葡萄籽提取物作為食品防腐保鮮劑

尹佳，劉得鵬，謝富忠，高宇迪，李繼鋒

吉林化工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院（吉林 132022）

葡萄是中國(guó)最具消費(fèi)價(jià)值的水果之一，每年有將近80%的葡萄被加工處理成葡萄制品，葡萄的大量生產(chǎn)和消費(fèi)會(huì)產(chǎn)生大量的副產(chǎn)物——葡萄廢棄物（葡萄皮渣、梗、籽），占葡萄總量的20%左右。在葡萄廢棄物中，葡萄籽的生物活性物質(zhì)最豐富，主要有原花青素和葡萄籽多酚等活性物質(zhì)。葡萄籽提取物（GSE）是一種天然的保健食品，含有豐富的多酚，如兒茶素、表兒茶素、原花青素和單體黃烷醇[1]。它擁有通過(guò)清除自由基不僅具有顯著的抗氧化能力，而且由于其核心結(jié)構(gòu)具有抗菌性3,4,5-三羥基苯基[2]。因?yàn)镚SE具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎癥、抗過(guò)敏、防治心血管疾病、抗衰老等多種功效[3]，故將葡萄籽廢渣中的活性成分通過(guò)一些方法提取出來(lái)，充分利用食品工業(yè)殘?jiān)?，可以提高食品加工副產(chǎn)物的利用率。GSE以優(yōu)越的抗氧化活性和無(wú)副作用等受到青睞，被美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局視為安全食品。近幾年GSE被廣泛應(yīng)用于食品、化妝品、保健品及飼料等領(lǐng)域，是一種具有替代或補(bǔ)充天然原料資源的潛力。

1 葡萄籽提取物

1.1 葡萄籽提取物的化學(xué)組成及營(yíng)養(yǎng)成分

GSE是從葡萄籽中提取分離得到的一類多酚類混合物質(zhì)，所含的酚類物質(zhì)主要由酚酸類物質(zhì)和黃酮類化合物組成。葡萄籽中多酚類物質(zhì)的含量約692.5 mg/L[4]，主要的酚類化合物是黃酮醇、原花青素、白藜蘆醇和黃烷-3-醇。楊青山等[5]研究表明不同品種的GSE中原花青素種類基本一致，但含量水平有所差異，其中原花青素B1、原花青素B2、表兒茶素及兒茶素的含量相對(duì)較高，平均超出1%含量水平。葡萄籽的主要營(yíng)養(yǎng)成分詳見(jiàn)表1。

表1 葡萄籽的主要營(yíng)養(yǎng)成分[6] 單位：%

1.2 GSE的功能及作用機(jī)理

1.2.1 抗氧化活性

GSE中的酚類物質(zhì)是使其具有抗氧化活性的主要原因。GSE中的酚類物質(zhì)可以通過(guò)以下2種方式在食品制品中發(fā)揮其抗氧化作用：一是通過(guò)對(duì)金屬離子的螯合，阻止金屬離子引發(fā)自由基的生成，從而間接實(shí)現(xiàn)抗氧化作用[7]；二是為過(guò)氧化物自由基提供氫原子使過(guò)氧化物成為氫過(guò)氧化物，以淬滅自由基，進(jìn)而改善活性氧物質(zhì)的清除能力[8]。此外，GSE強(qiáng)大的抗氧化活性可以保護(hù)腎臟免于誘發(fā)腎病[9]。Albrahim等[10]研究結(jié)果顯示給予甲狀腺功能亢進(jìn)癥的小鼠口服GSE可將TBARS升高的水平顯著降低至正常水平。此外，降低的GSH和GST均顯著降低。產(chǎn)生顯著的抗氧化活性。孫欣等[11]研究表明GSE能有效提高女運(yùn)動(dòng)員機(jī)體總抗氧化能力和運(yùn)動(dòng)能力，減輕運(yùn)動(dòng)員因大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)而引起的氧化應(yīng)激、脂質(zhì)過(guò)氧化損傷。GSE能夠有效保護(hù)細(xì)胞膜較少的受到過(guò)氧化物的攻擊，從而延緩運(yùn)動(dòng)疲勞，減少運(yùn)動(dòng)損傷的發(fā)生。

1.2.2 抗腫瘤作用

GSE中存在的酚類化合物具有抗癌和細(xì)胞周期調(diào)節(jié)活性[12]。這些酚類化合物顯示出對(duì)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒活性，而不會(huì)影響正常的健康細(xì)胞。葡萄籽多酚類物質(zhì)的抗癌細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡作用及其機(jī)制成為近年來(lái)天然抗腫瘤藥物的研究熱點(diǎn)之一。其中，葡萄籽多酚抗前列腺癌（PCA）細(xì)胞DU145的研究最為深入。有研究表明，葡萄籽多酚類物質(zhì)無(wú)論在體內(nèi)還是體外都能顯著抑制PCA細(xì)胞的增殖，并且能以時(shí)間和劑量依賴性地誘導(dǎo)PCA細(xì)胞凋亡[13]。葡萄籽原花青素（GSPE）具有抗氧化、抗炎、可調(diào)節(jié)機(jī)體免疫、減輕機(jī)體損傷等能力，還能發(fā)揮抗腫瘤作用，抑制肺癌、乳腺癌和胃癌等多種腫瘤生長(zhǎng)[14]。另外，有研究顯示，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡可能是GSPE抗癌機(jī)制之一，其對(duì)骨肉瘤細(xì)胞有抑制增殖和遷移、促進(jìn)凋亡、誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯的作用[15]。GSPE作用于人食管癌細(xì)胞ECA109細(xì)胞24 h后，發(fā)現(xiàn)GSPE可以抑制ECA109的增殖和侵襲能力，誘導(dǎo)ECA109細(xì)胞凋亡[16]。故葡萄籽多酚類化合物能抑制多種腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，而且還能拮抗化療藥物對(duì)正常細(xì)胞的毒性，因而具有較好的防癌、抗癌功效。

1.2.3 抗炎作用

GSE具有抗炎作用。許智涵[17]研究證實(shí)GSE可以通過(guò)調(diào)控導(dǎo)視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的IRE1-XBP1信號(hào)通路、提高分子伴侶GRP78的表達(dá)水平，從而抑制相關(guān)炎癥因子的表達(dá)，最終達(dá)到抑制細(xì)胞炎癥反應(yīng)和保護(hù)視網(wǎng)膜的效果。GSPE對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)具有抑制作用，其可能減輕中樞神經(jīng)系統(tǒng)的炎性浸潤(rùn)和髓鞘的脫失，逆轉(zhuǎn)BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)變化并抑制細(xì)胞炎癥反應(yīng)，從而改善中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥微環(huán)境，達(dá)到治療自身免疫性腦脊髓炎的作用[18]。張先杰等[19]用GSPE對(duì)腎血管型高血壓大鼠作6周治療后發(fā)現(xiàn)，與高血壓模型組相比，GSPE治療組的大鼠組血清中的腫瘤壞死因子（TNF-α）以及腎皮質(zhì)、海馬組織及腹主動(dòng)脈中TNF-α的蛋白表達(dá)水平均顯著降低，研究結(jié)果證明GSPE對(duì)促炎介質(zhì)TNF-α具有一定抑制作用。

1.2.4 抗菌作用

GSE對(duì)革蘭陰性菌和革蘭陽(yáng)性菌均有抑菌效果。Baydar等[20]報(bào)道GSE的濃度范圍在0.5%~1%區(qū)間對(duì)大腸桿菌具有普遍抑菌作用，濃度提高到2.5%時(shí)具有殺菌作用；此外，GSE在濃度1.0%，2.5%，5.0%和10.0%時(shí)對(duì)金黃色葡萄球菌和嗜水氣單胞菌均有殺菌作用。李建慧等[21]研究證明，GSE對(duì)金黃色葡萄球菌、傷寒沙門桿菌、普通變形桿菌、志賀里脊桿菌、大腸艾希桿菌和枯草芽孢桿菌6種致病菌均具有明顯的抑制作用。趙揚(yáng)帆等[22]報(bào)道GSE對(duì)于各種各樣的細(xì)菌，如酵母菌和真菌都有明顯的抑制作用。上述研究結(jié)果說(shuō)明將GSE添加于食品中，能明顯提高食品的品質(zhì)及食品的安全性。

2 葡萄籽提取物的提取純化方法

GSE是極強(qiáng)性物質(zhì)，可溶于水，易溶于乙醇、甲醇、乙酸乙酯等極性有機(jī)溶劑，難溶于乙醚和氯仿等有機(jī)溶劑。GSE的提取方法主要采用溶劑萃取法、超聲波輔助提取法、微波輔助提取法、酶解提取法、超臨界CO2萃取法、加壓熱水萃取法。

2.1 溶劑萃取法

溶劑萃取法是根據(jù)物料中各成分在溶劑中溶解性的不同，選擇對(duì)待提取成分的溶解度大、而對(duì)不需提取成分的溶解度小的溶劑，將有效成分從原料中溶解出來(lái)的一種方法。研究者最常用的提取分離GSE的方式之一。該方法的優(yōu)點(diǎn)包括：操作可連續(xù)化，反應(yīng)速度快，生產(chǎn)周期短；采用多級(jí)萃取時(shí)，溶質(zhì)濃縮倍數(shù)越大、純化度越高。缺點(diǎn)包括：抗氧化物質(zhì)溶于有機(jī)溶劑后不易分離，容易造成資源浪費(fèi)。盧靖等[23]從葡萄果渣中提取多酚，在50%乙醇、80 ℃提取40 min條件下，多酚提取量為3.39 mg/g，其5倍稀釋液與0.1 g/L抗氧化劑二丁基羥基甲苯（BHT）的抗氧化性相當(dāng)，并且多酚的抗氧化活性隨著其質(zhì)量濃度增加而增強(qiáng)。劉葉等[24]利用快速溶劑萃取儀在80%乙醇，壓強(qiáng)8.97 MPa、50 ℃提取時(shí)間20 min的條件下，多酚提取量為28.89 mg/g。利用快速溶劑萃取儀提取葡萄籽多酚物質(zhì)能極大地縮短提取時(shí)間。

2.2 超聲波輔助提取法

超聲波輔助提取法是將超聲波產(chǎn)生的空化效應(yīng)、振動(dòng)效應(yīng)、粉碎效應(yīng)、攪拌效應(yīng)等綜合效應(yīng)應(yīng)用到天然產(chǎn)物成分的提取工藝中，通過(guò)破壞其細(xì)胞壁，增加溶劑的穿透力，從而達(dá)到高效提取細(xì)胞內(nèi)容物的目的。該方法的優(yōu)點(diǎn)是超聲波提取效率高，提取溫度低，能夠有效保護(hù)抗氧化活性物質(zhì)。缺點(diǎn)是獲得的產(chǎn)品純度不夠。賈榮等[25]利用超聲波法輔助乙醇提取山葡萄籽多酚，在乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、超聲功率120 W、料液比1∶8（g/mL）、50 ℃提取30 min的最優(yōu)條件下，多酚得率和含量為11.71%和32.86%。蒲艷[26]研究超聲波輔助法提取葡萄籽提取物原花青素的工藝研究，通過(guò)單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳工藝參數(shù)：48%乙醇、超聲功率266 W，50 ℃水浴浸提85 min，在該工藝下原花青素提取率為1.123%。

2.3 微波輔助提取法

微波可使物料的內(nèi)部迅速升溫，瞬間產(chǎn)生的高壓高溫可導(dǎo)致物料細(xì)胞破碎，有利于目標(biāo)成分快速溶出，從而提高提取效率。微波輔助提取法使用的溶劑量少，提取快速，可同時(shí)測(cè)定多個(gè)樣品，設(shè)備簡(jiǎn)單，操作容易，但是萃取劑的選擇范圍受限，通常需要選擇極性大的萃取劑。王偉等[27]以乙醇作為提取劑，對(duì)葡萄籽中原花青素的提取進(jìn)行優(yōu)化，得到60%乙醇，液料比25∶1 mL/g，427 W微波處理3 min，在該條件下葡萄籽原花青素得率為8.66%±0.25%。師守國(guó)等[28]運(yùn)用微波加熱提取技術(shù)，確定提取山野葡萄皮渣中的白黎蘆醇的最佳工藝條件為70%乙醇、液料比20∶1 mL/g、微波功率250 W、提取30 min，在此條件下白黎蘆醇提取率可大幅提高。

2.4 超臨界CO2萃取法

超臨界流體萃取技術(shù)是利用壓力和溫度對(duì)超臨界流體溶解能力的影響，在超臨界狀態(tài)下，將超臨界流體與待提取的物質(zhì)接觸，使其有選擇性地依次把沸點(diǎn)、極性和相對(duì)分子質(zhì)量不同的成分萃取出來(lái)。與傳統(tǒng)溶劑浸提法相比，超臨界萃取法的萃取效率高；可有選擇地進(jìn)行多種物質(zhì)的分離；操作溫度低，能較好保證被提取物質(zhì)性能，但是該方法設(shè)備價(jià)格比較昂貴，生產(chǎn)成本高[29]。劉文玉等[30]采用響應(yīng)面法優(yōu)化超臨界CO2萃取法進(jìn)行葡萄籽原花青素的提取。原花青素提取工藝的最佳條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)69.22%、CO25 L/h、液料比1.13∶1 mL/g、提取壓力35 MPa、溫度55 ℃條件下停留62.82 min，產(chǎn)率和產(chǎn)物純度分別達(dá)到163.60±0.93 mg/kg和88.5%，提取效果明顯優(yōu)于傳統(tǒng)的提出工藝。宗建軍等[31]利用超臨界CO2萃取技術(shù)從葡萄籽中提取含有不飽和脂肪酸的葡萄籽油，預(yù)測(cè)在萃取壓力28 MPa、CO215.5 L/h、萃取溫度321 K最佳條件下停留時(shí)間155 min，萃取率達(dá)到14.12%。

3 葡萄籽提取物的安全性

葡萄屬于生活中比較常見(jiàn)的水果，雖然葡萄籽一般不直接食用，但經(jīng)試驗(yàn)證實(shí)GSE具有很高的食用安全性，急性毒性和慢性長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)均未見(jiàn)毒副作用。據(jù)報(bào)道[32]，食用GSE的2.0%~2.5%對(duì)大鼠沒(méi)有不良影響。在大鼠中口服給藥后未觀察到明顯的GSE嚴(yán)重毒性。大鼠GSE的致死劑量（LD50，對(duì)50%的測(cè)試模型具有致命作用的物質(zhì)的劑量）高于4 000~5 000 mg/kg[33]。沈繼紅等[34]將葡萄多酚以10 g/kg劑量灌胃小鼠，14 d內(nèi)動(dòng)物無(wú)死亡，不同性別的小鼠均未見(jiàn)明顯的中毒癥狀，研究結(jié)果證明該物質(zhì)屬實(shí)際無(wú)毒物質(zhì)。國(guó)際上對(duì)GSE尚無(wú)用量方面的規(guī)定。歐美、日本等國(guó)家將GSE作為膳食補(bǔ)充劑的一般推薦用量為150~300 mg/d，而在食品工業(yè)中則以低濃度（0.01%~1%）使用[35]。中國(guó)常用量與國(guó)際上基本一致。

4 葡萄籽提取物在食品領(lǐng)域的應(yīng)用

4.1 在果蔬中防腐保鮮的應(yīng)用

GSE對(duì)減少化學(xué)合成防腐劑的使用和降低環(huán)境污染具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。楊晶琪等[36]研究表明，1%GSE負(fù)壓滲透處理可顯著抑制青霉菌（Penicillium expansum）和鏈格孢菌（Alternaria alternata）這2種病原菌在鴨梨果實(shí)上的發(fā)病率及病斑直徑擴(kuò)展，最終可以延緩鴨梨果實(shí)的成熟衰老，減少貯藏期間失重率、腐爛率及果柄褐變程度。有研究顯示GSE處理能明顯降低桃果實(shí)貯藏期自然腐爛率和減輕果肉褐變，抑制多酚氧化酶（PPO）活性；延緩桃果實(shí)硬度、可滴定酸含量的下降；保持較高的可溶性固形物和抗壞血酸含量[37]。吳寧等[38]將GSE應(yīng)用于香菇保鮮中，結(jié)果表明一定濃度的GSE能有效延長(zhǎng)香菇保鮮時(shí)間，5 g/L葡萄籽提取物的保鮮效果最理想。GSE在提高果實(shí)抗病性及采后貯藏品質(zhì)的應(yīng)用上具有重要意義，有望開(kāi)發(fā)成為相對(duì)安全、無(wú)公害的果實(shí)防腐保鮮劑。

4.2 在肉類中防腐保鮮的應(yīng)用

肉類制品在貯藏中易發(fā)生氧化反應(yīng)，產(chǎn)生變味及變色現(xiàn)象，造成營(yíng)養(yǎng)成分損失，為使肉類在貨架期內(nèi)保持良好品質(zhì)，添加抗氧化劑非常必要。李超等[39]研究表明，添加0.25% GSE能明顯減緩發(fā)酵鴨肉香腸的氧化速度和產(chǎn)酸速度，進(jìn)而提高香腸貯存期穩(wěn)定性。張濤等[40]指出，GSE能提高發(fā)酵豬肉香腸的氧化穩(wěn)定性，進(jìn)而提高香腸的貨架期。金海莉等[41]通過(guò)對(duì)延邊黃牛肉樣品的表面顏色、感官評(píng)定、pH、滴水損失率、揮發(fā)性鹽基氮值及菌落總數(shù)的測(cè)定，綜合分析得出GSE對(duì)延邊黃牛肉保鮮的最佳質(zhì)量分?jǐn)?shù)是0.10%，且GSE試驗(yàn)組樣品比對(duì)照組樣品的保鮮期延長(zhǎng)2~4 d。GSE能夠提高秘魯魷魚(yú)魚(yú)丸的持水性，降低魚(yú)丸中水分的流動(dòng)性，抑制氧化三甲胺的熱分解，降低魚(yú)丸中TMA、DMA和甲醛含量[42]。在白鰱魚(yú)丸中添加量0.1 g/kg迷迭香提取物和0.3 g/kg葡萄籽提取物時(shí)，白鰱魚(yú)丸的保鮮效果最優(yōu)，可明顯抑制微生物生長(zhǎng)，延緩魚(yú)丸品質(zhì)劣變，延長(zhǎng)貨架期[43]。因此，GSE保鮮劑在肉類制品保鮮中擁有廣闊市場(chǎng)前景。

5 結(jié)語(yǔ)與展望

中國(guó)的葡萄資源比較豐富，葡萄年產(chǎn)量位居世界前列，隨著食品加工行業(yè)的深入發(fā)展，葡萄籽廢棄物——葡萄籽產(chǎn)量會(huì)越來(lái)越多，所以利用食品工業(yè)廢果渣提取天然保鮮劑有著極為廣闊的發(fā)展前景。GSE作為天然抗氧化劑、天然防腐劑和營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑在食品中應(yīng)用，符合消費(fèi)者追求食品安全性和營(yíng)養(yǎng)性的需求。GSE提取工藝簡(jiǎn)單，成本低，具有多種營(yíng)養(yǎng)成分，隨著葡萄籽副產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)利用，GSE的研究開(kāi)發(fā)都具有深遠(yuǎn)意義。