真姬菇液態(tài)發(fā)酵關(guān)鍵影響因素的優(yōu)化

王焱，連潔，王竟夷，廖曉曉，班立桐，王玉

（天津農(nóng)學(xué)院農(nóng)學(xué)與資源環(huán)境學(xué)院，天津 300384）

真姬菇（Hypsizygus marmoreus）又名斑玉蕈、玉蕈、海鮮菇等，屬擔(dān)子菌亞門（Basidiomycotina）層菌綱（Hymenomycetes）傘菌目（Agaricales）白蘑科（Tricholomataceae）玉蕈屬（Hypsizygus），分布于日本、歐洲、北美和西伯利亞地區(qū)[1]。因其外形美觀、質(zhì)地脆嫩、味道鮮美，在日本有“香在松口蘑，味在玉蕈”之美譽(yù)[2]。真姬菇子實(shí)體中蛋白質(zhì)、粗纖維、粗脂肪等含量較高[3]，具有提高免疫力、預(yù)防衰老、抗高血壓、抗癌等功效，是一種可大眾消費(fèi)的高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、低熱量、低脂肪保健食品[4]。

食用菌作為現(xiàn)代農(nóng)業(yè)的重要組成部分，在不斷發(fā)展過(guò)程中，食用菌菌種的制備不斷升級(jí)，食用菌液態(tài)發(fā)酵技術(shù)已在平菇[5]、金針菇[6]、秀珍菇[7]、杏鮑菇[8]等食用菌中廣泛應(yīng)用，具有周期短、適于規(guī)?；?biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)[9]等特點(diǎn)，而目前大部分真姬菇工廠以固體菌種為主，嚴(yán)重影響了制種效率。筆者對(duì)真姬菇液態(tài)發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化，對(duì)全面推進(jìn)食用菌液體菌種規(guī)?；?biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌株。真姬菇LS，由天津農(nóng)學(xué)院食用菌研究中心保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基。斜面培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，蛋白胨5 g/L，MgSO4·7H2O 1 g/L，KH2PO41.5 g/L，VB10.01 g/L，瓊脂20 g/L。種子培養(yǎng)基：葡萄糖10 g/L，磷酸二氫鉀0.5 g/L，硫酸鎂0.5 g/L，VB10.01 g/L，蛋白胨3 g/L。發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米粉30 g/L，酵母膏1.5 g/L，磷酸二氫鉀0.5 g/L，硫酸鎂0.5 g/L，VB10.01 g/L。

1.2 菌種活化與培養(yǎng)

1.2.1 菌種活化。在超凈工作臺(tái)中將真姬菇菌種轉(zhuǎn)接到斜面培養(yǎng)基中，并放置于恒溫培養(yǎng)箱中，25℃條件下培養(yǎng)，活化菌種。

1.2.2 種子液培養(yǎng)?；罨泵娼臃N于250 mL 三角瓶中，25℃，150 r/min 振蕩培養(yǎng)5 d，即為種子液。

1.2.3 液體菌種發(fā)酵。5 L 全自動(dòng)發(fā)酵罐，裝液量3.5 L，接種量3%，25℃培養(yǎng)。

1.3 真姬菇液態(tài)發(fā)酵條件設(shè)計(jì)

1.3.1 不同發(fā)酵方式對(duì)真姬菇菌絲生長(zhǎng)的影響。設(shè)置通氣量為2 L/min，pH 自然，分別采用鼓氣式和轉(zhuǎn)速200 r/min進(jìn)行發(fā)酵，定時(shí)取樣，檢測(cè)液體菌種各項(xiàng)指標(biāo)。

1.3.2 不同pH 對(duì)真姬菇菌絲生長(zhǎng)的影響。分別控制pH為5.0、6.0 和7.0，定時(shí)取樣，檢測(cè)液體菌種各項(xiàng)指標(biāo)。

1.3.3 不同通氣量對(duì)真姬菇菌絲生長(zhǎng)的影響。分別控制發(fā)酵罐通氣量為2、3、4 L/min，定時(shí)取樣，檢測(cè)液體菌種各項(xiàng)指標(biāo)。

1.4 液體菌種生物量的測(cè)定

采用細(xì)胞干重法[10]。將培養(yǎng)皿在80℃烘干至恒重，稱量。吸取10 mL 發(fā)酵液，過(guò)濾后收集菌絲體，用蒸餾水反復(fù)沖洗后，將菌絲體收集于培養(yǎng)皿內(nèi)，80℃烘干至恒重，稱量。此時(shí)培養(yǎng)皿重量差值即為菌絲體生物量（g/L）。

1.5 液體菌種密度（菌絲球數(shù)，mycelium pellet number，MPN）的測(cè)定

吸取1 mL 發(fā)酵液，倒入培養(yǎng)皿中，皿下墊黑色紙方便計(jì)數(shù)，重復(fù)測(cè)量3 次，取平均值（個(gè)/mL）。

1.6 液體菌種萌發(fā)時(shí)間測(cè)量方法

按照“1.1.2”配制萌發(fā)試驗(yàn)固體培養(yǎng)基，從培養(yǎng)液中隨機(jī)夾取5 個(gè)菌絲體接種至萌發(fā)培養(yǎng)基上，接種后將平板倒置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔1 h 觀察1 次，觀測(cè)到其有萌發(fā)現(xiàn)象時(shí)記錄時(shí)間，取平均值即為菌絲體萌發(fā)時(shí)間（h）。

2 結(jié)果與分析

2.1 真姬菇最適發(fā)酵方式研究

在食用菌液態(tài)發(fā)酵中，一般都采用機(jī)械攪拌、鼓氣式2 種發(fā)酵方式。該研究在采用機(jī)械攪拌式發(fā)酵時(shí)發(fā)現(xiàn)，真姬菇的菌絲體非常脆弱，機(jī)械攪拌槳易將其打碎，導(dǎo)致其無(wú)法生長(zhǎng)。因此，該研究均采用鼓氣式發(fā)酵。

菌絲球的生物量和密度直接影響到液體菌種使用時(shí)萌發(fā)點(diǎn)的多少。由圖1 可見，在真姬菇液態(tài)發(fā)酵過(guò)程中，菌絲球生物量、密度和直徑呈現(xiàn)相同的變化趨勢(shì)，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增加后下降。發(fā)酵初期，真姬菇菌絲球直徑迅速增大，而生物量和密度變化較小，進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，菌絲球大量繁殖，生物量值和密度迅速上升，發(fā)酵130 h 時(shí)生物量達(dá)到峰值15 g/L，此時(shí)菌絲球密度70 個(gè)/mL、直徑3 mm，萌發(fā)時(shí)間維持在7 h。之后，由于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消耗，溶氧不足，菌絲球基本停止生長(zhǎng)甚至自溶，生物量、密度都有所下降。

圖1 鼓氣式發(fā)酵下真姬菇液體菌種菌絲球生物量、密度和直徑的變化

2.2 真姬菇液態(tài)發(fā)酵最適pH的研究

pH 會(huì)影響細(xì)胞膜的通透性和結(jié)構(gòu)、鹽的溶解性、物質(zhì)的解離狀態(tài)、不同營(yíng)養(yǎng)物的吸收[11-12]，從而影響細(xì)胞生長(zhǎng)和代謝物的合成。在食用菌液態(tài)發(fā)酵中，細(xì)胞通常會(huì)產(chǎn)生酸性物質(zhì)引起pH 降低。pH 降低嚴(yán)重抑制菌絲生長(zhǎng)，進(jìn)而抑制MPN 積累和提高。因此，通過(guò)控制發(fā)酵過(guò)程的pH，可能會(huì)對(duì)真姬菇液態(tài)發(fā)酵效率的提高具有促進(jìn)作用。

按照“1.3”所述分別控制pH 為5.0、6.0 和7.0 進(jìn)行真姬菇液態(tài)發(fā)酵。由圖2～3 可知，真姬菇液體培養(yǎng)時(shí)，前20 h液體菌種生物量增長(zhǎng)較為平緩，20 h 后生物量迅速上升，呈現(xiàn)先增加后逐漸減少的趨勢(shì)，在第110 h 時(shí)，發(fā)酵液pH=6.0的生物量達(dá)到最大值（1.54 g/L），MPN 達(dá)到87×103/L。在120 h 內(nèi)，隨著pH的增加，菌絲球數(shù)逐漸降低，當(dāng)發(fā)酵液pH 控制在7.0 時(shí)，菌絲球數(shù)增長(zhǎng)趨于平緩，菌種生物量尚未達(dá)到峰值，菌絲生長(zhǎng)受到明顯抑制。而pH 控制在5.0 時(shí)，液體菌種生物量和菌絲球數(shù)與pH=6.0 時(shí)相差不大，但均低于pH=6.0，因此真姬菇菌絲受弱酸性影響較小?？梢姡婕Ч揭簯B(tài)發(fā)酵最適pH 為6.0。

圖2 pH 對(duì)真姬菇液體菌種生物量的影響

2.3 真姬菇液態(tài)發(fā)酵最適通氣量研究

圖3 pH 對(duì)真姬菇液體菌種密度（MPN）的影響

溶解氧影響與微生物呼吸鏈有關(guān)的能量代謝，從而影響微生物生長(zhǎng)；溶解氧直接參與代謝產(chǎn)物的合成[13]。較大的通氣量有助于菌絲生長(zhǎng)，但也會(huì)帶來(lái)較大的剪切力和泡沫增加等問(wèn)題。從液體菌種生物量可直觀看出菌絲的生長(zhǎng)狀態(tài)，此外菌球密度也可以從側(cè)面反映出菌絲體的生長(zhǎng)狀態(tài)。

由圖4～5 可以看出，不同通氣量條件下，真姬菇液體菌種菌球MPN 和菌絲體生物量具有相同的變化趨勢(shì)，菌絲體活力越高，生物量越高，密度越大，均在132 h 左右達(dá)到峰值，其中通氣量為3 L/min 時(shí)生物量最大，為17 g/L，密度達(dá)到165 個(gè)/mL。而通氣量2 L/min 時(shí)，不同發(fā)酵時(shí)間的生物量和MPN 均小于通氣量3、4 L/min，可見，不能滿足真姬菇液態(tài)發(fā)酵的需要。真姬菇菌絲球的萌發(fā)時(shí)間在進(jìn)入對(duì)數(shù)期后均縮短，不同通氣量下的菌絲球萌發(fā)時(shí)間總是在6～7 h 波動(dòng)（圖6）。因此，真姬菇液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)最適通氣量為3 L/min。

圖4 通氣量對(duì)真姬菇液體菌種生物量的影響

圖5 通氣量對(duì)真姬菇液體菌種菌絲球密度的影響

圖6 通氣量對(duì)真姬菇液體菌種萌發(fā)時(shí)間的影響

3 結(jié)論

為獲得菌絲生物量高、密度大、萌發(fā)速度快的真姬菇液體菌種，探討了不同發(fā)酵方式、pH 和通氣量等關(guān)鍵因素對(duì)真姬菇液態(tài)發(fā)酵的影響。試驗(yàn)表明，真姬菇液態(tài)發(fā)酵過(guò)程中，會(huì)代謝產(chǎn)生大量酸性物質(zhì)，導(dǎo)致pH 快速降低，因此菌絲受弱酸性影響較小，可正常生長(zhǎng)，而在中性環(huán)境中菌絲生長(zhǎng)受到抑制，菌球數(shù)及生物量較少；在發(fā)酵前期，通氣量與菌絲球密度和菌絲體生物量具有相同的變化趨勢(shì)，通氣量越大菌絲體活力越高，生物量越高，菌絲球密度越大，但在發(fā)酵后期，過(guò)大的通氣量導(dǎo)致菌絲老化過(guò)快，菌絲球直徑及生物量呈下降趨勢(shì)。因此，pH 和通氣量可被視為影響真姬菇液體菌種發(fā)酵的關(guān)鍵因素。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，在弱酸性條件及通氣量充足的條件下，即pH 控制在6.0、通氣量3 L/min 時(shí)，菌絲長(zhǎng)勢(shì)最好，會(huì)形成較高的菌絲體生物量和密度，為真姬菇液態(tài)發(fā)酵工藝的最優(yōu)條件。