遺傳改造乳酸鏈球菌合成Nisin的研究進(jìn)展

羅林根，穰 杰，夏立秋*

(1.湖南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，中國 長沙 410081；2.臨湘市第一中學(xué)，中國 岳陽 414000)

乳酸鏈球菌素( Nisin)是由乳酸鏈球菌產(chǎn)生的一類小分子肽，具有廣譜抑菌作用，不僅對致病性病原體如李斯特氏菌、金黃色葡萄球菌、芽胞桿菌等革蘭氏陽性菌具有抗菌活性，還能緩解由部分微生物引起的食品腐敗變質(zhì)問題。由于Nisin具有抑菌效果好、熱穩(wěn)定性高以及對人安全無毒等優(yōu)點(diǎn)，早在1969年就被世界衛(wèi)生組織(WHO) 批準(zhǔn)用作食品防腐劑，隨后于1988年被美國食品藥品監(jiān)管局(Food Drug Administration,FDA)列入GRAS (一般認(rèn)為安全) 名單。目前，Nisin作為一種國際公認(rèn)的安全無毒的天然防腐劑，已被商業(yè)化廣泛應(yīng)用[1]。

Nisin的分子結(jié)構(gòu)已于1971年得到解析，其分子式為C143H228N42O37S7，相對分子質(zhì)量為3 500，一般以二聚體(7 000)或四聚體(14 000)結(jié)構(gòu)存在。Nisin主體結(jié)構(gòu)由34個氨基酸殘基構(gòu)成，并通過硫醚鍵連接成五環(huán)結(jié)構(gòu)，共涉及11種常見氨基酸和4種稀有氨基酸。在此基礎(chǔ)上，通過氨基酸修飾可產(chǎn)生不同Nisin變體。目前，已有8種天然Nisin變體(Nisin A，Nisin Z，Nisin F，Nisin Q， Nisin H，Nisin P，Nisin U和Nisin U2)被報道，其中Nisin A和Nisin Z研究最為廣泛[2]。

Nisin作為一種無毒的天然防腐劑，需求量一直持續(xù)增長，然而由乳酸鏈球菌生產(chǎn)的Nisin存在發(fā)酵活力、產(chǎn)量較低以及生產(chǎn)成本高等問題，嚴(yán)重限制它的商業(yè)化推廣應(yīng)用。發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化是促進(jìn)乳酸鏈球菌合成Nisin的重要手段。吳疆等根據(jù)代謝發(fā)酵控制原理，采用二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計，研究了乳酸鏈球菌搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中蔗糖、蛋白胨、酵母浸出物以及KH2PO3等4種主要成分對Nisin產(chǎn)量的影響，通過DPS軟件優(yōu)化其添加比例，顯著提高Nisin的產(chǎn)量[3]。通過培養(yǎng)基優(yōu)化雖然能促進(jìn)Nisin的合成，但其產(chǎn)量遠(yuǎn)沒有達(dá)到工業(yè)化生產(chǎn)要求。目前，對參與目標(biāo)天然產(chǎn)物生物合成的相關(guān)基因進(jìn)行定向遺傳改造或代謝途徑優(yōu)化是促進(jìn)其生物合成的主要方法，并在許多重要天然產(chǎn)物生產(chǎn)菌中廣泛應(yīng)用。

1 乳酸鏈球菌基因組特征

近年來，利用全基因組測序與生物信息學(xué)方法對乳酸鏈球菌進(jìn)行遺傳背景的解析為乳酸鏈球菌的進(jìn)一步開發(fā)提供了廣闊的研究空間。自Bolotin等[4]在2001年發(fā)布了第一株名為乳酸鏈球菌乳酸亞種IL1403菌株的全基因組序列以來，總共有235株乳酸鏈球菌及其亞種的全基因組完成圖或草圖得到公布，基因組大小在1.71～2.96 Mb，GC含量在34.5%～38.6%[5-7](表1)。以乳酸鏈球菌乳酸亞種IL1403為例，該菌株基因

表1 部分已完成測序的乳酸鏈球菌基因組信息比較

組大小為2.37 Mb，GC含量為35.3%，共編碼2 219個蛋白質(zhì)，19個rRNA，63個tRNA以及其他4個非編碼RNA。對所編碼蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)該菌株含有全部20種氨基酸的生物合成途徑[4]。在對已測序的乳酸鏈球菌基因組進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，部分菌株還存在多個質(zhì)粒，如乳酸鏈球菌乳酸亞種KF147的基因組由一條染色體DNA和1個質(zhì)粒組成[8]，而乳酸鏈球菌乳酸亞種SD96的質(zhì)粒數(shù)目達(dá)到了10個[9]，從而賦予不同乳酸鏈球菌亞種獨(dú)特的生物學(xué)功能。此外在乳酸鏈球菌基因組中還存在多個前噬菌體序列和插入序列，如乳酸鏈球菌乳酸亞種MG1363的基因組存在多達(dá)134 kb前噬菌體序列和92個插入序列[10]。這些序列的存在可引起高頻率的基因水平轉(zhuǎn)移，這可能是乳酸鏈球菌在適應(yīng)復(fù)雜的營養(yǎng)環(huán)境過程中，導(dǎo)致染色體大小發(fā)生變化的重要原因。

2 Nisin生物合成基因簇及合成途徑

全基因組測序結(jié)果顯示，在乳酸鏈球菌基因組中存在一個大小為14 kb的基因簇nisABTCIPRKFEG，并已證明這11個基因都參與了Nisin的合成[11](圖1A)。其中nisA編碼了含有57個氨基酸殘基的Nisin前體肽，隨后Nisin前體肽中的絲氨酸和蘇氨酸在脫水酶NisB和環(huán)化酶NisC的催化下脫水生成Dha和Dhb殘基并與半胱氨酸偶聯(lián)，形成甲基羊毛硫氨酸環(huán)[12](圖1B)。完全修飾的Nisin前體在轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白NisT(屬于ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族)的作用下可以跨膜運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞外，同時在胞外蛋白酶NisP的作用下對Nisin前體進(jìn)行前導(dǎo)肽的切割最終形成成熟且有活性的抗菌肽[13]。由于Nisin具有強(qiáng)烈的抑菌性，在長期進(jìn)化過程中乳酸鏈球菌產(chǎn)生了一種自我保護(hù)的機(jī)制，如在脂蛋白NisI和ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白NisFEG的協(xié)同作用下，一方面通過直接結(jié)合Nisin，防止其與脂質(zhì)體Ⅱ分子結(jié)合在細(xì)胞膜上形成小孔，另一方面，ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 NisFEG能夠把入侵細(xì)胞膜的Nisin分子排出到細(xì)胞外，減少進(jìn)入細(xì)胞膜的Nisin分子數(shù)量，從而防止Nisin分子局部濃度過高形成孔洞等，避免自身受Nisin的侵害[14]。另外，該基因簇中還存在調(diào)控Nisin合成的蛋白，如NisR和NisK。當(dāng)細(xì)胞外出現(xiàn)成熟的Nisin分子時，它會與NisK結(jié)合，引發(fā)該蛋白組氨酸磷酸化，并將磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移至NisR上使其磷酸化，最終激活nis基因簇上相應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控[15]。

圖1 Nisin生物合成基因簇及其編碼產(chǎn)物(A.nis基因簇結(jié)構(gòu)及其啟動子位置示意圖；B. Nisin結(jié)構(gòu))

3 代謝工程改造促進(jìn)乳酸鏈球菌Nisin的合成

與培養(yǎng)基優(yōu)化相比，代謝工程定向改造在提高菌株次生代謝產(chǎn)物合成能力上具有更強(qiáng)的目的性。在改造策略上可以選擇對目標(biāo)次生代謝產(chǎn)物進(jìn)行基因簇多拷貝、正調(diào)控基因過表達(dá)、負(fù)調(diào)控基因阻斷以及優(yōu)勢基因異源表達(dá)等。

3.1 增加Nisin基因簇中關(guān)鍵基因的拷貝數(shù)

研究發(fā)現(xiàn)增加直接參與Nisin生物合成基因的拷貝數(shù)可促進(jìn)Nisin的產(chǎn)量，增加參與Nisin生物合成調(diào)控與抗性基因的拷貝數(shù)(nisRK和nisFEG)，也可達(dá)到相同的效果[16]。雖然Nisin在其自身的生物合成中是作為誘導(dǎo)劑發(fā)揮作用，但乳酸鏈球菌的正常生長卻受到了Nisin的不利影響。特別是在發(fā)酵的后期，生長培養(yǎng)基中大量Nisin的積累會對乳酸鏈球菌產(chǎn)生反饋抑制作用。由于乳酸鏈球菌可通過產(chǎn)生脂蛋白NisI和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白NisFEG來保護(hù)自己，因此，通過增加乳酸鏈球菌中Nisin耐藥基因(nisI和nisFEG)的表達(dá)，可使細(xì)胞對Nisin的耐藥性增強(qiáng)，從而避免自身受Nisin的影響[17]。Stein等人將含有nisI的重組載體導(dǎo)入野生型乳酸鏈球菌后，使得Nisin的產(chǎn)量提高20%，同時，nisI拷貝數(shù)的增加還促使nis基因簇中其它基因的表達(dá)量增強(qiáng)[14]。有研究人員在對乳酸鏈球菌乳酸亞種164菌株進(jìn)行遺傳操作時，通過對結(jié)構(gòu)基因nisZ、調(diào)控基因nisRK和抗性基因nisFEG進(jìn)行共表達(dá)，使得Nisin Z的活性由16 000 AU·mL-1增強(qiáng)到25 000 AU·mL-1[18]。在其他的研究中發(fā)現(xiàn)，同時提高nisRK和nisFEG的拷貝數(shù)，可使Nisin的產(chǎn)量提高45%[19]。

3.2 提高乳酸鏈球菌對低pH值發(fā)酵液的耐受性

由于乳酸鏈球菌在發(fā)酵過程中會產(chǎn)生乳酸，導(dǎo)致發(fā)酵液pH值會逐漸降低，使得細(xì)胞出現(xiàn)自溶或釋放蛋白酶，進(jìn)而抑制Nisin產(chǎn)量，因此提高菌株對乳酸的耐受性對提高其產(chǎn)量有促進(jìn)作用[20]。解決這個問題的關(guān)鍵是克隆和表達(dá)丙酮酸脫羧酶和醇脫氫酶基因，以促進(jìn)乳酸鏈球菌將碳水化合物代謝生成乙醇。Wardani等人的研究結(jié)果顯示，通過相應(yīng)修飾可使Nisin的產(chǎn)量提高1.7倍[21]。同時有研究發(fā)現(xiàn)通過增加天冬酰胺合成酶基因的拷貝數(shù)來提高乳酸鏈球菌細(xì)胞壁組成中D-Asp酰胺化的比例，可使重組菌株對環(huán)境中酸性條件的耐受性明顯提高，從而提高Nisin的產(chǎn)量。在分批發(fā)酵和補(bǔ)料分批發(fā)酵中，重組菌株F44A的Nisin產(chǎn)量分別提高到3 405 IU·mL-1和5 346 IU·mL-1[22]。此外，Zhang等將17個與耐酸相關(guān)的基因在乳酸鏈球菌F44中進(jìn)行異源表達(dá)或過表達(dá)來維持細(xì)胞內(nèi)最佳pH值。其中，過表達(dá)hdeAB，ldh和murG基因的工程菌株在發(fā)酵過程中，菌株的耐酸能力顯著提高，細(xì)胞內(nèi)pH值更穩(wěn)定且Nisin產(chǎn)量提高到5 560 IU·mL-1[23]。

3.3 提高乳酸鏈球菌整體代謝能力

一般而言，Nisin的產(chǎn)量取決于發(fā)酵過程中乳酸鏈球菌的生物量，高濃度、高活性生產(chǎn)細(xì)胞的存在可顯著促進(jìn)目標(biāo)代謝產(chǎn)物的合成。因此，有許多研究旨在增加發(fā)酵條件下的乳酸鏈球菌基礎(chǔ)代謝能力，從而獲得生產(chǎn)性能高的工程菌。如Papagianni等人[24]將黑曲霉中與能量代謝相關(guān)的aox1基因在乳酸鏈球菌中進(jìn)行異源表達(dá)，使細(xì)胞產(chǎn)生更多的能量，加速細(xì)胞分裂和代謝，最終使菌株生物量由3.2 g·L-1提高到5.8 g·L-1，Nisin的產(chǎn)量由5 900 IU·mL-1增加到7 900 IU·mL-1。他們又將pfk13-pkaC-aox1基因同時在乳酸鏈球菌中進(jìn)行表達(dá)，通過提高菌株對發(fā)酵液中碳源的利用和能量生成，使得菌株生物量達(dá)到7.5 g·L-1，Nisin活性達(dá)到14 000 IU·mL-1。除上述研究來促進(jìn)Nisin的合成外，有研究人員還借助基因組重排技術(shù)來提高Nisin產(chǎn)量，所獲得的突變株F44能耐受高濃度的葡萄糖(8%～15%)和Nisin (5 000～14 000 IU·mL-1)，最終使突變株Nisin的產(chǎn)量提高了2.4倍[25]。

4 合成生物學(xué)技術(shù)在改造乳酸鏈球菌合成Nisin中的策略

單個基因修飾在一定程度上能夠促進(jìn)目標(biāo)次生代謝產(chǎn)物生物合成，但次生代謝產(chǎn)物合成途徑通常相對復(fù)雜，受到多個代謝途徑和轉(zhuǎn)錄因子共同控制。通過對單個基因進(jìn)行修飾可能只會增加部分酶的表達(dá)量，對整個代謝途徑的影響不明顯，甚至中間產(chǎn)物的過度積累有時可能會對Nisin生物合成起抑制作用，導(dǎo)致難以按照確定的目標(biāo)進(jìn)行設(shè)計或設(shè)計的系統(tǒng)不穩(wěn)定，因此，亟需采用新的遺傳改造策略來提高Nisin的產(chǎn)量。近年來，合成生物學(xué)的興起和發(fā)展使得對微生物進(jìn)行遺傳改造進(jìn)入到一個全新的階段，研究主流也從單一基因的設(shè)計擴(kuò)展到對多個代謝途徑進(jìn)行改造。通過深度挖掘高效功能元件，重構(gòu)代謝網(wǎng)絡(luò)，優(yōu)化元件與底盤的適配性，并對代謝網(wǎng)絡(luò)流量進(jìn)行精細(xì)調(diào)控，從而構(gòu)建基于人工基因線路的定制化細(xì)胞來實現(xiàn)藥物與功能材料或目的化合物的大規(guī)模生產(chǎn)及應(yīng)用[26]。

4.1 優(yōu)勢底盤細(xì)胞構(gòu)建

在特定環(huán)境中，維持細(xì)菌正常代謝所需的必需基因構(gòu)成了該菌株的最小基因組。采用最小基因組作為底盤微生物進(jìn)行目標(biāo)產(chǎn)物的合成，可減少本底其他不必要的代謝路徑對底物、能量和還原力的消耗。已公布的微生物全基因組測序結(jié)果顯示，基因組中存在大量的編碼非目標(biāo)產(chǎn)物的基因簇、前噬菌體序列、轉(zhuǎn)座酶和插入序列等，這些基因元件的存在很可能干擾目標(biāo)產(chǎn)物的合成與檢測，同時導(dǎo)致菌株遺傳物質(zhì)不穩(wěn)定[27]。因此優(yōu)勢底盤細(xì)胞的開發(fā)最重要的策略就是對目標(biāo)菌株進(jìn)行基因組精簡和優(yōu)化，并在很多微生物合成生物學(xué)改造中得到了廣泛應(yīng)用。如枯草芽胞桿菌PG10與野生型枯草芽胞桿菌相比，其基因組已縮減36%，但該突變株克服了與分泌過程和分泌產(chǎn)物不穩(wěn)定性有關(guān)的蛋白質(zhì)生產(chǎn)的幾個瓶頸，顯著提高細(xì)菌表達(dá)宿主分泌蛋白的產(chǎn)量[28]。研究發(fā)現(xiàn)慢病毒在大腸桿菌中進(jìn)行克隆時往往表現(xiàn)出極大的不穩(wěn)定性，導(dǎo)致難以獲得有效的克隆，Chakiath等人[29]對大腸桿菌基因組進(jìn)行縮減后，有效地促進(jìn)了慢病毒表達(dá)載體在細(xì)胞內(nèi)的重組穩(wěn)定性。Zhou等人[30]敲除了天藍(lán)色鏈霉菌體內(nèi)所有的10個PKS，NRPS基因簇以及900 kb的端粒序列，并在該底盤內(nèi)實現(xiàn)了放線紫紅素的過表達(dá)。已公布的乳酸鏈球菌全基因組測序結(jié)果顯示，其基因組不僅存在一定的可塑性(1.71～2.96 Mb)，還包括多個非必須基因區(qū)域、前噬菌體序列和插入序列等，對其進(jìn)行精減，可極大減少本底非必須代謝途徑對底物、能量和還原力的消耗以及維持菌株的遺傳穩(wěn)定，從而顯著促進(jìn)Nisin的合成。

4.2 前體合成途徑優(yōu)化

目標(biāo)產(chǎn)物在宿主細(xì)胞中合成不足，很有可能是由于宿主內(nèi)某些底物或前體供應(yīng)不足?？梢酝ㄟ^組合生物合成的方法對宿主菌代謝途徑進(jìn)行改造和優(yōu)化，以滿足目標(biāo)產(chǎn)物合成所需底物和前體的供應(yīng)。如果通過基因組精簡來敲除和沉默原有基因簇的手段是“節(jié)流”，那么通過改造和優(yōu)化代謝途徑來增加底物和前體含量的方法可稱之為“開源”，這種方法需要對宿主菌的整個代謝網(wǎng)絡(luò)有比較深入的了解，才能夠進(jìn)行合理的改造。孫偉康等人[31]基于基因組功能注釋和比較基因組學(xué)構(gòu)建了乳酸鏈球菌的首個基因組規(guī)模代謝網(wǎng)絡(luò)模型，該模型共涉及557個基因，668個代謝物，840個反應(yīng)，并進(jìn)一步在定性和定量兩個層次驗證了模型的準(zhǔn)確性，較為全面地揭示了乳酸鏈球菌的代謝特點(diǎn)，為乳酸鏈球菌的前體合成途徑改造和優(yōu)化提供了良好的工具?；贜isin的結(jié)構(gòu)解析可知，其生物合成至少涉及14種常見氨基酸和4種稀有氨基酸。結(jié)合基因組規(guī)模代謝網(wǎng)絡(luò)模型，可將涉及上述氨酸酸合成的代謝通路增強(qiáng)、競爭性代謝通路阻斷等來優(yōu)化前體合成途徑，從而提高Nisin的合成能力。

5 總結(jié)與展望

Nisin是唯一被批準(zhǔn)用于食品工業(yè)的細(xì)菌素，其主要用于肉制品、乳制品、生鮮果蔬的保鮮?，F(xiàn)階段Nisin主要通過微生物發(fā)酵生產(chǎn)，然而野生型菌株Nisin的合成量遠(yuǎn)不能滿足工業(yè)化生產(chǎn)需求。發(fā)酵工藝優(yōu)化以及對關(guān)鍵功能基因進(jìn)行過表達(dá)是促進(jìn)乳酸鏈球菌合成Nisin的重要措施，但并沒有顯著提高Nisin的產(chǎn)量。近年來，合成生物學(xué)技術(shù)在提高目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)量上有著發(fā)酵工藝和代謝工程改造所無法具備的優(yōu)點(diǎn)，也是研究者們不斷關(guān)注的熱點(diǎn)。多株乳酸鏈球菌全基因組測序數(shù)據(jù)的公布以及基于乳酸鏈球菌基因組規(guī)模代謝網(wǎng)絡(luò)模型的構(gòu)建，使得研究人員能夠?qū)⑷樗徭溓蚓鳛橐粋€整體來研究，從而獲得與Nisin生物合成密切相關(guān)的合成途徑與代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為挖掘高效功能元件、確認(rèn)合成途徑中關(guān)鍵功能基因和代謝途徑奠定重要基礎(chǔ)。多種基因組編輯技術(shù)的出現(xiàn)，如CRISPR/Cas9技術(shù)、Red/ET同源重組技術(shù)、Cre/loxP位點(diǎn)特異性重組技術(shù)等，可為乳酸鏈球菌進(jìn)行合成生物學(xué)改造提供重要編輯工具，為促進(jìn)乳酸鏈球菌Nisin的生物合成帶來全新的機(jī)遇。