肌聯(lián)蛋白titin介導抗阻和有氧運動對糖尿病性心肌舒張功能障礙的不同影響

李順昌 ，高德潤 ，Ismail Laher，蘇全生

糖尿病患者半數(shù)以上的致病/致死原因都與其心血管并發(fā)癥有關（Rydén et al.，2013），且長期服用調(diào)節(jié)血糖代謝藥物可進一步增加心血管疾病的風險，這可能與特定藥物的直接副作用或改變機體代謝（通常是低血糖）引起的間接副作用有關（Triggle et al.，2014）。因此，即使接受正規(guī)專業(yè)治療，糖尿病患者心血管疾病患病風險仍大大增加。大量研究證實，糖尿病患者早期心肌功能已出現(xiàn)明顯損傷，且主要以舒張功能減弱為主，收縮功能往往表現(xiàn)為正常（Brunvand et al.，2016；Goyal et al.，2013；Maximilian et al.，2016；Schannwell et al.，2002；Yilmaz et al.，2015）。肌聯(lián)蛋白（titin）是從Z盤至M線貫穿半個肌節(jié)的巨大蛋白，提供彈簧樣回彈作用，使肌節(jié)在收縮后恢復至初始長度，保證肌節(jié)內(nèi)張力傳遞（Lewinter et al.，2014）。有研究指出，titin蛋白表達減少是糖尿病心肌病發(fā)生的主要原因之一（Hsu et al.，1997）。

運動療法是糖尿病臨床治療策略的重要組成部分。運動可明顯降低糖尿病患者心肌細胞內(nèi)脂質(zhì)含量，上調(diào)肌漿網(wǎng)鈣調(diào)蛋白，減輕心肌細胞凋亡，改善氧化應激反應，維持心肌正常的結構和功能（Li et al.，2015，2016）。不同運動方式對心臟施加的刺激不同。根據(jù)摩根羅斯理論，有氧運動導致外周血管阻力進行性下降和靜脈回心血量增加，出現(xiàn)明顯的容量過載，左心室舒張末期容積增加而表現(xiàn)為心肌“前負荷”增加；抗阻運動導致外周血管阻力短時間內(nèi)急劇增加，出現(xiàn)明顯的壓力過載而表現(xiàn)為“后負荷”增加（D’Andrea et al.，2015；Morganroth et al.，1975）。據(jù)此我們推測，抗阻和有氧運動對糖尿病性心肌舒張功能障礙的影響可能會表現(xiàn)出明顯差異。因此，本研究在建立糖尿病大鼠心肌舒張功能障礙模型的基礎上，對比抗阻和有氧運動對心肌舒張功能的不同影響，探討肌聯(lián)蛋白titin在不同運動干預心肌功能中的作用。

1 研究對象與方法

1.1 研究對象

雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠80只（6周齡，體質(zhì)量200～220 g，SPF級），由成都達碩實驗動物有限公司提供，飼養(yǎng)于成都體育學院運動醫(yī)學與健康研究所動物房，標準嚙齒目動物飼養(yǎng)籠分籠飼養(yǎng)，飲食飲水自由攝取，控制室溫21℃～23℃，相對濕度40%～60%，12：12 h明暗循環(huán)，并保證良好通風。動物飼養(yǎng)及處理方案經(jīng)成都體育學院實驗動物倫理委員會審核通過。

1.2 動物模型及運動干預方案

1.2.1 動物造模及分組

SD大鼠隨機分為預對照組（pre-Control，pC；n=30）和預模型組（pre-Diabetes，pD；n=50）。pC組喂食普通嚙齒類實驗動物飼料。參照Stalin等（2016）研究，pD組喂食高糖高脂飼料，第8周尾靜脈取血測試空腹血糖（FBG）和胰島素（FINS）判斷胰島素抵抗情況，隨后對胰島素抵抗大鼠進行小劑量鏈脲佐菌素（STZ，30 m/kg）腹腔注射，并于72 h后尾靜脈取血測試非禁食血糖，參照2型糖尿病大鼠模型常用判斷指標“胰島素抵抗基礎上血糖≥16.7 mmolL”（Elias et al.，1994），成功造模2型糖尿病大鼠36只。pC組大鼠于相同時間進行相同劑量枸櫞酸緩沖液腹腔注射。

造模成功后，從pD組中選取30只糖尿病大鼠隨機分為糖尿病模型組（Diabetic control，D，n=10）、糖尿病有氧干預組（Diabetic aerobic exercised，DA，n=10）和糖尿病抗阻運動干預組（Diabetic resistance exercised，DR，n=10）。pC組隨機分為空白對照組（Control，C，n=10）、有氧運動對照組（Control aerobic exercised，A，n=10）、抗阻運動對照組（Control resistance exercised，R，n=10）。

1.2.2 實驗動物飼料

普通飼料：5%脂肪、50%碳水化合物和23%蛋白質(zhì)，總能量約為3 000 kcal/kg；高脂高糖大鼠飼料：67%基礎飼料、10%豬油、20%蔗糖、2%膽固醇和1%膽酸鈉，總能量約為 6 000 kcal/kg（Epp et al.，2013）。飼料均由成都達碩實驗動物有限公司提供。

1.2.3 運動干預方案

有氧運動方案：小動物電動跑臺（DSPT-208，杭州段氏）用于大鼠有氧運動訓練。參照Bedford運動模型（Bedford et al.，1979），適應性運動3天后，A和DA組大鼠以20 m/min（60%～70%V.O2max）、60 min/天、5 天/周進行訓練，共8周。運動過程中使用電刺激和毛刷刺激大鼠尾部以維持其運動。

抗阻運動方案：小動物爬梯（成都體育學院運動醫(yī)學與健康研究所自制）用于大鼠抗阻運動訓練。爬梯高1 m，每級階梯間隔2 cm，訓練時傾斜85°放置。適應性無負重爬梯訓練3天，必要時使用毛刷刺激大鼠尾部以促使其運動。正式訓練前測試最大負重（1 RM）：參照Hornerberger大鼠抗阻模型（Hornberger et al.，2004），R 和 DR組大鼠最初以尾部負重75%體質(zhì)量爬梯，后每次增加30 g負重直至完全不能或不能完全完成爬梯，每周重新測試1 RM。正式抗阻訓練時，大鼠被置于爬梯底部，尾部分別負重50%、75%、90%、100%1 RM，每一個負重級別爬行3次，100%1 RM負重時，如不能完成3次者以實際運動能力為限（≤3次），到達頂部后休息2 min重復上述運動，5天/周，共訓練8周。

1.3 指標采集與檢測分析

1.3.1 血流動力學指標

1.3.1.1 麻醉和手術

戊巴比妥鈉（1%，65 mg/kg）腹腔注射麻醉后，大鼠仰臥位固定于恒溫手術臺上，備皮，沿頸部皮膚正中線切開5～7 cm，鈍性分離，暴露右側頸動脈2～3 cm，穿雙線備用。結扎頸總動脈遠心端，用動脈夾夾閉近心端。在結扎處用眼科剪斜剪一個朝向心臟方向的V形切口，觸摸大鼠胸前心尖波動最明顯處，測量此點與右頸總動脈V形切口之間的距離，并在EP50導管上標記相應的距離，以便確定推進導管的最大深度。導管內(nèi)灌注肝素（5 u/ml），排盡氣泡，連接壓力換能器，信號輸入PowerLab數(shù)據(jù)采集和分析系統(tǒng)。

1.3.1.2 插管和數(shù)據(jù)采集

導管從右頸總動脈切口沿向心方向緩緩插入，松開動脈夾后出現(xiàn)動脈波；緩緩推動導管并密切觀察電腦上顯示的動脈壓波形，當插管進至主動脈瓣開口時，可以感覺到明顯的阻力，在心臟收縮瞬間旋轉導管進入左心室，體會明顯的“落空感”，出現(xiàn)特征性左心室壓力波形；近心端備用線打結固定導管。心臟血流動力學指標通過AD Labchart數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)進行采集、處理和分析。

1.3.2 免疫熒光

剪取約3 mm×3 mm×5 mm大小的左室心肌，平整放入已加一半OCT的包埋盒中，整理肌纖維走向、形狀及位置，其上用OCT填滿包埋盒，放入冰箱內(nèi)冷凍，待OCT凝固后放入液氮內(nèi)速凍。常規(guī)冰凍切片，95%酒精后固定，將切片置于封閉液中，室溫1 h；用PBST按1：200稀釋titin抗體（9D10，Hybridoma Bank），4℃孵育過夜。PBS清洗3次，每次10 min；用PBST按1：1 000稀釋二抗（FITC-conjugated IgG 1：400，Rockland），室溫避光孵育 1～2 h；PBS清洗3次，每次10 min。倒置熒光顯微鏡（BS53，Olympus）下觀察采圖，結果圖形應用Image Pro Plus Version 6.0圖像分析軟件測量分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所用數(shù)據(jù)均以平均值±標準差（M±SD）表示。數(shù)據(jù)統(tǒng)計使用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件包和Graphpad Prism 6進行處理。各組間比較采用雙因素方差（Two-way ANOVA）分析，用Tukey法進行各組均值多重比較。顯著性差異標準P＜0.05，非常顯著性差異標準P＜0.01。

2 結果

2.1 血糖、胰島素和胰島素抵抗指數(shù)

與C組比較，A組大鼠體質(zhì)量雖略有下降但無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；R組則明顯高于C組（P＜0.05）；D組體質(zhì)量出現(xiàn)明顯下降（P＜0.01），DA和DR組大鼠體質(zhì)量較D組均明顯升高（P＜0.05），但兩組之間無統(tǒng)計學差異（P＞0.05；圖1）。

圖1 8周抗阻和有氧運動干預后各組大鼠體質(zhì)量（A）、空腹血糖（B）、血胰島素（C）和胰島素抵抗指數(shù)（D）變化情況Figure 1. Body Weight（A），F(xiàn)asting blood Glucose（B），F(xiàn)asting Insulin（C）and HOMA-IR（D）after 8 Weeks ofAerobic and Resistance Exercise

C、A、R各組大鼠間血糖、胰島素和胰島素抵抗指數(shù)均無明顯差異（P＞0.05）；D組血糖升高非常明顯（P＜0.01），胰島素水平明顯下降（P＜0.01），胰島素抵抗指數(shù)大幅升高（P＜0.01）；與D組相比，DA和DR組大鼠胰島素水平明顯升高（P＜0.05），空腹血糖和胰島素抵抗指數(shù)均顯著降低（P＜0.05），且DR組大鼠空腹血糖下降幅度明顯大于DA組（P＜0.05；圖1）。

2.2 心臟功能

心肌收縮功能相關指標中，左心室內(nèi)壓最大上升速率（Max dp/dt），C、A、D、DA和DR各組大鼠之間無顯著性差異（P＞0.05），R組較 C組有明顯升高（P＜0.01；圖2）。

心肌舒張功能相關指標中，與C組相比，A組大鼠左心室舒張末壓（LVEDP）明顯下降（P＜0.05）；D組左心室松弛時間常數(shù)（Tau）和LVEDP均明顯增大（P＜0.01），左心室內(nèi)壓最大下降速率（Min dp/dt）顯著下降（P＜0.01）（圖2）。與D組相比，DA組大鼠LVEDP明顯升高（P＜0.05），Tau值明顯減?。≒＜0.05），已接近C組（P＞0.05）；而DR組LVEDP與D組近似（P＞0.05），其明顯低于DA 組大鼠（P＜0.05；圖2）。

圖2 8周抗阻和有氧運動干預后各組大鼠心肌舒縮功能相關指標的變化情況Figure 2. Cardiac Function after 8 Weeks ofAerobic and Resistance Exercise

2.3 心肌肌聯(lián)蛋白titin表達情況

Titin主要分布在肌纖維中，呈現(xiàn)出明暗相間的橫紋。C組大鼠左室心肌titin以規(guī)律的明暗相間橫紋分布于整個肌纖維，橫紋清晰，熒光著色較深；A、R組和C組基本相似，橫紋結構清晰，熒光染色較淡；D組大鼠心肌titin熒光染色變淡現(xiàn)象明顯增多，有些部位出現(xiàn)明顯的缺染現(xiàn)象；DA組大鼠心肌titin缺染區(qū)域明顯減少，染色深度較強，橫紋結構清晰可見；DR組大鼠心肌titin缺染最為嚴重，橫紋結構也較模糊（圖3）。

圖3 8周抗阻和有氧運動干預后各組大鼠心肌titin免疫熒光標記情況（比例尺=50 μm）Figure 3. Immunofluorescence of Titin after 8 Weeks ofAerobic and Resistance Exercise（Scale bar=50 μm）

Titin蛋白經(jīng)免疫熒光染色，倒置熒光顯微鏡采圖后，用Image Pro Plus 6.0圖像軟件進行處理分析（圖4）。與C組相比，A組大鼠心肌titin平均熒光強度（OD值）未表現(xiàn)出明顯差異（P＞0.05），而R組OD值下降明顯（P＜0.05），D組OD值也出現(xiàn)非常顯著性下降（P＜0.01）。與D組相比，DA組大鼠心肌titin OD值明顯上升（P＜0.05），已接近正常水平（P＞0.05 vs C），DR組OD值卻出現(xiàn)進一步下降（P＜0.05）。

圖4 8周抗阻和有氧運動干預后各組大鼠心肌titin平均熒光強度（OD）值Figure 4. Average Titin Fluorescence Intensity Values after 8 Weeks ofAerobic and Resistance Exercise

3 討論

糖尿病運動干預研究的重要前提是建立科學合理的2型糖尿病動物模型。目前，糖尿病動物模型主要有自發(fā)性糖尿病動物模型、轉基因糖尿病動物模型和誘發(fā)性糖尿病動物模型3類（Amin et al.，2016）。其中，誘發(fā)性糖尿病動物模型是通過特定致病因素人為誘發(fā)具有糖尿病特征的動物模型，方法簡便、可重復，并可在短期內(nèi)誘導出大量模型。本研究對8周齡雄性SD大鼠喂養(yǎng)高糖高脂飼料7周后，尾靜脈采血測試空腹血糖、胰島素并計算穩(wěn)態(tài)胰島素抵抗評價指數(shù)發(fā)現(xiàn)，預造模組大鼠空腹血糖和胰島素明顯升高，胰島素抵抗指數(shù)大幅提高。提示，7周高糖高脂飲食誘發(fā)了明顯的胰島素抵抗。第8周預造模組大鼠進行一次小劑量STZ（30 mg/kg）腹腔注射，觀察72 h，尾靜脈取血測試非禁食血糖，參照2型糖尿病大鼠模型常用判斷指標“胰島素抵抗基礎上血糖≥16.7 mmol/L（Elias et al.，1994）”，結合大鼠體質(zhì)量下降和“多飲、多食、多尿”等典型糖尿病臨床癥狀，將血糖值≥16.7 mmol/L的預造模組大鼠確定為造模成功。本研究建立的糖尿病動物模型成功率為72%。

糖尿病性心臟病的病理發(fā)展大概分為兩個階段：第1階段是心肌對糖尿病代謝改變的短暫生理適應期；第2階段是心肌無法修復而最終積累產(chǎn)生不可逆的病理性重構（Fang et al.，2004）。有研究報道，STZ靜脈注射誘發(fā)的糖尿病大鼠在6～14周出現(xiàn)明顯的心功能改變，且心肌功能的損傷以舒張功能減低出現(xiàn)最早（Thompson，1988）。一項以40名糖尿病患者為研究對象的研究發(fā)現(xiàn)，所有患者收縮功能指標均正常，但在沒有心血管疾病的情況下卻表現(xiàn)出舒張功能受損（Astorri et al.，1997）。Boyer等（2004）也提出，47%血糖控制良好的2型糖尿病患者仍存在不同程度的左室舒張功能障礙。本研究采用經(jīng)右頸動脈行左心室插管術評價大鼠心臟血流動力學的變化，結果顯示，糖尿病8周大鼠的左心室內(nèi)壓最大上升速率（Max dp/dt）無明顯變化，而左心室舒張末壓（LVEDP）明顯增大，左心室松弛時間常數(shù)（Tau）顯著延長，左心室內(nèi)壓最大下降速率（Min dp/dt）顯著下降，證實了糖尿病8周大鼠左心室收縮功能正常，舒張功能障礙。需要特別指出的是，Tau與心肌順應性密切有關，其值越大，心肌順應性越差。糖尿病大鼠Tau明顯升高，提示左心室心肌順應性明顯下降。

運動可明顯改善糖尿病心臟功能的異常（Kristian et al.，2018；Larsson et al.，2018）。Lahaye等（2014）發(fā)現(xiàn)，運動對糖尿病心肌的保護作用與運動負荷密切相關。因?qū)π呐K刺激的不同，抗阻和有氧運動對糖尿病心臟功能的影響應表現(xiàn)出差異。本研究運用在體心臟插管檢測血流動力學相關指標，結果顯示，有氧運動可使糖尿病大鼠LVEDP明顯減小，Min dp/dt增加，且Tau顯著縮短至趨于正常。提示，有氧運動可延緩糖尿病大鼠早期心肌順應性下降，維持正常的心臟舒張功能?？棺柽\動干預未表現(xiàn)出明顯的保護作用，相反，LVEDP增大、Min dp/dt下降都有加重趨勢，且Tau值明顯大于糖尿病組。提示，抗阻運動使糖尿病早期大鼠心肌順應性進一步減弱，從而加重左室舒張功能障礙。

肌聯(lián)蛋白titin是維持心肌細胞張力的重要結構蛋白。研究表明，titin蛋白表達下降是心肌被動張力減弱的主要原因，各種生理和病理性因素可通過調(diào)節(jié)titin蛋白表達對心臟舒張功能起到急性或慢性的調(diào)整作用（Martina et al.，2009；Nagueh et al.，2004；Warren et al.，2003；Wu et al.，2002；Yamasaki et al.，2002）。近年來，隨著生物實驗技術的不斷發(fā)展，titin改變在心臟舒張功能障礙中的作用引起研究者的關注，成為相關研究領域的一個熱點。在擴張性心肌病、缺血性心臟病和高血壓性心肌病中均已發(fā)現(xiàn)titin的改變（Nagueh et al.，2004；Neagoe et al.，2002；Warren et al.，2003；Wu et al.，2002），但 titin在糖尿病早期心臟舒張功能障礙中的作用的研究相對較少。Hsu等（1997）發(fā)現(xiàn)，2型糖尿病大鼠心臟出現(xiàn)舒張功能障礙時，titin蛋白表達下降；但Lehti等（2007）卻提出，早期的1型糖尿病小鼠心肌細胞titin基因表達量無改變。本研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病大鼠心肌titin熒光染色變淡現(xiàn)象明顯增多，有些部位出現(xiàn)明顯的缺染現(xiàn)象；進一步分析心肌titin平均熒光強度后發(fā)現(xiàn)，糖尿病大鼠心肌titin蛋白表達明顯下降，證實糖尿病伴隨著心肌titin蛋白表達下降?？赡軝C制是：糖尿病的高血糖高血脂等病理因素誘發(fā)自由基增多、氧化應激等，導致心肌細胞凋亡和壞死，肌纖維局灶性溶解，titin作為連接Z線和M盤的模板蛋白結構出現(xiàn)相應損傷。有氧運動干預后，糖尿病大鼠心肌titin熒光缺染現(xiàn)象明顯好轉，平均熒光強度明顯增高，而抗阻運動干預后，熒光缺染現(xiàn)象并未出現(xiàn)改善，且平均熒光強度有下降趨勢?？赡茉蚴牵河醒踹\動使機體血液循環(huán)加快，遠端毛細血管擴張，外周阻力下降，回心血量增加，心肌擴張幅度和強度增大，對骨架蛋白titin的刺激明顯，因而出現(xiàn)明顯的適應性改變；而抗阻運動由于肌肉持續(xù)性收縮導致外周阻力急劇增加，加大了心臟泵血的難度和工作量，長期的超負荷加上糖尿病高血糖、高血脂等的聯(lián)合作用，最終導致心肌纖維包括titin受損。

4 結論

有氧運動改善糖尿病性心肌舒張功能障礙的效果明顯優(yōu)于抗阻運動，可能與兩種運動方式對心肌肌聯(lián)蛋白titin表達的不同影響有關。