薄層色譜知識(shí)干貨分享

文/ 狐佳駿

掌握薄層色譜法必備的基礎(chǔ)知識(shí)// 色譜法起源于20世紀(jì)初，經(jīng)過(guò)無(wú)數(shù)科學(xué)家一百多年的創(chuàng)新與完善，現(xiàn)已成為應(yīng)用廣泛的分離分析技術(shù)，尤其是薄層色譜法，在化藥合成、醫(yī)藥中間體合成領(lǐng)域意義重大。本文集中介紹了一些薄層色譜法的基礎(chǔ)知識(shí)及使用過(guò)程中的注意事項(xiàng)。

薄層色譜英文名稱(chēng)為T(mén)hin- Layer Chromatography ， 簡(jiǎn)寫(xiě) 為T(mén)LC。將吸附劑、載體或其他活性物質(zhì)均勻涂鋪在平面板（如玻璃板、金屬片等）上，形成薄層（常用厚度為0.25 毫米左右）后，在此薄層板上進(jìn)行層析分離的分析方法。它具有分析速度快、靈敏度高、選擇性高、試樣預(yù)處理簡(jiǎn)單、所用儀器簡(jiǎn)單等特點(diǎn)。

基本原理

薄層色譜法是一種吸附薄層色譜分離法，它利用各成分對(duì)同一吸附劑吸附能力的不同，使流動(dòng)相（溶劑）流過(guò)固定相（吸附劑）的過(guò)程中，連續(xù)的產(chǎn)生吸附、解吸附、再吸附、再解吸附，從而達(dá)到各成分互相分離的目的。

相關(guān)參數(shù)

1.比移值 Rf

從基線至展開(kāi)斑點(diǎn)中心的距離與從基線至展開(kāi)劑前沿的距離的比值。除另有規(guī)定外，雜質(zhì)檢查時(shí)，各雜質(zhì)斑點(diǎn)的比移值在0.2~0.8之間為宜；最佳范圍為0.3~0.5。

2.相對(duì)比移值 Rs

各組分Rf值之差。各組分比移值之差最好控制在0.05，可以消除一些實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的系統(tǒng)誤差，以防斑點(diǎn)重疊（注：系統(tǒng)誤差可控，偶然誤差不可控，具體可參考《分析化學(xué)》）。

3.影響因素

固定相、流動(dòng)相種類(lèi)及性質(zhì)、展開(kāi)劑飽和度、溫度、薄層板的性質(zhì)等，在完全相同的條件下某一成分的比移值為固定值。

用具及操作

薄層板

1.按固定相種分類(lèi)：硅膠、三氧化二鋁、聚酰胺、活性炭、大孔吸附樹(shù)等，注意所選固定相必須不與流動(dòng)相及被分離化合物反應(yīng)。

2.按效率分類(lèi)：普通板，粒徑為10~40 um(200~500目)； 高效板，粒徑為5 um（500~1000目）；

3.常用硅膠板分類(lèi)：硅膠H—不含粘合劑；硅膠G—含煅石膏粘合劑；硅膠HF254—含熒光物質(zhì)，可用于波長(zhǎng)為254 nm紫外光下觀察；熒光硅膠GF254—既含煅石膏又含熒光劑。

薄層板的制備及注意事項(xiàng)

1.手工鋪板：將1份固定相和3份水或加有黏合劑的水溶液（如0.2%~0.5%羥甲基纖維素鈉水溶液）或?yàn)橐?guī)定濃度的改性劑溶液，在研缽中按同一方向研磨混合，去除表面的氣泡后，倒入涂布器中，在玻板上平穩(wěn)地移動(dòng)涂布器進(jìn)行涂布（厚度為0.2~0.3 mm)，取下涂好薄層的玻板，置水平臺(tái)上于室溫下晾干后，在110℃烘箱中烘30分鐘，隨即置于有干燥劑的干燥箱中備用。使用前檢查其均勻度，可在反射光及透視光下檢視，表面應(yīng)均勻、平整、光滑， 并且無(wú)麻點(diǎn)、無(wú)氣泡、無(wú)破損及污染。

2.活化目的：去除固定相表面多余的水分，保證及加強(qiáng)粘合劑的粘度。相當(dāng)于人體內(nèi)水：自由水在細(xì)胞內(nèi)、細(xì)胞之間、生物體內(nèi)可以輸送新陳代謝所需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和代謝的廢物；結(jié)合水在生物體內(nèi)或細(xì)胞內(nèi)與蛋白質(zhì)、多糖等物質(zhì)相結(jié)合，失去流動(dòng)性。結(jié)合水是細(xì)胞結(jié)構(gòu)的重要組成成分，不能溶解其他物質(zhì)，不參與代謝作用。與人體中的水一樣，活化的目的相當(dāng)于去除多余的自由水，如果溫度過(guò)高就會(huì)破壞結(jié)合水，使其結(jié)構(gòu)受到破壞，降低粘合劑的粘度。所以，一定要注意活化的溫度。

3.活化效果評(píng)判依據(jù)：此法僅做參考。以正己烷：乙酸乙酯（9:1）為展開(kāi)劑，以偶染料即蘇丹紅和對(duì)氨基偶氮苯混合樣，計(jì)算兩者比移值，見(jiàn)表1。

表1 蘇丹紅和對(duì)氨基偶氮苯混合樣的比移值

4.貯存：保存于相對(duì)干燥的環(huán)境中（干燥器） 備用，市售硅膠板用前需干燥半小時(shí)，聚酰胺薄膜不需干燥。

5.注意事項(xiàng)：檢查所選板種類(lèi)、完整度、清潔度、尺寸，以及鋪板時(shí)所選固定相，在滿(mǎn)足實(shí)驗(yàn)結(jié)果前提下，也可根據(jù)固定相價(jià)格、吸附劑選擇。

展開(kāi)缸

展開(kāi)缸類(lèi)型有雙底展開(kāi)槽、普通展開(kāi)槽、水平展開(kāi)槽。由于展開(kāi)槽價(jià)格昂貴，在使用時(shí)注意愛(ài)護(hù)保養(yǎng)，用完后及時(shí)清洗。

展開(kāi)劑

展開(kāi)劑可以為一種溶劑，也可為多種溶劑，當(dāng)一種溶劑不能很好的展開(kāi)各組份時(shí)，常選擇混合溶劑作為展開(kāi)劑，先用極性小的為基礎(chǔ)，再用極性大的混合，逐次實(shí)驗(yàn)。比移值太大，降低展開(kāi)劑極性；比移值太小，增大展開(kāi)劑極性。對(duì)于極性小的樣，選擇活性強(qiáng)的吸附劑，極性小的展開(kāi)劑，反之則性狀正好相反，例如，環(huán)己烷：丙酮：二乙胺：水（10:5:2:5），其中丙酮降低粘度,二乙胺調(diào)節(jié)pH,環(huán)己烷降低水的極性，使比移值降低。常用的展開(kāi)劑有水、乙腈、甲醇、乙醇、丙酮、四氫呋喃、正丁醇、乙酸乙酯、乙醚、三氯甲烷、苯、 甲苯、環(huán)己烷、石油醚（極性從大到小大小排列），展開(kāi)劑選擇的影響因素有被分離試樣組分的極性、吸附劑活性、展開(kāi)劑極性。

各溶劑在展開(kāi)劑中的作用：極性強(qiáng)的溶劑可以使化合物在薄層板上移動(dòng)；

極性弱的溶劑能降低極性強(qiáng)的溶劑的洗脫能力和比移值；

一般中等極性的溶劑能夠使極性強(qiáng)的和極性弱的溶劑混合均勻；

在展開(kāi)劑中加入少量酸、堿可以使某些極性物質(zhì)斑點(diǎn)集中，提高分離度。用黏度太大的溶劑時(shí)，往往需要加入一種溶劑，以降低展開(kāi)劑的粘度，加快展開(kāi)速度。

在配制展開(kāi)劑的時(shí)候，要選擇正確的溶劑，精密量取，根據(jù)配比混合均勻，注意分層的展開(kāi)劑中上下層溶劑的選擇，現(xiàn)用現(xiàn)配（混合溶劑中溶劑揮發(fā)性不同），配量不宜太多。

點(diǎn)樣工具及點(diǎn)樣

一般為圓點(diǎn)狀或窄細(xì)的條帶狀，色樣基線距底邊10~15 mm ,高效板一般基線距底邊8~10 mm，圓點(diǎn)狀直徑一般不大于4 mm，高效板一般不大于2 mm。接觸點(diǎn)樣時(shí)注意勿損傷薄層表面。條帶狀寬度一般為5~10 mm，高效板條帶寬度一般為4~8 mm, 可用專(zhuān)用半自動(dòng)或全自動(dòng)點(diǎn)樣儀點(diǎn)樣。點(diǎn)間距離可視斑點(diǎn)擴(kuò)散情況以相鄰斑點(diǎn)互不干擾為宜，一般不少于8 mm，高效板供試品間隔不少于5 mm。常見(jiàn)的點(diǎn)樣工具有毛細(xì)管、自動(dòng)點(diǎn)樣器、微量注射器。

點(diǎn)樣操作時(shí)要注意，點(diǎn)樣量要小、劃線要輕薄、點(diǎn)樣時(shí)輕、記錄清楚、重復(fù)點(diǎn)樣時(shí)要等前一次的點(diǎn)樣溶劑揮發(fā)后再進(jìn)行下一次的點(diǎn)樣，總之原則為盡量小的點(diǎn)樣面積、盡量高的樣品濃度、點(diǎn)樣速度要快。

展開(kāi)操作及注意事項(xiàng)

展開(kāi)方式包括上行、下行、近水平展開(kāi)三種。

1.上行展開(kāi)：將點(diǎn)好供試品的薄層板放入展開(kāi)缸中，浸入展開(kāi)劑的深度為距原點(diǎn)5 mm為宜，密閉。除另有規(guī)定外，一般上行展開(kāi)8~15 cm，效薄層板上行展開(kāi)5~8 cm。溶劑前沿達(dá)到規(guī)定的展距，取出薄層板，晾干，待檢測(cè)；

2.下行展開(kāi)：多用于紙色譜中。將點(diǎn)樣后的濾紙懸放于展開(kāi)劑槽中，用玻璃棒加以固定，下方可放入飽和濾紙所用的溶劑，展開(kāi)劑從上向下展開(kāi)。此法除了毛細(xì)管作用外還有重力作用，因此展開(kāi)速度比上行展開(kāi)速度快；

3.近水平展開(kāi)：將適量溶劑置于長(zhǎng)方形的玻璃展開(kāi)槽中，將點(diǎn)樣后的薄層板下端浸于展開(kāi)劑 0.5 cm處，并與水平成5~10角，適用于不含粘合劑的軟板展開(kāi)。

4.注意事項(xiàng)：等樣品中試劑揮發(fā)完后再進(jìn)行展開(kāi)，展開(kāi)時(shí)臺(tái)面要平整，不能傾斜。必要時(shí)，可進(jìn)行二次展開(kāi)，進(jìn)行第二次展開(kāi)前，應(yīng)使薄層板殘留的展開(kāi)劑完全揮發(fā)。展開(kāi)缸上做好標(biāo)記，以防混淆。注意展開(kāi)過(guò)程中展開(kāi)缸的密封性。墊高展開(kāi)缸一端，一方面節(jié)省展開(kāi)劑，另一方面使展開(kāi)劑更集中，提高展開(kāi)效果。

薄層色譜的應(yīng)用

薄層色譜的主要應(yīng)用有定性分析、定量分析、紫外分光光度法、波層掃描色譜法、鑒別，以及反應(yīng)進(jìn)程跟蹤（原點(diǎn)是否消失，多用于化藥合成、醫(yī)藥中間體合成等）