電針人迎、太沖穴對自發(fā)性高血壓大鼠模型腎臟組織FoxP3和RORγt的影響*

張麗麗 ，杜凱 ，王洋 ，王文慧 ，趙孟雄 ，沈燕 ，4

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，天津 300193；2.國家中醫(yī)針灸臨床醫(yī)學(xué)研究中心，天津 300193；3.天津市針灸學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300193；4.天津市針灸研究所，天津 300193）

高血壓已成為全球重大公共衛(wèi)生問題，是引起心腦血管、腎臟疾病的重要危險(xiǎn)因素[1]，研究表明，高血壓前期的發(fā)生率約占成人50%，遠(yuǎn)期并發(fā)癥使患者壽命減少5年[2]。高血壓病前期是高血壓和正常血壓之間的一種臨界狀態(tài)，其危害主要表現(xiàn)在極易進(jìn)展為臨床高血壓，此期已存在靶器官損害，如微量白蛋白尿、視網(wǎng)膜小動脈狹窄、頸動脈內(nèi)中膜厚度增加，左室肥厚等[3]。因此，深入研究高血壓病的發(fā)病機(jī)制，積極探索有效的干預(yù)方法，是當(dāng)前高血壓防治的重點(diǎn)和難點(diǎn)。針灸干預(yù)疏通經(jīng)絡(luò)，平衡人體氣血陰陽。因此，在高血壓病早期或尚未發(fā)生靶器官損害及并發(fā)癥發(fā)生的情況下，采用針灸治療以調(diào)和經(jīng)絡(luò)氣血，使機(jī)體達(dá)到陰平陽秘的狀態(tài)，是有效防治高血壓病的重要手段。

近年來，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)免疫-炎癥機(jī)制對高血壓病的發(fā)生、發(fā)展起重要的作用[4]，Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞在高血壓病中的關(guān)系日益受到重視，腎組織免疫炎性細(xì)胞的浸潤與高血壓病發(fā)生密切相關(guān)[4]。高血壓病前期大鼠Treg細(xì)胞比例降低，Treg細(xì)胞下降促進(jìn)高血壓病的發(fā)生發(fā)展[5]。正常情況下兩種細(xì)胞效應(yīng)處于一種平衡狀態(tài)，兩者失衡是促進(jìn)高血壓病發(fā)生發(fā)展的重要因素。叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子（FoxP3）、維甲酸相關(guān)孤獨(dú)核受體-γt（RORγt）分別為Treg細(xì)胞和Th17細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子。干預(yù)FoxP3、RORγt這一重要環(huán)節(jié)可能起到緩解疾病進(jìn)展的作用。為此，本研究采用“活血散風(fēng)”針刺法干預(yù)4周齡自發(fā)性高血壓大鼠模型，從FoxP3、RORγt蛋白及mRNA的調(diào)節(jié)作用角度，觀察電針對自發(fā)性高血壓大鼠（SHRs）的治療效果，為電針干預(yù)高血壓前期大鼠效應(yīng)機(jī)制的闡明提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物與分組 健康雄性SHR大鼠16只，4周齡，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司提供，適應(yīng)性喂養(yǎng)2 d。SHR大鼠經(jīng)篩選后分為即模型對照組（SHR組）、電針+SHR組，每組8只；健康雄性WKY 8只，4周齡，作為正常對照組（WKY組）。實(shí)驗(yàn)動物于二級動物房飼養(yǎng)，室溫20～25℃，光照時(shí)間07：00～19：00，自由攝食飲水。

1.2 主要試劑和儀器 ROR兔多抗（Abcam公司，ab278099），F(xiàn)oxP3 兔多抗（Abcam 公司，ab215206），β-actin鼠單克隆抗體（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，TA-09），山羊抗兔 IgG（H+L）HRP（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，ZB2301）。電針儀（HANS-200E，南京濟(jì)生醫(yī)療科技有限公司），血壓儀（北京軟隆生物技術(shù)有限公司，中國），LightCycler?96實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）儀（羅氏公司，瑞士）。

1.3 治療方法

1.3.1 穴位及針具的選擇 大鼠人迎穴定位參照沈雪勇《經(jīng)絡(luò)腧穴學(xué)》和王增濤《Wistar大鼠解剖圖譜》，位于頸部三角區(qū)內(nèi)、平耳垂，當(dāng)胸骨舌骨肌與胸鎖乳突及上緣交點(diǎn)、頸動脈搏動處。太沖穴位于后肢足背1、2趾骨間凹陷處。

針具選用“華佗牌”毫針（蘇州醫(yī)療用品廠生產(chǎn)）。電針儀選用韓氏神經(jīng)穴位刺激儀HANS-200E（南京濟(jì)生醫(yī)療科技有限公司，產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)編YZB/蘇0049-2008）。

1.3.2 干預(yù)方法及電針刺激參數(shù) 1）電針+SHR組：采用鼠衣束縛固定大鼠，暴露針刺部位，針刺雙側(cè)人迎穴，針刺深度5 mm，雙側(cè)太沖穴，針刺深度2 mm；刺激參數(shù)：疏密波，頻率2/15 Hz，電流1 mA，持續(xù)時(shí)間15 min。每日上午10點(diǎn)針刺1次，5日/周，共2周。2）SHR組和WKY組：均不給予任何干預(yù)，僅于每日針刺干預(yù)同一時(shí)間點(diǎn)給予相同方法及強(qiáng)度的束縛固定。

1.4 觀察指標(biāo)及檢測方法

1.4.1 血壓測量 使用日本Softron無創(chuàng)血壓儀進(jìn)行鼠尾血壓測量。在室溫（22±2）℃條件下，測量大鼠安靜、清醒狀態(tài)鼠尾血壓，待血流波形穩(wěn)定后，開始記錄數(shù)據(jù)，共記錄5組，去掉最高值和最低值，取平均值。測量干預(yù)前、干預(yù)1周后、干預(yù)2周后大鼠的血壓。

1.4.2 腎臟組織形態(tài) 在治療結(jié)束后2周時(shí)，各組大鼠禁食24 h，按3.5 mL/kg的比例腹腔注射10%水合氯醛，深度麻醉后頸椎離斷處死，固定在大鼠手術(shù)臺上，常規(guī)消毒，沿腹正中線剪開腹腔，迅速取出大鼠腎臟，剝離包膜，左腎稱量質(zhì)量后放入固定瓶內(nèi)（4%多聚甲醛固定液）備用，右腎立即放入液氮凍存，置于-80℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

將制備好的部分腎臟組織固定于4%多聚甲醛固定液24h以上，梯度乙醇及二甲苯脫水，石蠟浸蠟，包埋，切片機(jī)上切片，片厚4μm；二甲苯脫蠟20mim，梯度乙醇各5 min，流水沖洗15 min，蘇木精染色8 min，清水沖洗10 min，伊紅染液染色1～3 min。梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，光鏡下觀察腎臟組織形態(tài)。

1.4.3 FoxP3、RORγt表達(dá)水平檢測

1.4.3.1 蛋白免疫印跡（Western blot）法測定腎臟FoxP3、RORγt蛋白的表達(dá) 取腎臟100 mg，剪碎，加入裂解液，充分研磨，冰上裂解30 min，7800 g，離心20 min取上清液，BCA法計(jì)算樣本蛋白濃度。加入蛋白上樣緩沖液，沸水浴中10 min使蛋白變性，制備分離膠和濃縮膠，用微量加樣器將樣品加入樣品槽中，上樣量為 30 μg，電泳：濃縮膠 80 V 30 min，分離膠12 V 50 min；濕轉(zhuǎn)法將蛋白電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，電流為300 mA 2 h，用5%脫脂奶粉封閉，TBST洗膜 3×5min，稀釋一抗：β-actin1∶1000，RORγt1∶500，F(xiàn)oxP3 1∶1 000；將膜放入雜交袋中加入一抗，4℃孵育過夜；室溫平衡 30 min，TBST 洗膜 3×5 min，稀釋二抗：辣根酶標(biāo)記的山羊抗兔1∶20 000，辣根酶標(biāo)記的山羊抗小鼠1∶20 000，將膜浸在二抗中，于搖床上室溫孵育1 h。洗膜后進(jìn)行ECL反應(yīng)，凝膠成像分析系統(tǒng)攝像分析。用Image J軟件讀取灰度值對蛋白進(jìn)行半定量分析。

1.4.3.2 RT-PCR技術(shù)測定腎臟組織FoxP3、RORγt mRNA表達(dá) 取100 mg腎臟組織，加入液氮研碎組織，收集組織粉于EP管；加入1 mL Trizol裂解液輕輕震蕩，使組織充分裂解，冰上靜置5 min；12 000 g，4℃離心5 min，吸取上清液，移入新的EP管中。每管加入200 μL氯仿，顛倒混勻，室溫靜置5 min，12 000 g，4℃離心15 min；吸取上層水相移至新的EP管中，每管加入500 μL異丙醇，顛倒混勻，室溫靜置10 min，12 000 g，4℃離心10 min，棄上清液；加入1 mL 75%的乙醇，渦旋混合，7 500 g，4℃離心5 min，棄上清液，室溫干燥 10 min；加入 20 μL 的DEPC水溶解RNA（或置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆茫?；取少量總RNA用微量核酸蛋白分析儀分析RNA含量和純度；將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)體系為：MIX 10 μL，上游引物 0.5 μL，下游引物 0.5 μL，模板 cDNA 2 μL，水 7 μL；反應(yīng)參數(shù)為：預(yù)變性 95 ℃，3 min；變性95 ℃，5 s；退火 56 ℃，10 s；延伸 72 ℃，25 s；39 個(gè)循環(huán)；溶解曲線分析；引物序列如下：RORγt-F：ATGGAGCTCTGCCAGAATGA，RORγt-R：TGCGGTTGTC-AGCATTGTAG；FoxP3-F：CAGCGTGGTTTTTCTTCTCGGTATA，F(xiàn)oxP3-R：TGGTGAAGTGGACTGACAGAAAAG；GAPDH-F：TGAGTCCTTCCACGATACCA；GAPDH-R：ATCCCATCACCATCTTCCAG。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)應(yīng)用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 22.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，統(tǒng)計(jì)描述采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），各個(gè)實(shí)驗(yàn)組之間的兩兩比較采用最小顯著性差異法（LSD test），P＜0.05 代表差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠血壓水平變化 干預(yù)前3組大鼠收縮壓比較，SHR組、電針+SHR組大鼠收縮壓水平顯著高于 WKY 組（P＜0.05），提示 4周齡 SHR 大鼠血壓明顯高于WKY大鼠；干預(yù)2周后，與SHR組比較，電針+SHR組收縮壓水平降低，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），提示電針有延緩收縮壓上升的趨勢。見表1。

表1 各組大鼠干預(yù)前后收縮壓變化情況（±s）Tab.1 The level of blood pressure in the WKY，SHR and acupuncture+SHR groups（±s）mm Hg

表1 各組大鼠干預(yù)前后收縮壓變化情況（±s）Tab.1 The level of blood pressure in the WKY，SHR and acupuncture+SHR groups（±s）mm Hg

注：與 WKY 組比較，*P＜0.05；與 SHR 組比較，#P＜0.05。

組別 動物數(shù) 干預(yù)前 干預(yù)后1周 干預(yù)后2周WKY 組 8 132.50±7.75 142.13±4.67 145.13±12.81 SHR 組 8 145.75±12.54*155.38±13.90*177.38±6.16*電針+SHR 組 8 145.25±5.65*154.13±9.70*168.25±3.62*#

2.2 大鼠腎臟形態(tài) WKY組腎臟組織可見腎小管排列緊密，腎小管上皮細(xì)胞形態(tài)正常，腎小球毛細(xì)血管界限較清晰；SHR組、電針+SHR組腎臟組織腎小球形態(tài)尚正常，少量的腎小管上皮細(xì)胞胞質(zhì)疏松，少量腎小管上皮細(xì)胞脫落入管腔（箭頭示）。見圖1。

圖1 各組大鼠腎臟組織HE染色Fig.1 HE staining of rat kidney in the WKY，SHR and Acupuncture+SHR groups

2.3 大鼠腎臟組織FoxP3、RORγt的蛋白表達(dá) 腎臟FoxP3蛋白表達(dá)水平比較，SHR組低于WKY組，電針+SHR組高于SHR組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；腎臟 RORγt蛋白表達(dá)水平比較，SHR 組高于WKY組，電針+SHR組低于SHR組，但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；FoxP3/RORγt蛋白表達(dá)的比值組間比較，SHR組低于WKY組，電針+SHR組高于 SHR 組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2、圖 2。

表2 各組大鼠腎臟FoxP3蛋白和RORγt蛋白的相對表達(dá)情況（±s）Tab.2 Relative protein expression of FoxP3，RORγt in kidney tissues of rats in each group（±s）

表2 各組大鼠腎臟FoxP3蛋白和RORγt蛋白的相對表達(dá)情況（±s）Tab.2 Relative protein expression of FoxP3，RORγt in kidney tissues of rats in each group（±s）

注：與 WKY 組比較，*P＜0.05；與 SHR 組比較，#P＜0.05。

組別 動物數(shù) FoxP3 RORγt FoxP3/RORγt WKY 組 8 0.90±0.30 0.69±0.12 1.25±0.31 SHR 組 8 0.52±0.18* 0.80±0.23 0.69±0.27*電針+SHR 組 8 0.79±0.28# 0.74±0.16 1.21±0.71#

圖2 各組大鼠腎臟組織中FoxP3和RORγt蛋白的相對表達(dá)（±s，n=8）Fig.2 Relative expression of FoxP3 and RORγt protein in kidney tissues of rats in each group(±s，n=8)

2.4 大鼠腎臟組織FoxP3和RORγt的mRNA表達(dá) 腎臟FoxP3 mRNA表達(dá)水平比較，SHR組、電針+SHR組低于 WKY 組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；腎臟RORγt mRNA表達(dá)水平比較，SHR組高于WKY組，電針+SHR組低于SHR組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；FoxP3/RORγt mRNA 表達(dá)的比值比較，SHR組低于WKY組，電針+SHR組高于SHR組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表 3。

表3 各組大鼠腎臟FoxP3和RORγt mRNA的相對表達(dá)情況（±s）Tab.3 Relative expression of FoxP3 and RORγt mRNA in kidney tissues of rats in each group（±s）

表3 各組大鼠腎臟FoxP3和RORγt mRNA的相對表達(dá)情況（±s）Tab.3 Relative expression of FoxP3 and RORγt mRNA in kidney tissues of rats in each group（±s）

注：與 WKY 組比較，*P＜0.05；與 SHR 組比較，#P＜0.05。

組別 動物數(shù) FoxP3 RORγt FoxP3/RORγt WKY 組 8 1.63±0.11 1.55±0.06 1.06±0.11 SHR 組 8 1.50±0.05* 1.80±0.16* 0.84±0.04*電針+SHR 組 8 1.53±0.08* 1.56±0.11# 0.98±0.11#

3 討論

高血壓病前期仍處于萌芽狀態(tài)，既可發(fā)展成高血壓病，又可在這個(gè)階段逆轉(zhuǎn)，所以高血壓病前期是非常重要的干預(yù)介入時(shí)點(diǎn)。針刺治療作為中醫(yī)學(xué)特色療法之一，可疏通經(jīng)絡(luò)氣血，激發(fā)人體正氣，調(diào)整機(jī)體陰陽平衡。石學(xué)敏院士提出的“活血散風(fēng)”針刺降壓法，以人迎和太沖穴為主穴，臨床研究證實(shí)降壓效應(yīng)確切。人迎穴最早載于《靈樞·本輸》，為足陽明胃經(jīng)經(jīng)穴，為足陽明少陽之會，與腎、脾、肝、心、三焦、膽、小腸、沖脈、任脈、陰蹺脈等經(jīng)脈相通，是調(diào)節(jié)氣海的“營運(yùn)之輸”，是“氣?！敝T戶，有寬胸理氣、調(diào)和氣血，調(diào)節(jié)血壓的功能。太沖為足厥陰之原穴，具有寬胸理氣、平肝息風(fēng)、活血化瘀、調(diào)和氣血陰陽平衡之功。

近年來，越來越多的文獻(xiàn)報(bào)道T細(xì)胞在原發(fā)性高血壓病的發(fā)病中發(fā)揮重要作用[6]，腎臟、血管壁及血管外周免疫細(xì)胞浸潤和炎癥因子的釋放是高血壓病的重要特征[7-8]。血管緊張素Ⅱ、醛固酮和鹽等刺激中樞和直接作用于腎臟、血管系統(tǒng)，導(dǎo)致血壓輕度上升，此時(shí)為高血壓病前期。此期輕微組織損傷、新抗原或損傷相關(guān)性分子形成，激活抗原呈遞細(xì)胞，發(fā)生免疫反應(yīng)，T淋巴細(xì)胞被激活。Th17細(xì)胞釋放細(xì)胞因子IL-17等，引起前炎性反應(yīng)，導(dǎo)致血管收縮，促進(jìn)鈉水吸收，進(jìn)而促進(jìn)高血壓病的發(fā)展，導(dǎo)致血管重構(gòu)和心腦腎等重要臟器損害[9-11]。FoxP3是Terg細(xì)胞的特異性標(biāo)志物，該因子不僅對T細(xì)胞具有活性調(diào)節(jié)作用，而且還是體內(nèi)重要的抗炎因子。研究發(fā)現(xiàn)，Tregs的保護(hù)性作用可能主要通過FoxP3的直接調(diào)節(jié)，F(xiàn)oxP3及RORγt分別是Treg和Th17細(xì)胞分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，敲除RORγt會影響Th17細(xì)胞的分化，減輕炎癥反應(yīng)[12-13]。FoxP3與RORγt的表達(dá)異常是導(dǎo)致Treg/Th17失衡的關(guān)鍵。研究發(fā)現(xiàn)，替米沙坦與瑞舒伐他汀聯(lián)合治療可改善高血壓病頸動脈粥樣硬化患者Th17/Treg功能平衡[14]，然而以高血壓病前期大鼠為研究對象，從FoxP3/RORγt失衡角度探索針刺降壓機(jī)制的研究鮮有報(bào)道。

SHR是通過自然篩選的：1963年日本京都大學(xué)醫(yī)學(xué)院利用有自發(fā)性高血壓的Wistar雄性鼠和高血壓水平稍高的雌性Wistar鼠交配，從所得的F1代開始近交篩選，隨著代數(shù)增加，自發(fā)性高血壓發(fā)生率逐漸增大。1969年美國國立衛(wèi)生研究院（NIH）引入了SHR。SHR除有高血壓自發(fā)率為100%特點(diǎn)外，還有高血壓性心血管病變，適于人類的高血壓病研究。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與WKY組大鼠相比，6周齡高血壓病模型大鼠腎臟組織RORγt mRNA表達(dá)升高，F(xiàn)oxP3蛋白和mRNA的表達(dá)、FoxP3/RORγt的比值明顯降低，當(dāng)電針干預(yù)后，腎臟組織FoxP3蛋白表達(dá)增加，RORγt mRNA表達(dá)降低；電針還可提高FoxP3/RORγt的比值，使其趨于正常。結(jié)合收縮壓水平的下降，說明FoxP3和RORγt在電針治療低周齡高血壓病大鼠的效應(yīng)機(jī)制中發(fā)揮了重要作用。因此，電針可降低高血壓前期大鼠的血壓水平，其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)FoxP3/RORγt的動態(tài)平衡有關(guān)。

高血壓可以直接造成腎臟形態(tài)的損害，主要表現(xiàn)為腎小球和腎小管受損[15]。本研究發(fā)現(xiàn)6周齡的SHR腎臟形態(tài)改變并不十分明顯，其腎小球形態(tài)正常，少量腎小管上皮細(xì)胞胞質(zhì)疏松，少量腎小管上皮細(xì)胞脫落入管腔?？赡芘c周齡偏小，尚未出現(xiàn)顯著的腎臟損害有關(guān)。

SHR是公認(rèn)的最接近人類原發(fā)性高血壓的動物模型，SHR 5周齡后收縮壓開始升高，10周后收縮壓水平顯著上升，20周后收縮壓穩(wěn)定在較高水平。為了研究電針對高血壓病前期大鼠的效應(yīng)及其調(diào)節(jié)機(jī)制，故本研究選擇了4～6周齡的SHR大鼠。這與其他關(guān)于高血壓前期的研究類似，Liang等[16]采用了4周齡的SHR大鼠，Kvandova M等[17]研究者采用了5周齡的SHR大鼠。

然而本研究也存在不足，由于經(jīng)費(fèi)有限，本研究觀察了該周齡段大鼠的FoxP3和RORγt的蛋白和mRNA表達(dá)情況，未來可以檢測Treg、Th17細(xì)胞及其相關(guān)炎癥因子的水平；此外，鑒于2周的干預(yù)可能對靶器官損害的改變不明顯，本研究只觀察了干預(yù)結(jié)束時(shí)腎臟組織結(jié)構(gòu)情況，未對干預(yù)前后的腎功能進(jìn)行檢測對比。未來可以增加治療療程及觀察時(shí)點(diǎn)，從而從免疫炎癥角度系統(tǒng)闡述電針對高血壓病前期大鼠的效應(yīng)機(jī)制。