桑黃子實體多糖提取工藝優(yōu)化及其抗氧化活性

袁滿，付婷偉，徐晨，陳安徽, ，邵穎,

1.徐州工程學(xué)院食品（生物）工程學(xué)院（徐州 221111）；2.江蘇省食品資源開發(fā)與質(zhì)量安全重點建設(shè)實驗室，徐州工程學(xué)院（徐州 221111）

桑黃菌是一種珍稀的大型多年生食藥用真菌，隸屬擔(dān)子菌亞門、多孔菌科、木層孔菌屬，有“森林黃金”的美稱[1-2]。桑黃在我國分布廣泛，主要寄生在楊樹、桑樹、柳樹等的樹干上[3]。桑黃在我國醫(yī)藥領(lǐng)域有2 000余年的應(yīng)用歷史[4]，《藥性論》《神農(nóng)本草經(jīng)》《本草綱目》等古代本草著作中均有桑黃藥用的記載，桑黃可用于治療腹瀉、血淋、崩漏帶下、經(jīng)閉、脾虛泄瀉等，具有利五臟、排毒、活血等功效[5-6]。自20世紀70年代起，桑黃抗腫瘤、增強機體免疫、保肝護肝、抗衰老、降血糖、降血脂、抗肺炎、消炎等功效不斷得到挖掘，桑黃中的主要活性成分如黃酮、多酚類物質(zhì)、多糖、三萜等逐漸成為研究熱點[7-10]。

桑黃多糖作為桑黃子實體及液體發(fā)酵菌絲體和發(fā)酵液中的主要化學(xué)成分，被認為是桑黃抗腫瘤活性的重要功效物質(zhì)[11]，又鑒于真菌多糖抗氧化、增強免疫等方面的多重活性，因此值得對桑黃多糖進行深入研究。試驗對桑黃子實體中的多糖進行提取工藝優(yōu)化，并對提取得到的桑黃多糖進行體外抗氧化活性研究，旨在對桑黃子實體資源的合理應(yīng)用及產(chǎn)品開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

桑黃子實體（寧波御菌生物技術(shù)有限公司）。

1.1.2 主要試劑

葡萄糖標準品（分析純，天津市福晨化學(xué)試劑廠）；DPPH試劑（美國Sigma公司）；濃硫酸（分析純，上海華科試劑有限公司）；氯化亞鐵（分析純，廣東光華化學(xué)廠）；菲咯嗪（Ferrozine，分析純，上海市源葉生物科技有限公司）；氯仿、正丁醇（分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司）；濃硫酸、苯酚（分析純，西隴科學(xué)股份有限公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

梅特勒AE200型電子天平（上海分析儀器廠）；TUMEN TL-15高速離心機（江蘇圖門離心機廠）；SHB-ⅢS循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）；R501旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海申勝生物技術(shù)有限公司）；LGJ-10真空冷凍干燥機（上海比朗儀器有限公司）；UV2802PC紫外-可見光分光光度計（上海精密儀器儀表有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 桑黃的處理及多糖的提取

桑黃子實體于50 ℃烘箱中烘干至恒重后反復(fù)研磨備用。桑黃子實體粉采用熱水浸提、固液分離、醇沉、離心、復(fù)溶、去蛋白、醇沉、離心、冷凍干燥的流程提取桑黃粗多糖。

1.3.2 桑黃多糖含量的測定

1.3.2.1 葡萄糖標準曲線的繪制

準確稱取50 mg經(jīng)過高溫烘干至無水恒重的葡萄糖于500 mL容量瓶中，配成0.1 g/mL的標準溶液，繼而用蒸餾水分別配成0，20，40，60，80，100，120和140 g/mL質(zhì)量濃度的系列溶液。1 mL標準液分別加入1 mL 6%苯酚溶液，并迅速加入5 mL濃硫酸，靜置10 min，搖勻后室溫下靜置20 min，用蒸餾水替代葡萄糖溶液做空白對照，在490 nm條件下測定其吸光度，以葡萄糖溶液濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，制作標準曲線。標準葡萄糖標準曲線回歸方程為y=0.005 5x-0.005 3，R2=0.999 6，線性關(guān)系良好。

1.3.2.2 桑黃多糖得率測定

準確稱取50 mg桑黃粗多糖，準確定容至500 mL容量瓶。取1 mL桑黃多糖溶液于試管中，加入1 mL的6%苯酚，迅速加入5 mL濃硫酸，靜置10 min后搖勻。將試管置于40 ℃恒溫水浴鍋中水浴15 min后取出于490 nm測定吸光度。每個樣品設(shè)置3個重復(fù)，將測定的吸光度代入葡萄糖標準曲線計算桑黃多糖的質(zhì)量濃度，并按式（1）求取桑黃多糖的得率。

式中：W為桑黃質(zhì)量，mg；C為桑黃多糖質(zhì)量濃度，mg/mL；V為桑黃多糖溶液總體積，mL。

1.3.3 液固比對桑黃多糖得率的測定

準確稱取5份5 g桑黃子實體粉，并放入燒杯中，分別按照液固比10∶1，20∶1，30∶1，40∶1和50∶1 mL/g加入蒸餾水并于80 ℃水浴鍋中提取2 h，過濾并濃縮后加入95%乙醇使其終濃度達到80%，在4 ℃條件下靜置10 h。使用離心機在5 000 r/min條件下離心10 min后收集沉淀，沉淀冷凍干燥后復(fù)溶，加入除蛋白試劑（正丁醇∶氯仿=1∶4，V/V），使其最終濃度達到25%，充分振蕩1 h左右，在4 000 r/min的條件下離心10 min，收集水層。再次加入95%乙醇使其終濃度達到80%，在4 ℃條件下靜置10 h。使用離心機在5 000 r/min條件下離心10 min后收集沉淀，沉淀冷凍干燥后測定桑黃多糖得率。每個樣品重復(fù)3次。

1.3.4 提取溫度對桑黃多糖得率的測定

準確稱取5份5 g桑黃子實體粉，并放入燒杯中，按照液固比20∶1 mL/g加入蒸餾水，并分別在60，70，80，90和100 ℃水浴鍋中提取2 h，過濾并濃縮后加入95%乙醇使其終濃度達到80%，在4 ℃條件下靜置10 h。使用離心機在5 000 r/min條件下離心10 min后收集沉淀，沉淀冷凍干燥后復(fù)溶，加入除蛋白試劑（正丁醇∶氯仿=1∶4，V/V），使其終濃度達到25%，充分振蕩1 h左右，在4 000 r/min條件下離心10 min，收集水層。再次加入95%乙醇使其終濃度達到80%，在4 ℃條件下靜置10 h。使用離心機在5 000 r/min條件下離心10 min后收集沉淀，沉淀冷凍干燥后測定桑黃多糖得率。每個樣品重復(fù)3次。

1.3.5 提取時間對桑黃多糖得率的測定

準確稱取5份5 g桑黃子實體粉，并放入燒杯中，按照液固比20∶1 mL/g加入蒸餾水并在90 ℃水浴鍋中分別提取1，2，3和4 h，過濾并濃縮后加入95%乙醇使其終濃度達到80%，在4 ℃條件下靜置10 h。使用離心機在5 000 r/min條件下離心10 min后收集沉淀，沉淀冷凍干燥后復(fù)溶，加入除蛋白試劑（正丁醇∶氯仿=1∶4，V/V），使其終濃度達到25%，充分振蕩1 h左右，在4 000 r/min條件下離心10 min，收集水層。再次加入95%乙醇使其終濃度達到80%，在4 ℃條件下靜置10 h。使用離心機在5 000 r/min條件下離心10 min后收集沉淀，沉淀冷凍干燥后測定桑黃多糖得率。每個樣品重復(fù)3次。

1.3.6 桑黃多糖提取工藝優(yōu)化

采用響應(yīng)面法優(yōu)化桑黃粗多糖提取工藝。根據(jù)Box-Behnken試驗設(shè)計原理，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以液固比（mL/g）、提取溫度（℃）和提取時間（h）為自變量，以桑黃多糖得率（Y）為響應(yīng)值，設(shè)計三因素三水平試驗，因素水平表如表1所示。每個樣品重復(fù)3次。

表1 Box-Behnken試驗因素水平表

1.3.7 桑黃多糖抗氧化活性測定

1.3.7.1 桑黃多糖DPPH自由基清除活性檢測

參照邵穎等[12]的方法并改進。將桑黃多糖配制成質(zhì)量濃度分別為0.2，0.4，0.8，1.2，1.6，2.0，4.5，6.0，8.0和10 mg/mL的溶液。分別取2.0 mL各質(zhì)量濃度的多糖溶液于試管中，加入2 mL 95%乙醇配制的濃度0.2 mmol/L的DPPH溶液，混合均勻，室溫避光放置30 min，在517 nm條件下測定吸光度，記為Ai；移取2.0 mL各多糖溶液與2.0 mL 95%乙醇于試管中，混勻后室溫避光防置30 min后測定517 nm處的吸光度，記為Aj；移取2.0 mL 95%乙醇和2.0 mL DPPH溶液混勻，測定517 nm下的吸光度，記為Ac；試驗以VC做陽性對照。DPPH清除率按照式（2）計算。

1.3.7.2 桑黃多糖鐵離子螯合能力測定

鐵離子螯合能力的測定參考邵穎等[13]的文獻并略有改進。將桑黃粗多糖樣品用蒸餾水配制質(zhì)量濃度分別為0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5，4.0和4.5 mg/mL的多糖溶液。移取各濃度多糖溶液2 mL，加入0.1 mL 2 mmol/L氯化亞鐵，加入0.2 mL 2 mmol/L菲咯嗪（Ferrozine），混勻后在室溫下靜置10 min，加入等體積的去離子水并在562 nm下測定其吸光度，記為A1。以去離子水作空白調(diào)零。吸光度越低則表明鐵離子鰲合能力越強。以去離子水代替樣品作為空白對照，吸光度記為A0，以稀釋至不同質(zhì)量濃度的EDTA作為陽性對照。按照式（3）計算桑黃多糖的鐵離子螯合能力。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

試驗數(shù)據(jù)采用DPS（V7.05）專業(yè)版數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。試驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計結(jié)果均以平均值±標準差的形式表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 桑黃多糖提取工藝優(yōu)化

2.1.1 液固比對桑黃多糖得率的影響

按照1.3.3的方法考察液固比對桑黃子實體多糖提取得率的影響。具體試驗結(jié)果如圖1所示。

圖1 液固比對桑黃多糖得率的影響

從圖1可以看出，桑黃子實體多糖得率隨著液固比提高而提高，液固比10∶1（mL/g）時，多糖得率為6.22%，而液固比20∶1（mL/g），多糖得率為8.02%，顯著高于液固比10∶1（mL/g）時多糖得率（p＜0.05），但液固比超過20∶1（mL/g）后，多糖得率雖在數(shù)值上有一定增加，但未達到顯著水平。所以，最優(yōu)桑黃多糖提取液固比選擇20∶1（mL/g）。

2.1.2 提取溫度對桑黃多糖得率的影響

提取溫度是桑黃子實體多糖提取得率的重要影響因素，不同提取溫度條件下桑黃子實體多糖的提取得率如圖2所示。

由圖2可知，在60~90 ℃溫度范圍內(nèi)，桑黃子實體多糖的提取得率隨著提取溫度升高顯著增加（p＜0.05）。溫度90 ℃時，多糖得率達到8.22%，在提取溫度提高到100 ℃時，多糖得率為8.24%，2個提取溫度對多糖得率的影響并不顯著（p＞0.05）。因此，從節(jié)約能耗的角度出發(fā)，選擇提取溫度90 ℃并進行后續(xù)提取工藝優(yōu)化試驗。

圖2 提取溫度對總桑黃多糖得率的影響

2.1.3 提取時間對桑黃多糖得率的影響

提取時間對桑黃子實體多糖提取得率的影響試驗結(jié)果如圖3所示。

圖3 提取時間對桑黃多糖得率的影響

由圖3的結(jié)果可以看出：提取時間在2 h之內(nèi)，桑黃多糖得率會隨著提取時間延長而增加，提取時間2 h時，桑黃子實體多糖得率達到8.18%，顯著高于提取時間1 h時的多糖得率（p＜0.5）；提取時間超過2 h，桑黃多糖得率便未顯示出隨提取時間延長而增加趨勢。因此，最優(yōu)提取時間選擇2 h。

2.1.4 Box-Behnken試驗

2.1.4.1 回歸模型的建立與檢驗

為綜合分析提取液固比、提取溫度和提取時間對桑黃子實體多糖得率的影響，采用響應(yīng)面法設(shè)計三因素三水平試驗以優(yōu)化桑黃子實體多糖的最佳提取工藝。具體的試驗方案及結(jié)果如表2所示。

表2 Box-Behnken試驗設(shè)計及結(jié)果

對表2的試驗數(shù)據(jù)用多元回歸擬合后，得到總桑黃多糖得率（R）與液固比（A）、提取溫度（B）、提取時間（C）的回歸方程：R1=-27.954 50+0.651 028A+0.520 80B+3.980 25C-0.003 875AB-0.002AC-0.010 250BC-0.006 06A2-0.002 085B2-0.646 00C2。

由表3方差分析可得，模型的p值小于0.01，可行度較好，說明該模型有意義，所以可以用于設(shè)計范圍內(nèi)的預(yù)測?；貧w模型的R2=0.960 4，Radj2=0.909 5，說明桑黃多糖得率的試驗值與預(yù)測值之間具有良好擬合度。該模型的失擬項p值為0.461 4＞0.05，失擬項差異不顯著，說明試驗操作可信。由表2的結(jié)果以及表3、回歸方程可知，方程中A、B、C、A2、C2對多糖得率影響顯著，在各個影響因素中，對桑黃多糖得率影響最大的是液固比，其次是提取溫度，提取時間影響最小。試驗因素對多糖得率不是簡單的線性關(guān)系，二次項系數(shù)對多糖得率也有很大的影響，但是表3分析結(jié)果顯示交互作用不明顯。

表3 回歸模型方差分析

2.1.4.2 兩因素間的交叉效應(yīng)分析

為研究2個因素間的交互效應(yīng)對桑黃多糖得率的影響，可固定其他因素為零水平，繪制響應(yīng)面圖譜，如圖4~圖6所示。

響應(yīng)面的坡度越是陡峭，說明總桑黃多糖的得率對該因素的改變越敏感，影響桑黃多糖得率的最主要因素是液固比，提取溫度次之。由圖4可知，當(dāng)液固比處于較低水平時，隨著溫度增加，多糖得率呈現(xiàn)先快速增加，后增加趨勢趨于平緩的趨勢；液固比處于較高水平，隨著溫度增加，多糖得率呈現(xiàn)先緩慢增加后有下降的趨勢。從圖5可以看出，當(dāng)液固比處于較低水平時，隨著提取時間的增加，多糖得率先增加后緩慢下降；當(dāng)液固比處于較高水平時，隨著提取時間增加，多糖得率呈現(xiàn)先增加后緩慢的下降。由圖6看出：當(dāng)提取溫度處于較低水平時，隨著提取時間增加，多糖得率呈現(xiàn)先增加后有下降的趨勢；當(dāng)提取溫度處于較高水平時，隨著提取時間增加，多糖得率先增加后下降。

圖4 提取溫度與液固比的交叉作用對多糖得率的影響

圖5 提取時間與液固比的交叉作用對多糖得率的影響

圖6 提取時間與提取溫度的交叉作用對多糖得率的影響

2.1.4.3 最佳條件優(yōu)化及驗證結(jié)果

通過Box-Behnken軟件分析，預(yù)測得出桑黃子實體多糖提取工藝的最佳工藝的水平編碼值：A=0.161、B=0.924、C=0.259，相當(dāng)于液固比21.61∶1（mL/g）、提取溫度99.24 ℃、提取時間2.26 h，在該條件下桑黃多糖提取率的理論值為9.423%。鑒于實際操作，將各個因素設(shè)置為液固比21.6∶1（mL/g）、提取溫度99℃、提取時間2.3 h，在此修正條件下進行桑黃多糖提取試驗，桑黃子實體多糖得率達到9.398%，與理論值相比，誤差僅0.025%，驗證方程可行性。

2.2 桑黃多糖抗氧化活性分析

2.2.1 桑黃多糖DPPH自由基清除活性

DPPH自由基清除能力是測定多糖體外抗氧化活性常用的方法之一。試驗對提取的桑黃子實體多糖進行DPPH自由基清除活性檢測，具體的試驗結(jié)果如圖7所示。

圖7 桑黃多糖對DPPH自由基清除作用

在測定多糖濃度范圍內(nèi)，可以看出多糖清除DPPH自由基的能力始終低于陽性對照VC。桑黃多糖質(zhì)量濃度在0.25~2 mg/mL范圍內(nèi)，其DPPH自由基清除活性隨著桑黃多糖濃度增加而顯著增強，表現(xiàn)出一定劑量-效應(yīng)關(guān)系。多糖濃度2.00 mg/mL時其DPPH清除率為76.31%±0.92%，多糖濃度分別為3.00和4.00 mg/mL時，其自由基清除分別為80.79%±1.16%和80.51±0.28%，多糖DPPH自由基清除率增加緩慢，在濃度達到4.00 mg/mL卻呈現(xiàn)下降趨勢。

2.2.2 桑黃多糖的鐵離子螯合能力

鐵離子螯合能力也是一種重要的評價各種真菌代謝產(chǎn)物抗氧化能力的指標。桑黃子實體多糖的鐵離子螯合能力檢測結(jié)果如圖8所示。

從圖8可以看出：桑黃多糖在供試的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，其鐵離子螯合能力均低于陽性對照VC；在0.5~4.5 mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，多糖鐵離子螯合能力隨著樣品質(zhì)量濃度增大而增大；多糖濃度低于3.5 mg/mL時，桑黃多糖的鐵離子螯合能力隨多糖質(zhì)量濃度增加而增強的幅度明顯；多糖濃度為3.5 mg/mL時，鐵離子螯合率為56.66%±0.93%；隨后，多糖的鐵離子螯合能力隨著多糖濃度增加而增強的趨勢趨于平緩。多糖濃度為4.0和4.5 mg/mL時，鐵離子螯合率分別為57.23%±1.00%和57.89%±1.04%。

圖8 桑黃多糖對鐵離子螯合作用

3 結(jié)論

桑黃是我國重要的藥用真菌，也是國際上公認的抗癌功效最強的真菌之一。桑黃子實體中富含多種生物活性物質(zhì)，但桑黃多糖是其主要功效成分[14]。桑黃多糖抗氧化、抗腫瘤、抑菌、消炎、降糖降脂等功效被廣泛認可并得到關(guān)注。桑黃多糖的提取工藝及活性研究為桑黃多糖的商品化應(yīng)用提供實踐參考及理論依據(jù)。試驗采用熱水浸提法對桑黃多糖的提取工藝進行優(yōu)化并初步驗證桑黃多糖的抗氧化活性。試驗條件下，桑黃多糖的最優(yōu)提取工藝為液固比21.61∶1 mL/g、提取溫度99.24 ℃、提取時間2.26 h，在此提取條件下桑黃多糖得率達到9.398%。得到的桑黃多糖以DPPH自由基清除活性及鐵離子螯合能力作為指標考察其體外抗氧化能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)桑黃多糖具有明顯的DPPH自由清除活性和較強的鐵離子螯合能力，桑黃多糖濃度4.0 mg/mL時，其DPPH自由基清除率為80.51%±0.28%，鐵離子螯合率為57.23%±1.00%。

桑黃子實體中多糖提取工藝的研究為桑黃資源的深入開發(fā)與應(yīng)用提供參考，桑黃多糖較好的體外抗氧化活性也為桑黃多糖在保健品、飼料添加劑甚至醫(yī)藥等領(lǐng)域的應(yīng)用提供理論依據(jù)。