.2 D101型大孔樹脂純化試驗(yàn)

2.2.1 單因素純化試驗(yàn)

對影響榛蘑皂苷純化回收率的單因素進(jìn)行考察，結(jié)果表明解析液用量、吸附液質(zhì)量濃度、吸附液用量對回收率都有影響。試驗(yàn)結(jié)果如圖1~圖3所示。

圖1 解析液體積用量考察結(jié)果

圖2 吸附液濃度考察結(jié)果

圖3 吸附液用量考察結(jié)果

2.2.2 響應(yīng)面優(yōu)化純化試驗(yàn)

對表3進(jìn)行多元方程回歸擬合，得到回歸方程：回收率（%）=53.87-1.39A-0.18B+1.15C+0.58AB+0.43AC-1.17BC-7.95A2-10.69B2-2.63C2，對回歸方程進(jìn)行方差分析，見表4。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

表4 方差分析結(jié)果

由表4可知，該模型F=18.34，p＜0.01說明所建立的模型達(dá)到極顯著水平。該模型的調(diào)整確定系數(shù)為R2=0.959 3，說明在該模型中對95.93%的響應(yīng)值有說服力，校正決定系數(shù)Radj2為0.907 0，因此說明該模型的建立可信度很高；失擬項(xiàng)F=32.88，說明失擬度對純誤差是不顯著的，p=0.002 8，可知誤差對失擬項(xiàng)的影響為0.28%。根據(jù)F值的大小可以看出3個(gè)因素對回收率的影響為A＞C＞B。

通過2個(gè)因素相互作用和等高線的形狀反映各個(gè)因素之間影響程度的大小，通過圖4可以看出，在3個(gè)因素中，任意2個(gè)因素交互作用顯著，其中解析液體積（A）和吸附液濃度（B）對榛蘑皂苷回收率影響極其顯著。根據(jù)圖4結(jié)果，應(yīng)用Design-Expert 8.0.6軟件優(yōu)化出最佳回收率條件：解析液體積55.85 mL、吸附液濃度5.46 mg/mL、吸附液體積30 mL，此時(shí)回收率為56.37%。為驗(yàn)證預(yù)測值的準(zhǔn)確性，調(diào)整條件為解析液體積56 mL、吸附液質(zhì)量濃度5.5 mg/mL、吸附液體積30 mL。在該條件下進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，其平均回收率為56.12%。

圖4 不同影響因素交互作用的響應(yīng)曲面和等高線圖

通過最佳純化榛蘑總皂苷工藝條件對榛蘑粗皂苷進(jìn)行提純，未經(jīng)純化的榛蘑總皂苷的含量為34.51%，純化后的平均總皂苷含量達(dá)到63.5%。

表5 純化后的榛蘑總皂苷含量

2.3 抑制酶活性測定試驗(yàn)

糖尿病作為一種高血糖型的慢性疾病，近些年發(fā)病率逐年升高，而作為能有效治療糖尿病的新型藥物α-葡萄糖苷酶抑制劑和α-淀粉酶抑制劑對身體有著肝損傷、胃脹、腹瀉等副作用。所以，開發(fā)一種藥食同源的天然的抑制劑有著重要研究意義。

從圖5看出：隨著榛蘑總皂苷質(zhì)量濃度增加，榛蘑總皂苷對a-葡萄糖苷酶和a-淀粉酶抑制率先增加后趨于平緩；質(zhì)量濃度25 mg/mL時(shí)，a-葡萄糖苷酶和a-淀粉酶的抑制率達(dá)到最高，分別為38.73%和52.58%?？梢婇荒⒖傇碥諏-淀粉酶的抑制活性要優(yōu)于對a-葡萄糖苷酶的抑制活性。通過圖5、圖6比對可以看出，榛蘑總皂苷的酶抑制活性低于對照品阿卡波糖。

圖5 榛蘑總皂苷對酶活性影響

圖6 阿卡波糖對酶活性影響

3 結(jié)論

利用大孔吸附樹脂對榛蘑總皂苷進(jìn)行純化。通過對6種不同類型的大孔吸附樹脂進(jìn)行考察，得到純化榛蘑總皂苷的最佳樹脂為D101型大孔吸附樹脂，通過響應(yīng)面試驗(yàn)確立優(yōu)化純化工藝條件：上樣質(zhì)量濃度5.46 mg/mL、上樣體積30 mL、解析液體積55.85 mL。在此條件下，回收率可達(dá)56.37%以上，榛蘑總皂苷純度也由34.51%提高至63.5%。

對純化后的榛蘑總皂苷進(jìn)行抑制酶活性試驗(yàn)，結(jié)果表明榛蘑總皂苷對a-葡萄糖苷酶和a-淀粉酶有一定抑制作用，為進(jìn)一步開發(fā)榛蘑和榛蘑總皂苷天然糖苷酶和淀粉酶抑制劑提供理論基礎(chǔ)。