外周血ctDNA中KRAS/BRAF基因突變檢測(cè)在晚期結(jié)直腸癌中的臨床價(jià)值*

馮 芬

廣東省佛山市第一人民醫(yī)院胃腸腫瘤內(nèi)科 528000

結(jié)直腸癌是臨床常見(jiàn)的一種異質(zhì)性疾病，是第三大起源于上皮組織的惡性腫瘤，在中國(guó)，結(jié)直腸癌的發(fā)病率和死亡率分別位居惡性腫瘤的第三位和第四位，嚴(yán)重威脅患者生命安全[1]。近年來(lái)，結(jié)直腸癌的發(fā)病率以3.9%/年的速度急劇增加，且呈現(xiàn)出年輕化趨勢(shì)[2]。目前，臨床針對(duì)結(jié)直腸癌的篩查尚缺乏有效手段，且疾病早期無(wú)特異性臨床表現(xiàn)，因而多數(shù)患者首次確診時(shí)便已經(jīng)處于晚期，甚至已經(jīng)伴有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[3]。已有研究顯示，針對(duì)晚期結(jié)直腸癌，常規(guī)化療方案的治療效果欠佳[4]。隨著結(jié)直腸癌中越來(lái)越多的基因位點(diǎn)被認(rèn)識(shí)，相應(yīng)的靶點(diǎn)抑制劑也顯示了有效性好、安全性高及患者依從性高的優(yōu)點(diǎn)[5]。西妥昔單抗是一種靶向表皮生長(zhǎng)因子受體的分子靶向藥物，已獲批用于晚期結(jié)直腸癌的一線治療。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)于KRAS/BRAF野生型晚期結(jié)直腸癌患者，西妥昔單抗聯(lián)合化療的治療效果較為明顯，患者的生存時(shí)間得到顯著延長(zhǎng)；但是隨著靶向治療時(shí)間的延長(zhǎng)，不可避免地出現(xiàn)了獲得性耐藥現(xiàn)象，因而已成為臨床急需解決的一項(xiàng)難題[6]。近年來(lái)，深入研究發(fā)現(xiàn)，KRAS和BRAF基因在結(jié)直腸癌獲得性耐藥、疾病進(jìn)展等方面具有重要作用。因而本研究為了進(jìn)一步研究可以高效、快捷、穩(wěn)定且動(dòng)態(tài)地監(jiān)測(cè)獲得性耐藥的機(jī)制，通過(guò)循環(huán)腫瘤DNA(ctDNA)對(duì)結(jié)直腸癌患者的KRAS和BRAF基因突變情況進(jìn)行檢測(cè)，并對(duì)其臨床意義進(jìn)行探討，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2018年6月—2020年6月本院收治的晚期結(jié)直腸癌患者50例為研究對(duì)象，其中男27例(54.0%)，女23例(46.0%)；年齡35～64歲，平均年齡(49.6±5.2)歲；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移21例(42.0%)，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移29例(58.0%)。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)經(jīng)病理檢查確診為晚期結(jié)直腸癌，臨床分期為Ⅲb～Ⅳ期，組織學(xué)類型為腺癌；(2)原發(fā)性結(jié)直腸癌；(3)經(jīng)電子計(jì)算機(jī)斷層掃描具有可測(cè)量病灶；(4)接受至少2個(gè)周期的西妥昔單抗聯(lián)合化療治療，且至少進(jìn)行1次評(píng)估；(5)腫瘤組織基因檢測(cè)為KRAS-WT和BRAF-WT。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并其他部位惡性腫瘤；(2)合并嚴(yán)重心、肝和腎功能不全；(3)任何曾經(jīng)接受或正在接受放化療、靶向治療或生物治療；入組前3個(gè)月內(nèi)接受過(guò)輸血；無(wú)法提供基因檢測(cè)樣本(外周血)；合并已知的免疫缺陷病史(如HIV感染史)和/或丙型肝炎等傳染病史。

1.2 治療方法 所有患者均接受西妥昔單抗聯(lián)合化療方案進(jìn)行治療，具體方法：第1天，奧沙利鉑130mg/m2，靜脈滴注；第1～14天，卡培他濱900mg/m2，口服，每3周為1個(gè)療程。在化療前1d，接受西妥昔單抗注射液治療，初始劑量400mg/m2，靜脈輸注2h；之后每周維持劑量為250mg/m2，靜脈輸注1h，每3周為1個(gè)療程。治療結(jié)束后1個(gè)月，采用實(shí)體瘤療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)(RECIST 1.1)[7]對(duì)所有患者的治療效果進(jìn)行評(píng)價(jià)，分為完全緩解、部分緩解、疾病穩(wěn)定和疾病進(jìn)展?？陀^緩解率=(完全緩解+部分緩解)例數(shù)/總例數(shù)×100%，疾病控制率=(完全緩解+部分緩解+疾病穩(wěn)定)例數(shù)/總例數(shù)×100%。

1.3 外周血ctDNA和組織標(biāo)本中KRAS和BRAF基因突變檢測(cè) 血液樣本：采集患者的清晨空腹靜脈血8～10ml置于EDTA抗凝管中，在室溫下置于離心機(jī)上，以2 000r/min的轉(zhuǎn)速離心10min，分離患者血漿。取分離得到的血漿樣本(上清液)，手動(dòng)抽提其中的DNA，采用NanoDrop 2000核酸定量測(cè)定儀對(duì)抽提得到的血漿樣本中的DNA進(jìn)行定量分析；在熒光定量PCR儀上按照突變擴(kuò)增阻滯系統(tǒng)法對(duì)外周血ctDNA中的KRAS和BRAF基因突變情況進(jìn)行檢測(cè)，具體步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。組織標(biāo)本：收集患者的腫瘤組織和癌旁組織樣本，采用QIAamp FFPE Tissue Kit(Qiagen)抽提腫瘤組織樣本中的基因組DNA。KRAS和BRAF基因突變情況檢測(cè)與上述血液樣本的檢測(cè)方法相同。突變結(jié)果判定：基因突變含量>1%，突變Ct值≥29時(shí)，判定為基因突變陽(yáng)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS18.0軟件處理所得數(shù)據(jù)。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和百分比(%)表示，采用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較；采用Kaplan-Meier法進(jìn)行生存分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.3 外周血ctDNA中KRAS、BRAF基因突變與晚期結(jié)直腸癌患者臨床特征的關(guān)系 年齡≥50歲、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的晚期結(jié)直腸癌患者的KRAS、BRAF基因突變率高于年齡<50歲、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 不同臨床特征結(jié)直腸癌患者外周血ctDNA中KRAS、BRAF基因突變率比較[ n(%)]

表2 外周血ctDNA中KRAS、BRAF基因突變和未突變患者的療效情況[ n(%)]

2.5 外周血ctDNA中KRAS、BRAF基因突變與晚期結(jié)直腸癌患者預(yù)后(中位無(wú)進(jìn)展生存期)的關(guān)系 外周血ctDNA中KRAS基因突變患者的中位無(wú)進(jìn)展生存時(shí)間為10.30個(gè)月(95%CI：8.383～12.217)，KRAS基因未突變患者的中位無(wú)進(jìn)展生存時(shí)間為11.30個(gè)月(95%CI：9.779～12.822)，KRAS基因未突變患者的生存情況優(yōu)于KRAS基因突變患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Log-Rank=4.351，P=0.037)，見(jiàn)圖1。

圖1 KRAS基因突變和KRAS基因未突變患者的中位無(wú)進(jìn)展生存曲線

外周血ctDNA中BRAF基因突變患者的中位無(wú)進(jìn)展生存時(shí)間為8.10個(gè)月(95%CI：5.051～11.149)，BRAF基因未突變患者的中位無(wú)進(jìn)展生存時(shí)間為11.10個(gè)月(95%CI：10.403～11.797)，BRAF基因未突變患者的生存情況優(yōu)于BRAF基因突變患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Log-Rank=8.143，P=0.004)，見(jiàn)圖2。

圖2 BRAF基因突變和BRAF基因未突變患者的中位無(wú)進(jìn)展生存曲線

3 討論

結(jié)直腸癌的發(fā)生、進(jìn)展是一個(gè)多基因參與的復(fù)雜過(guò)程，隨著手術(shù)、化療、放療及聯(lián)合療法的不斷改善，結(jié)直腸癌患者的治療效果及預(yù)后都得到了很大提升，但是對(duì)于晚期結(jié)直腸癌，尤其伴有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者，療效仍較差[8]。西妥昔單抗是臨床常用的治療結(jié)直腸癌的靶向藥物，且在晚期患者中顯示出了較好的治療效果，使結(jié)直腸癌的臨床治療進(jìn)入了靶向治療時(shí)代[9]。已有研究表明，下游基因如KRAS、BRAF基因的狀態(tài)，可以影響西妥昔單抗治療的療效[10]。相關(guān)研究指出，KRAS/BRAF野生型晚期結(jié)直腸癌患者可以從西妥昔單抗治療中獲益，但KRAS/BRAF突變型患者卻獲益較小甚至無(wú)獲益[11-12]。因而，聯(lián)合檢測(cè)KRAS和BRAF基因?qū)︻A(yù)測(cè)西妥昔單抗在晚期結(jié)直腸癌中的療效具有重要意義。

ctDNA是來(lái)源于腫瘤細(xì)胞的游離DNA，是細(xì)胞壞死或凋亡后釋放至外周血的DNA[13]。相關(guān)研究顯示，與健康人群相比，腫瘤患者外周血ctDNA水平顯著增高，且與腫瘤組織具有一致性[14]。本研究結(jié)果顯示，50例晚期結(jié)直腸癌患者腫瘤組織中KRAS、BRAF基因突變率均高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；但腫瘤組織中KRAS、BRAF基因突變率均與外周血ctDNA相似，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，與相關(guān)研究結(jié)果一致[15]。提示外周血ctDNA與腫瘤組織的一致性較好，臨床可以通過(guò)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)外周血ctDNA中的KRAS、BRAF基因突變情況，對(duì)患者的治療和預(yù)后進(jìn)行合理調(diào)整和有效評(píng)估。本研究還發(fā)現(xiàn)，年齡較大，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的晚期結(jié)直腸癌患者的KRAS、BRAF基因突變率較高，且KRAS、BRAF基因未突變患者的治療效果和預(yù)后均優(yōu)于KRAS、BRAF基因突變患者。提示KRAS、BRAF野生型患者可以更好地從西妥昔單抗中獲益。但由于本研究的樣本量較小，因而尚需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量進(jìn)行深入研究。

綜上所述，外周血ctDNA與腫瘤組織的一致性較好，在臨床上無(wú)法獲取腫瘤組織標(biāo)本時(shí)可行外周血ctDNA替代，且可以通過(guò)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)外周血ctDNA中KRAS、BRAF基因突變情況對(duì)晚期結(jié)直腸癌患者的療效和預(yù)后情況進(jìn)行評(píng)估，進(jìn)而有助于臨床醫(yī)師為患者選擇個(gè)體化治療方案，改善患者預(yù)后。