葛根湯通過(guò)下調(diào)THRB表達(dá)逆轉(zhuǎn)COC1/DDP細(xì)胞順鉑耐藥

趙麗杰， 楊傳軍， 陳蓓蓓， 馬慶良

(上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院婦產(chǎn)科，上海 201210)

卵巢癌是婦科常見(jiàn)腫瘤，死亡率為婦科惡性腫瘤第一位[1]。目前，以鉑類(lèi)為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療是卵巢癌治療的主要手段，但較多卵巢癌患者會(huì)出現(xiàn)順鉑(DDP)耐藥，導(dǎo)致患者5年生存率低、預(yù)后不良[2]。因此，尋找新型抗腫瘤藥物以提高治療卵巢癌的療效至關(guān)重要。葛根湯出自《傷寒論》，由葛根、麻黃、桂枝、生姜、甘草、芍藥、大棗組成，具有發(fā)汗解毒、升津舒筋的功效，可以緩輕化療毒副作用、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫。方中葛根有效成分葛根素是一種生物類(lèi)黃酮化合物，已有研究證實(shí)葛根素能夠促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡、抑制癌細(xì)胞增殖和周期進(jìn)展、發(fā)揮較好的抗腫瘤作用，其在胃癌細(xì)胞中改善DDP耐藥的作用已經(jīng)得到證實(shí)[3]。卵巢癌 DDP耐藥的機(jī)制十分復(fù)雜，隨著分子生物學(xué)研究的不斷深入，越來(lái)越多的研究者開(kāi)始從基因水平去探討疾病的發(fā)生進(jìn)展以及潛在的診療措施[4]。激素是機(jī)體組織生物功能重要的調(diào)節(jié)物質(zhì)，隨著研究的深入，研究者發(fā)現(xiàn)激素在腫瘤細(xì)胞的分裂、凋亡和遷移中扮演重要角色,在多種惡性腫瘤細(xì)胞中激素及激素受體基因往往呈異常表達(dá)狀態(tài)[5]。甲狀腺激素(TH)及其受體(TR)可以影響MAPK、PI3K等通路起到抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的作用，而甲狀腺激素受體基因(thyroid hormone receptor，THRB)是一種激素受體相關(guān)基因，與細(xì)胞的生長(zhǎng)密切相關(guān)，在細(xì)胞的增殖、分化、DNA修復(fù)和周期轉(zhuǎn)換中發(fā)揮重要的參與作用[6]。近年來(lái)研究報(bào)道顯示，THRB在卵巢癌耐藥細(xì)胞中的呈異常高表達(dá)，提示THRB的異常與卵巢癌的耐藥密切相關(guān)[7]。目前關(guān)于葛根湯在卵巢癌中是否存在類(lèi)似的生物作用及具體機(jī)制仍未明確。本研究以人上皮性卵巢癌耐藥COC1/DDP細(xì)胞為模型探討葛根湯對(duì)其增殖、凋亡的影響是否調(diào)控THRB基因的表達(dá)，初步探討THRB在其抗卵巢癌作用的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞 卵巢癌細(xì)胞株COC1、順鉑耐藥卵巢癌細(xì)胞株COC1/DDP，購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心。

1.2 試劑、儀器與藥物 葛根湯組方藥材葛根21 g、桂枝9 g、芍藥9 g、生姜9 g、甘草6 g、大棗12枚、麻黃9 g，由上海曙光醫(yī)院藥劑科制劑中心(中藥制劑研究室)一次性加工完成，制成生藥量0.66 g/mL的濃縮液，在4 ℃下保存?zhèn)溆谩Ｗ⑸溆庙樸K(CisPlatinDDP，山東齊魯制藥有限公司)；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(上海明豐生物科技有限公司)；二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)、胰蛋白酶消化液、細(xì)胞裂解液(美國(guó)R&D Systems公司)；THRB質(zhì)粒中量抽提試劑盒及P-gp、MRD-1抗體(福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司)；一抗(抗THRB 單克隆抗體)、anti-β-actin多克隆抗體(美國(guó)Santa Cruz公司)；PVDF膜(美國(guó)Corning公司)；四甲基偶氮唑藍(lán)(methyl thiazolyl tetrazo-lium, MTT)試劑盒(北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司)；Trizol試劑盒、TaqMan miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Prellix Ex TaqTM實(shí)時(shí)PCR試劑盒(日本Takara公司)；ECL試劑(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)。Model 680型酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-Rad公司)；LipofectamineTM2000(美國(guó)Invitrogen公司)。引物合成由北京華大基因研究中心有限公司完成。

1.3 含藥血清制備 參照《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》[8]中的動(dòng)物與人體的每千克體質(zhì)量劑量折算系數(shù)表，按成人推薦日用量的0.5、1、2倍設(shè)立葛根湯低、中、高劑量組，經(jīng)煎煮、過(guò)濾、水浴蒸發(fā)至生藥量分別為0.657、1.313、2.626 g/mL，冷卻后在4 ℃下保存。SD級(jí)雌性大鼠40只，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，飼養(yǎng)于清潔級(jí)動(dòng)物房，體質(zhì)量(200±10)g，隨機(jī)分為對(duì)照組及葛根湯低、中、高劑量組，分別灌胃給予生理鹽水及3.29、6.57、13.13 g/kg葛根湯，每天1次，連續(xù)3 d，最后1次給藥1 h后，采集腹主動(dòng)脈血，2 000 r/min離心5 min，取血清，56 ℃水浴滅活30 min，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，取上清液，-80 ℃保存待用。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng) COC1/DDP、COC1細(xì)胞株常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中, 在37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，每2 d換液1次，0.25%胰酶消化，每4～6 d傳代1次。實(shí)驗(yàn)時(shí)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)待用。

1.5 生長(zhǎng)曲線繪制 10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基200 μL培養(yǎng)COC1、COC1/DDP細(xì)胞，貼壁后于12、24、48、72 h采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)狀況，繪制生長(zhǎng)曲線。

1.6 含藥血清篩選 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期COC1、COC1/DDP細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至1 ×105/mL，隨機(jī)分為空白對(duì)照組及含藥血清低、中、高劑量組，空白對(duì)照組采用200 μL含10%大鼠血清的DMEM培養(yǎng)，含藥血清低、中、高劑量組分別加含200 μL 10%低、中、高劑量大鼠含藥血清的DMEM培養(yǎng)液，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔, 空白孔中加入蒸餾水調(diào)零。培養(yǎng)12、24、48、72 h后，加入20 μL MTT(5 g/L)，在37 ℃下培養(yǎng)4 h后吸棄上清液，每孔加入150 μL DMSO振蕩10 min，在570 nm波長(zhǎng)處用酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度，重復(fù)3次，取平均值。細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率=[1-(給藥組吸光度/空白組吸光度)]×100%。

1.7 含藥血清對(duì)COC1、COC1/DDP細(xì)胞耐藥逆轉(zhuǎn)作用研究 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的COC1、COC1/DDP細(xì)胞，調(diào)整密度至1×105/mL，隨機(jī)分為順鉑+葛根湯最佳含藥血清組、順鉑+對(duì)照血清組，每組順鉑濃度設(shè)為6、12、25、50、100、200、400 μmol/L。待細(xì)胞貼壁后，順鉑+最佳含藥血清組加入含10 μL不同濃度的順鉑、含10%葛根湯最佳含藥血清的DMEM培養(yǎng)液；順鉑+對(duì)照血清組加入含10 μL順鉑、200 μL含10%大鼠對(duì)照血清的DMEM培養(yǎng)液，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，使每組加入血清總量相同，同時(shí)設(shè)立空白孔(只含培養(yǎng)基)進(jìn)行校正，在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)48 h，每孔加入20 μL MTT(5 g/L)溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸棄上清，每孔加入150 μL DMSO，搖床振蕩10 min，在570 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)各孔吸光度，重復(fù)3次，取平均值，計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率。采用GraphPad Prism 5.0軟件計(jì)算順鉑對(duì)COC1/DDP、COC1細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(half maximal inhibitory concentration,IC50)，耐藥指數(shù)(resistance index,RI)=耐藥細(xì)胞株IC50/敏感細(xì)胞株IC50。

1.8 RT-qPCR檢測(cè)THRBmRNA表達(dá) 對(duì)照組只加含200 μL含10%大鼠對(duì)照血清的DMEM培養(yǎng)液COC1細(xì)胞，DDP組加入含10 μL順鉑、200 μL含10%大鼠對(duì)照血清的DMEM培養(yǎng)液處理的COC1/DDP細(xì)胞，給藥組加入“1.3”項(xiàng)下低、中、高劑量葛根湯含藥血清的DMEM培養(yǎng)液處理的COC1/DDP細(xì)胞。RT-qPCR檢測(cè)COC1細(xì)胞的THRBmRNA的表達(dá)，Trizol法提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒對(duì)RNA樣品進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄以合成cDNA，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為42 ℃ 30 min，逆轉(zhuǎn)錄酶失活條件為85 ℃ 15 s。SYBR Green PCR Master Mix和PCR檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行RT-qPCR實(shí)驗(yàn)，條件為95 ℃ 10 min；95 ℃ 20 s，60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)；最終延伸75 ℃ 10 min，保持在4 ℃。比較循環(huán)閾值ΔΔCT用于分析RNA的表達(dá)，GAPDH、U6表達(dá)用于標(biāo)準(zhǔn)化。

1.9 Western blot檢測(cè)MRD-1、P-gp蛋白 將COC1/DDP、COC1細(xì)胞清洗后裂解、離心，收集總蛋白，檢測(cè)蛋白濃度，10%SDS-PAGE凝膠電泳，PVDF膜轉(zhuǎn)膜，在室溫下用5%無(wú)脂牛奶封閉2 h，加入相應(yīng)一抗(稀釋1∶1 000)，在室溫下振蕩2 h，4 ℃下孵育過(guò)夜，加入二抗(稀釋1∶5 000)孵育3 h。通過(guò)Quantity One軟件分析條帶灰度值，計(jì)算目標(biāo)蛋白表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 COC1、COC1/DDP細(xì)胞生長(zhǎng)曲線 COC1、COC1/DDP細(xì)胞在12、24、48 h吸光度不斷增加，48 h達(dá)到高峰，但在72 h時(shí)吸光度明顯下降，細(xì)胞死亡增多，見(jiàn)圖1。

圖1 COC1、COC1/DDP細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

2.2 劑量、作用時(shí)間篩選 不同劑量葛根湯含藥血清對(duì)COC1、COC1/DDP細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率隨著時(shí)間延長(zhǎng)不斷增加，48 h達(dá)到高峰，呈時(shí)間-劑量依賴(lài)效應(yīng)，但在72 h有所下降，可能與其增殖能力下降、死亡細(xì)胞較多有關(guān)；低劑量含藥血清對(duì)COC1、COC1/DDP細(xì)胞的抑制率均<10%，與中、高劑量含藥血清作用24、48 h抑制率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見(jiàn)表1。前期報(bào)道表明，抑制率小于10%時(shí)對(duì)敏感株和耐藥株細(xì)胞均無(wú)明顯細(xì)胞毒作用[9]，故本實(shí)驗(yàn)選擇含藥血清10%作為劑量，48 h作為作用時(shí)間。

表1 葛根湯對(duì)COC1、COC1/DDP細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率的影響

2.3 含藥血清對(duì)COC1/DDP細(xì)胞耐藥逆轉(zhuǎn)的影響 順鉑對(duì)COC1/DDP細(xì)胞的IC50為(209.46±1.11)μmol/L，對(duì)COC1細(xì)胞為(27.51±0.12)μmol/L，COC1/DDP細(xì)胞對(duì)順鉑的耐藥指數(shù)為7.61；葛根湯含藥血清聯(lián)合順鉑對(duì)COC1/DDP細(xì)胞的IC50為(84.41±0.18)μmol/L,對(duì)COC1細(xì)胞為(22.84±0.42)μmol/L，COC1/DDP細(xì)胞對(duì)葛根湯含藥血清聯(lián)合順鉑的耐藥指數(shù)為3.69，提示聯(lián)合葛根湯和順鉑治療卵巢癌具有明顯協(xié)同作用，能抑制COC1/DDP細(xì)胞生長(zhǎng)，提高COC1/DDP細(xì)胞對(duì)順鉑的的敏感性，具有逆轉(zhuǎn)COC1/DDP細(xì)胞腫瘤耐藥的作用。

2.4 葛根湯對(duì)COC1/DDP細(xì)胞中THRB mRNA及蛋白表達(dá)的影響 在卵巢癌COC1細(xì)胞中，THRB為低水平轉(zhuǎn)錄表達(dá)；在耐藥COC1/DDP細(xì)胞中，THRB均為高水平轉(zhuǎn)錄表達(dá)。葛根湯干預(yù)后，COC1/DDP細(xì)胞內(nèi)高水平轉(zhuǎn)錄的THRBmRNA轉(zhuǎn)錄下調(diào)，THRB蛋白表達(dá)降低，各劑量組的THRB mRNA及蛋白表達(dá)與DDP組比較均降低(P<0.05，P<0.01)，見(jiàn)表2、圖2。

表2 各組THRB mRNA相對(duì)表達(dá)比較

圖2 各組THRB蛋白表達(dá)

2.5 葛根湯對(duì)COC1/DDP細(xì)胞中MRD-1、P-gp表達(dá)的影響 葛根湯作用于卵巢癌COC1/DDP細(xì)胞48 h后MRD-1、P-gp耐藥相關(guān)蛋白表達(dá)減少，并呈一定的劑量依賴(lài)性(P<0.05)，見(jiàn)圖3～4。

注：與DDP組比較，*P<0.05。

注：與DDP組比較，*P<0.05。

3 討論

鉑類(lèi)藥物是惡性腫瘤臨床應(yīng)用廣泛的一線化療方案，但鉑類(lèi)藥物的耐藥性是造成患者化療失敗、腫瘤復(fù)發(fā)的重要原因[10]。自20世紀(jì)90年代研究者便發(fā)現(xiàn)鈣通道拮抗劑能夠逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的耐藥性，但是這些逆轉(zhuǎn)劑大多靶點(diǎn)單一、抗腫瘤耐藥性效果不理想，且中毒劑量與逆轉(zhuǎn)耐藥性劑量太過(guò)接近[11]。

葛根湯出自《傷寒論》，由葛根、麻黃、桂枝、生姜、甘草、芍藥、大棗組成[12-13]。葛根活性成分葛根素是生物類(lèi)黃酮化合物，現(xiàn)代藥理研究證實(shí)其葛根素具有減少腫瘤細(xì)胞的MDR、P-gp、MRP的表達(dá)的多重作用進(jìn)而逆轉(zhuǎn)裸鼠原位移植瘤的多藥耐藥性[14]。葛根素對(duì)癌細(xì)胞具有高度選擇性，能夠高選擇性地誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡，而不損傷正常細(xì)胞，據(jù)Gan[15]和劉銀莉等[16]介紹葛根素能通過(guò)PI3K/Akt/NF-κB信號(hào)通路途徑抑制CyclinD1表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡發(fā)揮抗腫瘤作用，但葛根湯在卵巢癌治療中能否具有同樣的逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的耐藥性功效及其具體機(jī)制仍無(wú)確切定論，因此本文以COC1/DDP細(xì)胞為體外研究模型探討葛根湯對(duì)于卵巢腫瘤細(xì)胞耐藥的功效及其可能的作用機(jī)制。

本文通過(guò)MTT法篩選得出10%低劑量含藥血清作用48 h為含藥血清考察劑量及考察作用時(shí)間。為排除葛根湯的細(xì)胞毒作用的影響，在前述的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上本研究選用在低劑量的葛根湯含藥血清處理下培養(yǎng)48 h，DDP對(duì)于COC1/DDP細(xì)胞IC50降低，且與單純的DDP作用組比較其耐藥指數(shù)由7.61下降至3.69，提示葛根湯可以逆轉(zhuǎn)COC1/DDP細(xì)胞對(duì)鉑類(lèi)藥物的的耐藥性，增加腫瘤細(xì)胞對(duì)含鉑類(lèi)藥物化療敏感性。

近年來(lái)，越來(lái)越多的研究證實(shí)卵巢癌屬于激素依賴(lài)性腫瘤，機(jī)體內(nèi)分泌紊亂，激素失調(diào)會(huì)導(dǎo)致對(duì)正常細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用失控，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞的的自主凋亡及增殖減少，使得卵巢癌細(xì)胞產(chǎn)生耐藥[17]。甲狀腺激素水平異常增高能夠促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)，而甲狀腺激素水平降低時(shí)雖然會(huì)使得乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)減緩，但是會(huì)增加乳腺癌細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化能力，甲狀腺激素及其受體可能通過(guò)細(xì)胞核、細(xì)胞膜、腫瘤微環(huán)境及細(xì)胞凋亡等各個(gè)層面對(duì)乳腺癌的發(fā)生發(fā)展起促進(jìn)或抑制作用[18]。研究證明卵巢癌上皮組織中的甲狀腺激素受體蛋白(TRβ)的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)均表現(xiàn)出明顯異常，TRβ可以通過(guò)與甲狀腺激素反應(yīng)元件特異性結(jié)合，調(diào)節(jié)相關(guān)靶基因的轉(zhuǎn)錄進(jìn)而調(diào)控相關(guān)細(xì)胞生成分化[19]。另外，細(xì)胞內(nèi)甲狀腺激素受體缺失促進(jìn)乳腺癌發(fā)生進(jìn)展。THRB是甲狀腺激素受體基因，國(guó)外學(xué)者通過(guò)敲除小鼠THRB基因證實(shí)THRB能夠與P85(PI3K小亞基)結(jié)合，促進(jìn)PI3K活化，激活A(yù)kt/mTOR磷酸化通路[20]。米雪等[21]指出PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路在卵巢癌耐藥中扮演重要角色。多藥耐藥相關(guān)蛋白(MRP)是一種跨膜糖蛋白，在真核及原核生物的跨膜分子轉(zhuǎn)運(yùn)中扮演重要角色。P-gp是轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的超家族，研究已經(jīng)證實(shí)MRP1、P-gp異常高表達(dá)是造成腫瘤化療耐藥的重要原因之一[22]。

李君等[7]采用體外研究發(fā)現(xiàn)甲狀腺激素能促進(jìn)人卵巢癌細(xì)胞和人卵巢癌耐順鉑細(xì)胞的增殖，THRB在卵巢癌耐藥細(xì)胞中的表達(dá)遠(yuǎn)高于一般卵巢癌細(xì)胞,THRB對(duì)卵巢癌耐藥起著非常重要的作用，可能是耐藥相關(guān)基因。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，COC1/DDP細(xì)胞中THRBmRNA的表達(dá)高于COC1細(xì)胞，提示THRB可能參與卵巢癌的化療耐藥，其表達(dá)與患者的預(yù)后密切相關(guān)。葛根湯含藥血清處理后，COC1/DDP細(xì)胞中THRBmRNA表達(dá)較單純DDP組下調(diào)，提示葛根湯可調(diào)節(jié)THRB基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。不同劑量的葛根湯分別作用于卵巢癌COC1/DDP細(xì)胞48 h后MRD-1、P-gp耐藥相關(guān)蛋白表達(dá)減少，且呈一定的劑量依賴(lài)性，葛根湯劑量越高腫瘤細(xì)胞的耐藥相關(guān)蛋白表達(dá)降低越明顯提示THRB的抑制劑在抑制腫瘤細(xì)胞的DNA修復(fù)中效果較好，能夠逆轉(zhuǎn)卵巢癌COC1/DDP細(xì)胞的耐藥性，增加其對(duì)DDP的敏感性，從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡及抑制其增殖而延緩腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，可作為新型的抗腫瘤藥物。提示葛根湯能夠通過(guò)下調(diào)THRB基因表達(dá)，逆轉(zhuǎn)卵巢癌腫瘤細(xì)胞順鉑耐藥。方中葛根升津液，濡筋脈為君，能夠增加機(jī)體免疫；陳小紅等[23]通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)葛根素能夠通過(guò)抑制MDR1和MRP基因轉(zhuǎn)錄和P-gp蛋白介導(dǎo)的藥物外轉(zhuǎn)運(yùn)功能進(jìn)而逆轉(zhuǎn)K562/ADR細(xì)胞腫瘤多藥耐藥性。桂枝能上調(diào)PTENmRNA和下調(diào)MTDHmRNA表達(dá)，促進(jìn)SKOV3/DDP卵巢癌耐藥細(xì)胞凋亡、抑制癌細(xì)胞的增殖，逆轉(zhuǎn)細(xì)胞耐藥[24]。諸藥合用，存在協(xié)同作用。

綜上所述，葛根湯能夠有效降低人卵巢癌順鉑多藥耐藥COC1/DDP細(xì)胞耐藥性，提高其對(duì)化療藥物的敏感性，其機(jī)制可能與降低THRB基因表達(dá)有關(guān)。