番茄抗斑萎病毒病基因Sw-5的分子標(biāo)記及檢測(cè)

王濤，張子君，張逸鳴，王曉峰，鄒慶道

（遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所，遼寧沈陽(yáng) 110161）

番茄斑萎病毒（TSWV）是一種極具破壞性的農(nóng)作物病毒病原，威脅著全世界的番茄生產(chǎn)。TSWV 是番茄斑萎病毒屬（Tospovirus）的一種RNA 病毒，屬于布尼亞病毒科（Bunyaviridae）。番茄感染TSWV 后莖和葉片發(fā)育不良，葉片呈青銅色、卷曲、出現(xiàn)壞死斑點(diǎn)和條紋，產(chǎn)量也隨之大幅度減少甚至絕收。TSWV的傳播媒介主要是西花薊馬，媒介一旦獲毒便終生帶毒，帶毒的成年薊馬感染一棵健康的植株只需30 min[1-2]。由于TSWV的寄主范圍較廣，包含了84 個(gè)科1 090 種植物[3]，目前還沒(méi)有有效的防控措施。

培育抗病番茄新品種是預(yù)防TSWV 最直接有效的方法，研究者在栽培番茄和野生番茄中均發(fā)現(xiàn)有TSWV的抗源。迄今為止，已報(bào)道的抗病基因有8 個(gè)，包括Sw1a，Sw1b，sw2，sw3，sw4，Sw-5，Sw-6 和Sw-7[4-5]，其中只有在秘魯番茄中發(fā)現(xiàn)的Sw-5 基因廣泛應(yīng)用在番茄育種中。Sw-5對(duì)TSWV的各種小種均表現(xiàn)出較好的抗性，并且對(duì)番茄斑萎病毒屬的其他病毒也具有抵抗作用。攜帶Sw-5的植株可以有效地限制TSWV的擴(kuò)散，僅在局部位置出現(xiàn)輕微過(guò)敏性癥狀。研究者利用RFLP 分子標(biāo)記將Sw-5 定位在第9 染色體臨近端粒區(qū)域的長(zhǎng)臂上，位于標(biāo)記CT71 和CT220 之間[6]。隨后Spassova 等[7]利用圖位克隆法克隆了該基因，Sw-5 和其他許多抗性基因一樣，屬于CC-（NB-ARC）-LRR 結(jié)構(gòu)。此外，研究者還發(fā)現(xiàn)Sw-5 基因有5 個(gè)連鎖的拷貝序列（Sw-5a-Sw-5e），通過(guò)轉(zhuǎn)基因驗(yàn)證，單獨(dú)Sw-5b 同樣具有抗病性。Dianese 等利用Sw-5 序列的一個(gè)InDel 突變，開(kāi)發(fā)出一個(gè)共顯性CAPS 標(biāo)記，該標(biāo)記的擴(kuò)增子包含了Sw-5b 啟動(dòng)子的一段保守序列[8]。Lee 等利用Sw-5b的DNA序列，開(kāi)發(fā)了一個(gè)SNP 標(biāo)記，可以用于鑒定抗感番茄材料[2]。該研究對(duì)獲得的1 個(gè)連鎖標(biāo)記進(jìn)行驗(yàn)證和體系優(yōu)化，建立穩(wěn)定可靠的番茄抗斑萎病毒病基因Sw-5的分子標(biāo)記鑒定技術(shù)體系，為番茄斑萎病毒病抗病育種提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)地概況。試驗(yàn)設(shè)置于遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所沈陽(yáng)試驗(yàn)基地，位于123°55′E、41°82′N(xiāo)，海拔50 m，溫帶半濕潤(rùn)大陸性氣候，全年平均氣溫8.6℃。試驗(yàn)在連棟大棚中進(jìn)行，單棚長(zhǎng)45 m，寬6 m，脊高3.5 m，鋼架結(jié)構(gòu)，棚膜為聚乙烯無(wú)滴膜。大棚內(nèi)土質(zhì)為壤土，肥力均勻，灌溉采用地膜下滴灌。

1.1.2 試驗(yàn)材料及試劑。試驗(yàn)材料為42 份番茄，包括引進(jìn)的抗斑萎病毒病自交系（Sw-5/Sw-5）3 份，分別為RE1、RE2、RE3；遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所番茄課題組培育的自交系（感?。? 份，分別為SU1、SU2、SU3；F1雜交種8 份，均來(lái)自遼寧園藝種苗有限公司，編號(hào)為L(zhǎng)1-L8；F2代單株28 份（L9-L36），為性狀優(yōu)良的抗病F1雜交種（L3）的分離后代。所有供試材料于2020 年3 月播種，4 月底定植于連棟大棚中。

主要試劑包括：500 mmol/L NaOH 溶液，100 mmol/L Tris-HCl 溶液（pH 8.0），10 μmol/L 上下游引物，10×PCR buffer，10 mmol/L dNTP，0.5 U/μL Taq 酶（天根），6×Loading buffer，1×TBE，goodview（賽百盛），瓊脂糖（Biowest）。

1.2 方法

1.2.1 DNA 提取。采用堿解法提取番茄幼苗期葉片DNA，取20 mg 葉片放入2.0 mL 管，加入200 μL NaOH 溶液，在研磨機(jī)上研磨2 min，靜置片刻，13 000 rpm 離心3 min，取上清液轉(zhuǎn)入新的離心管中，加入100 μL Tris-HCl，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物獲得與合成。Sw-5 基因的連鎖分子標(biāo)記按照Dianese 等[8]設(shè)計(jì)的CAPS 標(biāo)記，引物序列（表1）完全按照文獻(xiàn)所提供，并無(wú)改動(dòng)，委托生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行引物合成。

表1 抗病基因的引物序列

1.2.3 PCR 擴(kuò)增體系。通過(guò)體系優(yōu)化，最終確定引物的PCR 反應(yīng)總體系為10 μL，包含DNA 模板2 μL，上下游引物各0.5 μL，10×buffer 1 μL，dNTP 0.25 μL，Taq 酶1U，ddH2O 補(bǔ)足10 μL。PCR 擴(kuò)增在德國(guó)耶拿PCR 儀上進(jìn)行，反應(yīng)程序分為3 步，第1 步：94℃預(yù)變性5 min；第2 步：94℃變性30 s，54.5℃復(fù)性45 s，72℃延伸30 s，35 個(gè)循環(huán)；第3 步：72℃延伸10 min。PCR 產(chǎn)物加入6×Loading buffer，然后在電泳儀上進(jìn)行電泳檢測(cè)。瓊脂糖凝膠的濃度為3%，goodview 染色，固定電壓120V，電泳時(shí)間為20 min，然后將瓊脂糖凝膠取出，在BIO-RAD Gel Doc XR+凝膠成像系統(tǒng)下進(jìn)行拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 Sw-5 連鎖標(biāo)記的獲得

利用特異引物首先對(duì)3 份抗病材料和3 份感病材料進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，從圖1 可以看出，3 份抗病材料RE1、RE2、RE3 均擴(kuò)增出574 bp的特異條帶，3 份感病材料SU1、SU2、SU3 均擴(kuò)增出464 bp的條帶。說(shuō)明該標(biāo)記為共顯性標(biāo)記，含有Sw-5 基因的抗病番茄可以擴(kuò)增出574 bp的條帶，不含有Sw-5 基因的感病番茄可以擴(kuò)增出464 bp的條帶。

圖1 3 份抗病和3 份感病材料的PCR 擴(kuò)增

2.2 F1 雜交種的PCR 檢測(cè)

利用特異引物對(duì)8 份F1雜交種進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，結(jié)果顯示，5 份番茄擴(kuò)增出574 bp 和464 bp 兩條帶，分別為L(zhǎng)1、L3、L4、L5 和L6，說(shuō)明這些材料攜帶有雜合抗病基因（Sw-5/sw-5），L8 擴(kuò)增出574 bp 一條帶，說(shuō)明該材料攜帶純合抗病基因（Sw-5/Sw-5），L2 和L7 擴(kuò)增出464 bp 一條帶，說(shuō)明這2 份材料不含有Sw-5 基因。

圖2 8 份F1 材料的PCR 擴(kuò)增

圖3 28 份F2 材料的PCR 擴(kuò)增

2.3 分離材料的PCR 檢測(cè)

對(duì)28 份F2代分離材料進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示，共獲得抗病材料20 份，其中有6 份（L14、L15、L19、L20、L21 和L25）擴(kuò)增出574 bp 特異性條帶，為純合抗病材料；有14份（L9、L12、L16、L18、L23、L24、L26、L29、L30、L31、L32、L33、L34 和L36）擴(kuò)增出574 bp 和464 bp 兩條帶，為雜合抗病材料。其余8 份不含Sw-5 抗病基因。

3 討論

將Sw-5 基因的連鎖分子標(biāo)記應(yīng)用在育種實(shí)踐中，將極大地提高抗TSWV 番茄試材的鑒定效率，對(duì)于番茄育種材料的遺傳改良和新品種培育都具有重要價(jià)值。隨著Sw-5 基因的克隆，研究者開(kāi)發(fā)了一些該基因的分子標(biāo)記。Shi 等[9]根據(jù)Sw-5的DNA 序列開(kāi)發(fā)了一個(gè)功能性標(biāo)記，該標(biāo)記為顯性標(biāo)記，無(wú)法區(qū)分雜合個(gè)體。Lee 等[2]等根據(jù)一個(gè)SNP 突變，設(shè)計(jì)了一對(duì)SNP 引物，通過(guò)高效溶解曲線可以鑒定抗感番茄材料，然而該方法需要熒光定量PCR，對(duì)實(shí)驗(yàn)條件要求較高，且藥品費(fèi)用昂貴。該文選擇了一個(gè)共顯性SCAR 標(biāo)記，通過(guò)驗(yàn)證，真實(shí)可靠，可以在抗病和感病番茄材料中擴(kuò)增出清晰的特異性條帶，且長(zhǎng)度差異明顯，很容易區(qū)分抗感帶型。SCAR 標(biāo)記操作簡(jiǎn)單，不需要酶切等其他試驗(yàn)操作，技術(shù)成熟且費(fèi)用低，因此該標(biāo)記完全可用于番茄抗TSWV 育種材料的鑒定和篩選。

根據(jù)Dianese 等[8]報(bào)道，該SCAR 標(biāo)記可以在含有Sw-5基因的番茄材料上擴(kuò)增出574 bp 條帶，不含Sw-5 基因的材料上擴(kuò)增出510 bp 或464 bp 條帶。該文未擴(kuò)增出510 bp 條帶，其原因可能是該研究選擇的番茄材料有限，未能覆蓋該標(biāo)記的所有等位基因。

該文對(duì)市場(chǎng)上購(gòu)買(mǎi)的8 份抗TSWV 雜交種進(jìn)行PCR檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其中6 份與預(yù)期結(jié)果一致，其余2 份并未檢測(cè)出Sw-5 基因，這2 份材料可能含有其他抗TSWV 基因，或者植株長(zhǎng)勢(shì)較強(qiáng)，對(duì)TSWV 具有一定的耐性。該研究從28份分離材料中篩選出20 份含有Sw-5 基因的單株，通過(guò)田間自然發(fā)病，這些單株均表現(xiàn)出較好的抗病性，然而這些材料的其他農(nóng)藝性狀不是十分理想，例如果實(shí)偏小，不抗其他病害等。因此需要擴(kuò)大番茄材料的篩選范圍，同時(shí)利用上述SCAR 標(biāo)記輔助選擇，進(jìn)行回交轉(zhuǎn)育，將Sw-5 基因?qū)氲骄C合性狀優(yōu)良的核心育種系中，為培育品質(zhì)優(yōu)良多抗的番茄新品種奠定基礎(chǔ)。