間歇低氧與間歇運動對心梗大鼠心肌HIF-1α、miR-126表達及血管新生影響的對比研究

宋 偉，田振軍

有研究顯示，造成全球人口“壽命損失”的前五大影響因素中心血管疾病是首因（Murray et al.，2015）。2020年，我國擁有心血管患病人數(shù)約3.3億，心血管病死亡占城鄉(xiāng)居民總死亡原因的首位，農(nóng)村為46.66%，城市為43.81%。（《中國心血管健康與疾病報告2020》編寫組，2021）?，F(xiàn)階段盡管臨床藥物及介入治療取得較大進展，但心肌梗死（myocardial infarction，MI）仍然是導致心血管病患者發(fā)病和死亡的主要病因（Rosamond et al.，2008）。目前，心臟康復作為心肌梗死后治療的最后一環(huán)，對于降低患者死亡率，提高患者生存質(zhì)量意義重大。因此，心梗病人心臟康復手段的選擇也一直是學者關(guān)注的熱點。

低氧適應(yīng)可以增加心臟的缺血耐受，故被認為是一種有效的保護手段。Mortimer等（1977）研究發(fā)現(xiàn)，高原地區(qū)生活的居民心肌梗死的發(fā)病率和死亡率要低于平原地區(qū)居民。間歇性低氧（intermittent hypoxia，IH）是指人或動物在一段時間多次交替進入低氧和常氧環(huán)境的過程（Navarrete-opazo et al.，2014）。已有文獻表明，合理的IH適應(yīng)可以增加心臟的缺氧耐受，緩解心臟缺血損傷帶來的多種臨床表現(xiàn)，如梗死面積、缺血后的心肌收縮紊亂以及心律失常等，具有明顯的心臟保護作用（Akat et al.，2018；Lien et al.，2018）。運動被認為是心臟康復的主要手段，已有文獻報道間歇運動（interval training，IT）在改善左心室泵血功能、提高心?；颊遃˙O2max（Ulbrich et al.，2016）、增加患者運動耐受等方面優(yōu)于傳統(tǒng)的持續(xù)運動（Warburton et al.，2005）。IH和IT作為天然的非藥物性心臟康復手段（Alánová et al.，2017），同時具有方法簡便、易于應(yīng)用且無明顯副作用的優(yōu)點，但鮮見對于兩者在改善心梗心功能方面的對比研究。

缺血是激發(fā)心肌梗死自我保護機制的誘因，以血管新生為基礎(chǔ)的側(cè)枝循環(huán)形成是心肌梗死早期修復的關(guān)鍵。文獻表明，多個microRNA（miRNA）參與了心肌梗死后血管新生的調(diào)控過程（Saif et al.，2014），其中，較為熟知的是miR-126。前期研究發(fā)現(xiàn)，間歇運動可顯著上調(diào)心梗心臟miR-126，抑制其下游靶蛋白PIK3R2/SPRED1表達，促進心臟梗死邊緣區(qū)血管新生，產(chǎn)生心臟保護效應(yīng)（宋偉等，2017）。但是對于運動上調(diào)miR-126表達的具體機制尚未完全闡明。缺氧誘導因子1（HIF-1）是一個關(guān)鍵核轉(zhuǎn)錄因子，其生理功能主要取決于HIF-1α亞基，通過調(diào)控下游基因表達可以促進缺血心肌的血管新生（Pugh et al.，2003）。運動和低氧都可以引起HIF-1α升高（李鐵瑛等，2018），但鮮見HIF-1α的表達與miR-126上調(diào)關(guān)聯(lián)的研究。本研究對比IH和IT對MI大鼠心功能的改善，并探討HIF-1α和miR-126之間的關(guān)系，進一步揭示運動及低氧改善MI心功能的可能機制。

1 研究對象與方法

1.1 實驗動物分組與MI模型制備

雄性3月齡SD大鼠40只（西安交通大學醫(yī)學院實驗動物中心提供，動物合格證號：SCXK2012-201），標準嚙齒類動物干燥飼料分籠飼養(yǎng)，自由飲食。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機選取8只大鼠為假手術(shù)組，剩余32只采用左冠狀動脈前降支（left coronary artery descending，LAD）結(jié)扎法制備MI模型，術(shù)后存活30只，隨機分為假心梗組（S）、心梗組（MI）、心梗＋間歇低氧組（MIH）、心梗＋間歇運動組（MIE）（圖 1）。

圖1 實驗動物分組Figure 1. ExperimentalAnimal Programs

MI模型制備：大鼠稱重，腹腔麻醉（戊巴比妥鈉30 mg/kg），呼吸機（AL-V8）連接人工面罩輔助呼吸，肢體導聯(lián)監(jiān)測心電圖（Powerlab/8ST生物信號采集處理系統(tǒng)）。開胸，暴露心臟，體視顯微鏡（SZX16 OLMPUS）下采用3/8曲形圓體縫合針在左心耳和肺動脈圓錐交界處下緣2 mm處進針，肺動脈圓錐旁出針，進針深度為0.3～0.5 mm，出針后采用5-0絲線進行縫扎，肉眼可見結(jié)扎遠端心肌顏色變淺或變白，心電圖ST段抬高或T波倒置為結(jié)扎成功標志，探查無出血后留管逐層關(guān)胸并排氣。假手術(shù)組僅穿線不結(jié)扎。

1.2 IH與IT方案

IH方案：參考Manukhina等（2013）方案，MIH組大鼠于術(shù)后1周放入低氧帳篷（HYP-123，Hypoxic training system，USA）中（表1），氧濃度儀全程監(jiān)測氧氣濃度，其余各組吸入氣中氧濃度分數(shù)（fraction of inspiration O2，F(xiàn)IO2）為21%，即處于常氧環(huán)境。

表1 大鼠間歇低氧干預方案Table 1 Interittent Hypoxia Conditioning Program

IT方案（Moreira et al.，2013）：MIE組大鼠術(shù)后1周開始跑臺適應(yīng)性訓練（15 m/min，30 min/天×5天），適應(yīng)性訓練1周后進入正式訓練。方案：10 m/min×10 min熱身，之后以 25 m/min×4 min（85%～90%V˙O2max）和 15 m/min×3 min（50%～60%V˙O2max）依次交替運動7輪，最后以10 m/min速度運動1 min，運動總時間為60 min，每周5天，正式訓練時間為4周。

1.3 細胞培養(yǎng)及低氧處理

人臍靜脈內(nèi)皮細胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）由中國人民解放軍空軍軍醫(yī)大學惠贈。高糖DMEM（Gibco）添加10%的新生小牛血清（Invitrogen Life Technologies）和1%的青霉素-鏈霉素在二氧化碳培養(yǎng)箱（371，Thermo Fisher Scientific）中常規(guī)培養(yǎng)（37℃，5%CO2，21%O2），隔天換液，3～4天傳代1次。待細胞處于對數(shù)生長期時，置于三氣培養(yǎng)箱內(nèi)（3131，Thermo Fisher Scientific）分別培養(yǎng)1 h、2 h、3 h、4 h、6 h、8 h、12 h、24 h，低氧方案為1%O2、5%CO2和94%N2（王授銜等，2017）。

1.4 心功能測定及樣品處理

4周訓練結(jié)束次日，腹腔麻醉，導管經(jīng)右頸總動脈逆行送入左心室，待所記錄的壓強波形穩(wěn)定后，采用Powerlab/8ST生物信號采集處理系統(tǒng)記錄左室收縮壓（left ventricular systolic pressure，LVSP）、左室舒張末壓（left ventricular end-diastolic pressure，LVEDP）、左室壓力最大上升和最大下降速率（±dp/dtmax）等指標。心功能測試完畢立即開胸，摘取心臟，稱重，部分甲醛固定用于組織學實驗，剩余速入液氮，24 h后移入超低溫冰箱（Thermo Scientific）用于分子生物學實驗。剝?nèi)〈笫笥覀?cè)脛骨，游標卡尺測量脛骨長度，計算心臟重量與脛骨長度比值（HW/TL）。

1.5 實驗方法、儀器和試劑

1.5.1 Masson染色

甲醛固定標本48 h后，常規(guī)石蠟包埋（BMII型病理組織包埋機），連續(xù)切片（5 μm，LEICA RM2126切片機），常規(guī)Masson染色結(jié)束后，測量染色切片心肌膠原容積分數(shù)（collagen volume fraction，CVF），CVF=膠原面積/心肌組織總面積×100%。

1.5.2 Westren Blot

取心梗邊緣區(qū)心肌組織或HUVECs加入預冷蛋白抽提試劑，勻漿，4℃離心取上清，BCA法測定蛋白濃度并定量（Bio Tek Epoch）。常規(guī)制膠、上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜，3%BSA室溫封閉 1 h，孵育一抗 HIF-1α（1∶800，Abcam）、Ets-2（1∶1 000，GeneTex）、VEGF（1∶800，Proteintech），4 ℃過夜。次日復溫30 min，回收一抗，TBST清洗，二抗（1∶10 000）室溫孵育1 h，洗二抗，ECL發(fā)光，凝膠成像系統(tǒng)（全能型Bio-Rad Chemidoc MP）成像，內(nèi)部參照為GAPDH。

1.5.3 RT-qPCR

常規(guī)Trizol試劑盒提取心梗邊緣區(qū)心肌組織或HUVECs總RNA，嚴格按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（miScript II RT Kit，Qiagen）操作步驟在實時熒光定量PCR儀（Bio Rad CFX96）獲得cDNA產(chǎn)物，20 μl體系進行RT-qPCR反應(yīng)，內(nèi)部參照為U6。rno-miR-126基因上游引物序列為GGCATTACTTTTGGTACGCGAAA。U6上下游引物及miR-126下游引物皆為 Qiagen提供，退火溫度為 70 ℃。比較 Ct法（2-ΔΔCT）計算miR-126相對表達量。

1.5.4 免疫熒光組織化學染色

切片脫蠟至水，抗原修復，小鼠單克隆抗增殖細胞核抗原抗體（PCNA，1∶50，CST）和兔多克隆von Willebrand因子抗體（vWF，1∶400，Abcam）共同孵育4℃過夜。復溫45 min，PBS洗滌后滴加FITC/TRITC標記的山羊抗兔/小鼠IgG二抗（1∶100，Jackson Immuno Research）和 DAPI（1∶800，Sigma），37℃孵育1 h。免疫熒光染色圖像由全自動倒置熒光顯微鏡（蔡司，Axio Observer.Z1）獲得。

1.6 數(shù)據(jù)處理

Masson染色切片經(jīng)光鏡觀察、拍照（BX51 OLYM-PUS），Image Pro-plus 6.0軟件進行CVF測量；Western Blot實驗結(jié)果采用Adobe Photoshop CS6和Image J軟件處理；使用SPSS 17.0軟件包對數(shù)據(jù)進行one-way ANOVA分析；所有數(shù)據(jù)經(jīng)GraphPad Prism 5.0 Demo軟件轉(zhuǎn)換作圖。實驗結(jié)果用平均數(shù)±標準差（M±SD）表示，顯著性差異選擇P＜0.05和P＜0.01水平。

2 結(jié)果

2.1 心臟質(zhì)量、心脛比及心功能檢測

心臟質(zhì)量及心脛比結(jié)果顯示，與S組相比，MI組和MIE組心臟質(zhì)量（HW）均顯著性升高（P＜0.05，P＜0.01）；與MI組相比，MIH組HW顯著性下降（P＜0.05）；與MIH組相比，MIE組HW顯著性升高（P＜0.01）。各組心脛比（HW/TL）變化與HW保持一致，且各組脛骨長度（TL）均無顯著性差異（表2）。

表2 心臟質(zhì)量及心脛比結(jié)果Table 2 Results of HW and HW/TL

反映各組大鼠心功能的血流動力學指標顯示，與S組比較，MI組大鼠LVSP、±dp/dtmax均顯著降低（P＜0.01），LVEDP顯著升高（P＜0.01）；與MI組比較，MIH組和MIE組LVSP、＋dp/dtmax均顯著升高（P＜0.05），LVEDP均顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）；與MIH組比較，MIE組LVSP顯著升高（P＜0.05），LVEDP顯著降低（P＜0.05；圖2）。

圖2 心臟血流動力學檢測結(jié)果Figure 2. Test Results of Cardiac Hemodynamic

2.2 心肌血管新生及Masson染色觀察

心肌Masson染色CVF統(tǒng)計結(jié)果顯示，與S組比較，MI組顯著升高（P＜0.01）；與MI組比較，MIH組、MIE組顯著降低（P＜0.01；圖3）。

圖3 心肌Masson染色結(jié)果（比例尺=200 μm）Figure 3. Results of Masson Staining of Cardiac Muscle（Scale bar=200 μm）

PCNA為細胞增殖核抗原，vWF為內(nèi)皮細胞標記物，DAPI是一種能與DNA強力結(jié)合的熒光染料。免疫熒光的雙染結(jié)果顯示，PCNA為紅色，vWF為綠色，DAPI為藍色；心肌PCNA＋/vWF＋的統(tǒng)計結(jié)果顯示，與MI組相比，MIH組、MIE組表達顯著上調(diào)（P＜0.05，P＜0.01）；與MIH組相比，MIE組表達顯著上調(diào)（P＜0.01；圖4）。

VEGF表達的Western Blot結(jié)果顯示，與S組比較，MI組表達顯著上調(diào)（P＜0.05）；與MI組比較，MIE組表達顯著上調(diào)（P＜0.01；圖4）。

圖4 心肌免疫熒光結(jié)果（比例尺=150 μm）Figure 4. Results of Myocardial Immunofluorescence（Scale bar=150 μm）

2.3 心肌HIF-1α、Ets-2蛋白及miR-126表達

HIF-1α表達的Western Blot結(jié)果顯示，與S組比較，MI組表達顯著上調(diào)（P＜0.01）；與MI組比較，MIH組、MIE組表達顯著上調(diào)（P＜0.05，P＜0.01）；與MIH組相比，MIE組表達顯著上調(diào)（P＜0.05）。各組Ets-2表達的Western Blot結(jié)果均無顯著差異（圖5）。

miR-126的RT-qPCR結(jié)果顯示，與S組比較，MI組表達顯著下調(diào)（P＜0.01）；與MI組比較，MIH和MIE組表達均顯著上調(diào)（P＜0.05，P＜0.01）；與MIH組比較，MIE組表達顯著上調(diào)（P＜0.01；圖5）。

圖5 心肌HIF-1α、Ets-2蛋白及miR-126的RT-qPCR表達結(jié)果Figure 5. Expression Results of RT-qPCR of Myocardial HIF-1α、Ets-2 and miR-126

2.4 低氧條件下HUVECs細胞HIF-1α、miR-126表達

不同低氧時間刺激后HUVECs細胞HIF-1α的Western Blot和miR-126的RT-qPCR表達結(jié)果顯示（圖6），與常氧組相比，低氧2 h后兩者表達均達到峰值（P＜0.01）；與低氧2 h組對比，低氧3 h、4 h、6 h、8 h、12 h、24 h后兩者均出現(xiàn)顯著性降低（P＜0.01），其變化趨勢高度一致。

圖6 不同低氧時間HUVECs HIF-1α、miR-126表達結(jié)果Figure 6. Expression Results of HIF-1α，miR-126 at Different Hypoxic Times in HUVECs

3 分析討論

3.1 間歇低氧和間歇運動干預降低心梗心肌纖維化、改善心功能的比較分析

心肌梗死之后會出現(xiàn)心肌肥厚、心室壁變薄、細胞凋亡和心肌間質(zhì)纖維化等多種心臟結(jié)構(gòu)的重塑，這是很多心血管疾病共同的病理基礎(chǔ)，也是導致心功能衰竭的主要誘因。IH和IT作為一種天然的、非藥物性的受損心臟康復手段，受到學者的廣泛關(guān)注。本研究不僅證實了IH和IT均能有效改善MI心臟心功能（與之前的報道相一致）（Jia et al.，2018；Xu et al.，2011），而且也發(fā)現(xiàn)了 IT 的保護作用優(yōu)于IH。當然，不同的IH和IT方案帶來的效果可能不同，本研究所選取的IH和IT方案是基于文獻報道且在實踐中被證明對缺血心臟心功能起到很好改善作用的適宜方案（Almendros et al.，2014；Wisl?ff et al.，2009）。心血管系統(tǒng)健康是多因素影響的結(jié)果，其中心肌纖維化程度的變化是其中重要一環(huán)。心肌纖維化可增加心室壁硬度，降低心室壁功能，導致心臟順應(yīng)性下降，心功能不全甚至衰竭。本研究發(fā)現(xiàn)，心肌梗死后心肌代償性纖維化程度明顯增加。與MI組相比，MIH組和MIE組心肌替代纖維化程度明顯降低。有趣的是，MIH和MIE之間并無差異，說明IH和IT可以減輕心肌梗死引起的代償性纖維化，但這并不是導致心功能差異的主要原因。

心肌肥厚是心肌對持續(xù)性負荷的一種代償反應(yīng)，是導致心血管疾病死亡的危險因素，從病理生理學角度分析心肌肥厚可分為生理性和病理性兩種。本實驗結(jié)果顯示，與S組比較，MI組大鼠心臟質(zhì)量和心脛比增加明顯；表明心梗心臟會出現(xiàn)諸如間質(zhì)纖維化、膠原蛋白合成增加等病理性心肌肥大，導致心肌收縮力下降；與MI組比較，MIH組心臟質(zhì)量和心脛比出現(xiàn)了顯著降低，說明IH可能一定程度上通過逆轉(zhuǎn)心梗心臟的病理性變化進而影響心功能，這種可逆性變化為臨床干預提供了基礎(chǔ)；與MI組比較，MIE組大鼠心臟質(zhì)量和心脛比顯著升高，提示，IT可促進心梗心臟的生理性肥大，心肌結(jié)構(gòu)更加均勻和協(xié)調(diào)，心肌收縮力和心功能明顯提高。由于心臟生理性肥大和病理性肥大存在本質(zhì)區(qū)別，故本研究認為，IH和IT干預過程可能涉及不同的作用機制。

3.2 間歇低氧和間歇運動可能通過HIF-1α上調(diào)miR-126表達，促進心梗心肌血管新生

運動可以誘發(fā)多種效應(yīng)，如氧化應(yīng)激、炎癥、低氧等。在這些因素作用下，機體相關(guān)的因子、蛋白表征會出現(xiàn)變化進而調(diào)控下游靶器官功能。心肌梗死的治療，血運重建是關(guān)鍵。血管新生是指在已有血管網(wǎng)絡(luò)中通過內(nèi)皮細胞的增殖和遷移而形成新的血管，在心肌損傷修復中較為常見。激活心臟血管新生通路是一種重要的治療和康復策略，在多種形式的心臟疾病動物模型中已經(jīng)得到了驗證。雖然在梗死心臟中可以觀察到代償性血管新生，但其血管新生的數(shù)量遠遠不足（Fernández-hernando et al.，2007；Karam et al.，1990）。因此，心肌梗死后治療性血管生成方案具有重要的臨床應(yīng)用價值。為了評估IH和IT對心梗心肌血管新生產(chǎn)生的影響，本研究利用免疫熒光雙染的方法分析了心肌梗死邊緣區(qū)PCNA和vWF陽性顆粒數(shù)目。結(jié)果表明，IH和IT均能促進心梗心肌的血管新生，而IT的作用更明顯。

血管新生是一個極其復雜的過程（Weis et al.，2011）。miR-126在血管內(nèi)皮細胞中高度表達，被認為是血管新生的主要調(diào)控因子之一（Chistiakov et al.，2016）。Wang等（2008）研究發(fā)現(xiàn)，miR-126缺失小鼠會導致出血或部分胚胎死亡，原因是內(nèi)皮細胞增殖及血管新生方面的缺陷。存活的突變體在MI后心肌基本喪失血管新生的能力。而轉(zhuǎn)染miR-126的間充質(zhì)干細胞移植可以改善小鼠心臟梗死區(qū)血管生成和心功能（Chen et al.，2011）。因此，miR-126在心梗心肌的血管新生中具有重要的作用，本研究表明，IH和IT均可上調(diào)miR-126的表達，且IT的上調(diào)更為顯著，這與本研究的免疫熒光實驗結(jié)果吻合。那么，IH和IT誘導miR-126上調(diào)的機制又是什么呢？對miR-126上游的研究中發(fā)現(xiàn)，敲減HUVECs中Ets-2后，miR-126表達下降約20%（Harris et al.，2010）。Ets-2是Ets轉(zhuǎn)錄因子家族中的一員，在血管生成、炎癥和重塑中發(fā)揮重要作用（Sato et al.，2001），但是Western Blot結(jié)果顯示，各組Ets-2 表達均無顯著差異，表明miR-126表達上調(diào)可能另有原因。有研究表明，細胞對缺氧和運動的反應(yīng)在很大程度上是通過激活HIF-1實現(xiàn)的（Tekin et al.，2010）。HIF-1是一個核轉(zhuǎn)錄因子，最早是由Semenza等（1992）在人肝癌Hep3B細胞核提取物中發(fā)現(xiàn)，由低氧敏感的α亞基和β亞基構(gòu)成。HIF-1的生理功能主要取決于其HIF-1α亞基，α亞基在細胞質(zhì)中表達，可根據(jù)氧濃度的變化來調(diào)節(jié)HIF-1的活性，進而介導細胞對低氧的應(yīng)答。已知HIF-1可調(diào)節(jié)200多種下游靶基因的轉(zhuǎn)錄表達，并通過多種生物學機制實現(xiàn)對缺血心肌的保護（丁然然等，2015）。為了進一步分析HIF-1α與miR-126兩者之間的關(guān)系，本研究首先通過TransmiR v2.0數(shù)據(jù)庫進行了預測，發(fā)現(xiàn)miR-126是HIF-1α潛在的激活靶點（Ong et al.，2014）；隨后又通過HUVECs細胞實驗證實，隨著低氧時間的延長，HIF-1α表達先升高后降低，在低氧2 h表達出現(xiàn)峰值，miR-126的表達結(jié)果與HIF-1α高度一致，提示，HIF-1α很可能是miR-126的上游。有趣的是，在體實驗的結(jié)果與離體實驗出現(xiàn)了部分差異，與S組相比，MI組miR-126的表達結(jié)果與HIF-1α正好相反。李國達等（2015）對大鼠心梗后7天、14天、28天的心肌梗死邊緣區(qū)miR-126動態(tài)表達進行了研究，發(fā)現(xiàn)隨著梗死時間的延長，miR-126的表達量逐漸增加，在心梗后第14天，miR-126的表達量最高，隨后逐漸降低。本研究MI組miR-126的測試時間為第28天，從時間窗考慮低氧效應(yīng)已經(jīng)衰減；IH和IT兩種干預手段所產(chǎn)生的持續(xù)低氧刺激也許是導致miR-126的表達持續(xù)上調(diào)的原因。目前，鮮見關(guān)于miR-126上游調(diào)控因子的研究，不同病理生理條件下的調(diào)控機制也存在很大差異，關(guān)于運動上調(diào)miR-126表達的確切機制還需要進一步的深入研究。

4 結(jié)論

間歇低氧和間歇運動可能通過HIF-1α上調(diào)心梗心肌miR-126表達，促進心肌血管新生，改善心功能，且間歇運動產(chǎn)生的效果要優(yōu)于間歇低氧。提示，對于臨床上不適宜進行運動康復治療的缺血性心臟病患者，間歇低氧可以作為一種很好的替代和補充。