延齡草總皂苷對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎模型大鼠的改善作用及機(jī)制

譚曉茜　史偉文　蔣安蓉　柳蔚　李世剛　喻玲玲

中圖分類號(hào) R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2021）21-2635-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2021.21.13

摘 要 目的：研究延齡草總皂苷（TTM）對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎模型大鼠的改善作用及機(jī)制。方法：將SD大鼠隨機(jī)分為造模組（n=44）和空白組（n=6），造模組大鼠注射完全弗氏佐劑以復(fù)制佐劑性關(guān)節(jié)炎模型，空白組大鼠同法注射等體積生理鹽水。將造模成功的大鼠分為模型組、雷公藤多苷片組（40 mg/kg）和TTM低、中、高劑量組（50、100、200 mg/kg），每組6只。各給藥組大鼠灌胃相應(yīng)藥物，空白組和模型組大鼠灌胃生理鹽水，每天1次，連續(xù)9 d。末次灌胃后，測(cè)定大鼠體質(zhì)量、足腫脹度（雙側(cè)），并進(jìn)行關(guān)節(jié)炎性評(píng)分;測(cè)定大鼠血清中腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細(xì)胞介素1β（IL-1β）、IL-6含量;觀察大鼠踝關(guān)節(jié)病理形態(tài)學(xué)變化;檢測(cè)大鼠膝關(guān)節(jié)組織中NOD樣受體蛋白3（NLRP3）、凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白（ASC）、胱天蛋白酶1（caspase-1）的蛋白表達(dá)水平;檢測(cè)大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織中NLRP3的蛋白表達(dá)水平。結(jié)果：與空白組比較，模型組大鼠雙側(cè)足腫脹度，血清中TNF-α、IL-1β、IL-6含量，膝關(guān)節(jié)組織中NLRP3、ASC、caspase-1蛋白表達(dá)水平，踝關(guān)節(jié)滑膜組織中NLRP3蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P<0.05或P<0.01）;體質(zhì)量顯著降低（P<0.05）;滑膜細(xì)胞增生明顯，可見滑膜組織充血、炎性細(xì)胞浸潤等。與模型組比較，TTM各劑量組大鼠上述指標(biāo)水平大部分均顯著逆轉(zhuǎn)（P<0.05或P<0.01）;滑膜細(xì)胞增生、滑膜組織充血及軟骨細(xì)胞破壞等病理改變均減輕，炎癥細(xì)胞浸潤減少。結(jié)論：TTM可改善大鼠類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎;其作用機(jī)制可能與抑制NLRP3/caspase-1信號(hào)通路的活性，降低炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6的表達(dá)有關(guān)。

關(guān)鍵詞 延齡草總皂苷;關(guān)節(jié)炎;NOD樣受體蛋白3;抗炎;大鼠

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To study the improvement effects of Trillium tschonoskii total saponins （TTM） on adjuvant-induced arthritis model rats and its mechanism. METHODS： SD rats were randomly divided into model group （n=44） and blank group （n=6）. Model group was given Complete Freunds adjuvant to induce the adjuvant-induced arthritis model; blank group was given constant volume of normal saline with same method. Model group were divided into model group， Tripterygium wilfordii polyglycoside tablets group （40 mg/kg）， TTM low-dose， medium-dose and high-dose groups （50， 100， 200 mg/kg）， with 6 rats in each group. Administration groups were given relevant medicine intragastrically; blank group and model group were given normal saline intragastrically， once a day， for consecutive 9 days. After last intragastric administration， the body weight and foot swelling degree （bilateral） were detected， and arthritis score was performed. The contents of tumor necrosis fator α （TNF-α）， interleukin 1β （IL-1β） and IL-6 were detected; the pathomorphological changes of rat ankle were observed; protein expression of NOD-like receptor protein 3 （NLRP3）， apoptosis associated spot-like protein （ASC）， caspase-1 were detected; the protein expression of NLRP3 in synovial tissue of ankle joint were also determined. RESULTS： Compared with blank group， foot swelling degree， serum contents of TNF-α， IL-1β and IL-6， the protein expression of NLRP3， ASC and caspase-1 in knee tissue as well as the protein expression of NLRP3 in synovial tissue of ankle joint were increased significantly in model group （P<0.05 or P<0.01）， while the body weight was decreased significantly （P<0.05）. The obvious proliferation of synovial cells， the congestion and inflammatory cell infiltration of synovial tissue were all observed. Compared with model group， most of the above indexes were all reversed significantly in TTM groups （P<0.05 or P<0.01）; the pathological changes such as synovial cell proliferation， congestion of synovial tissue and chondrocyte destruction were all relieved， and inflammatory cell infiltration was alleviated. CONCLUSIONS： TTM can improve rheumatoid arthritis of rats， the mechanism of which may be associated with inhibiting the activity of NLRP3/caspase-1 signaling pathway and decreasing the expression of inflammatory factors TNF-α， IL-1β， IL-6.

KEYWORDS? ?Trillium tschonoskii total saponins; Arthritis; NOD-like receptor protein 3; Anti-inflammation; Rats

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種以滑膜炎為主要特征的自身免疫性疾病，臨床主要表現(xiàn)為疼痛、腫脹、關(guān)節(jié)僵硬、發(fā)熱、乏力等，甚至有些患者表現(xiàn)出不可逆轉(zhuǎn)的生理功能障礙[1]。RA的發(fā)病過程涉及腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細(xì)胞介素6（IL-6）、IL-1β等多種炎癥因子，但其具體發(fā)病機(jī)制尚不明確[2]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，RA患者外周血的單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞中的NOD樣受體蛋白3（NOD-like receptor protein 3，NLRP3）的表達(dá)上調(diào)[3]。

延齡草別名“頭頂一顆珠”，為百合科植物，是神農(nóng)架四大名藥之一，其根莖具有化瘀、解毒、除風(fēng)濕等功效，可用于治療軟組織損傷、外傷出血等[4]，其主要活性成分為延齡草總皂苷（TTM）[5]。經(jīng)本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，TTM具有明顯的抗炎活性，對(duì)小鼠足腫脹具有顯著的治療效果[6]。但是，TTM是否具有改善AA的作用，尚不明確。

膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎（collagen induced arthritis，CIA）和佐劑性關(guān)節(jié)炎（adjuvant-induced arthritis，AA）模型在RA動(dòng)物模型中均應(yīng)用廣泛：CIA模型常用于RA的免疫機(jī)制研究，AA模型常用于RA藥物療效研究[7-8]。且相較于CIA模型，AA模型具有成模率高、造模時(shí)間短、操作簡單等優(yōu)點(diǎn)[9]，故本研究選擇建立AA模型大鼠，探究TTM對(duì)關(guān)節(jié)炎的改善作用及機(jī)制，以期為TTM治療RA提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有C2500-R-230V型微型高速離心機(jī)（美國Labnet公司）、ICV-450型電熱恒溫培養(yǎng)箱（日本 Asone公司）、Flexstation 3型多功能酶標(biāo)儀（美國Molecular Devices公司）、DYY-7C型電泳儀（北京六一儀器廠）、BX53型生物顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.2 主要藥品與試劑

本研究所用TTM由本實(shí)驗(yàn)室自制（112.96 g/kg，以生藥量計(jì)）。其他藥品與試劑有：雷公藤多苷片（浙江得恩德制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字Z33020422，規(guī)格10 mg），TNF-α、IL-6、IL-1β的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，批號(hào)分別為E-EL-R2856c、E-EL-R0015c、E-EL-R0012c），水合氯醛（廣東光華科技股份有限公司，批號(hào) 20100926），完全弗氏佐劑、4%多聚甲醛、蘇木精-伊紅（HE）染色液（美國Sigma公司，批號(hào)分別為F5881-10、158127、H9627），BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號(hào)P0010），兔源GAPDH多克隆抗體（杭州賢至生物科技有限公司，批號(hào)AB-P-R001），兔源凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白（ASC）多克隆抗體（美國Affinity公司，批號(hào)DF6304），兔源NLRP3單克隆抗體（武漢愛博泰克生物科技有限公司，批號(hào)A5652），兔源胱天蛋白酶1（caspase-1）P10多克隆抗體（10/45 kDa）（北京博奧森生物技術(shù)有限公司，批號(hào)bs-20617R），辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔免疫球蛋白G二抗（武漢博士德生物工程有限公司，批號(hào)BA1054）;其余試劑為實(shí)驗(yàn)室常用規(guī)格，水為純凈水。

1.3 動(dòng)物

本研究所用動(dòng)物為SPF級(jí)雄性SD大鼠，體質(zhì)量180～200 g，購自三峽大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（鄂）2017-0012。動(dòng)物飼養(yǎng)于室溫為25 ℃、相對(duì)濕度為40%～70%的環(huán)境中，經(jīng)適應(yīng)性喂養(yǎng)后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)過程符合三峽大學(xué)實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)的相關(guān)要求。

2 方法

2.1 造模、分組與給藥

將大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為造模組（n=44）和空白組（n=6）。造模組大鼠右足趾處注射完全弗氏佐劑 0.1 mL以致炎[10];注射后第7天，在大鼠右側(cè)尾部皮下注射完全弗氏佐劑 0.1 mL來加強(qiáng)免疫，以復(fù)制AA模型?？瞻捉M大鼠同法注射等體積生理鹽水。注射10 d后，造模組大鼠參考 “0～4級(jí)關(guān)節(jié)炎性評(píng)分辦法”對(duì)其雙側(cè)后足關(guān)節(jié)進(jìn)行炎性評(píng)分[11]：0分為無腫脹和紅斑;1分為踝關(guān)節(jié)出現(xiàn)紅斑和輕度腫脹;2分為踝關(guān)節(jié)到跖關(guān)節(jié)或掌關(guān)節(jié)出現(xiàn)紅斑和輕度腫脹;3分為踝關(guān)節(jié)到跖趾關(guān)節(jié)或掌關(guān)節(jié)出現(xiàn)紅斑和中度腫脹;4分為踝關(guān)節(jié)到趾關(guān)節(jié)出現(xiàn)紅斑和重度腫脹。當(dāng)大鼠雙側(cè)（右側(cè)為原發(fā)側(cè)，左側(cè)為繼發(fā)側(cè)）足關(guān)節(jié)累計(jì)評(píng)分大于4時(shí)，則表明造模成功。剔除造模不成功大鼠14只，將造模成功的30只大鼠隨機(jī)分為模型組、雷公藤多苷片組（40 mg/kg，劑量參考文獻(xiàn)[12]設(shè)置）和TTM低、中、高劑量組（50、100、200 mg/kg，劑量根據(jù)本課題組前期研究結(jié)果設(shè)置[13-15]），每組6只。各給藥組大鼠灌胃相應(yīng)藥物[臨用時(shí)均以羧甲基纖維素鈉溶液（以生理鹽水為溶劑）溶解]，空白組和模型組大鼠灌胃生理鹽水，灌胃體積為0.01 mL/g，每天1次，連續(xù)9 d。

2.2 大鼠體質(zhì)量、足腫脹度、關(guān)節(jié)炎性評(píng)分的檢測(cè)

末次灌胃后，稱定各組大鼠體質(zhì)量，并采用游標(biāo)卡尺測(cè)量大鼠雙側(cè)后足踝關(guān)節(jié)同一位點(diǎn)（右側(cè)為原發(fā)側(cè)，左側(cè)為繼發(fā)側(cè)）的厚度，平行測(cè)量3次，取平均值，并計(jì)算足腫脹度（足腫脹度=灌胃后大鼠踝關(guān)節(jié)厚度的平均值-造模前大鼠踝關(guān)節(jié)厚度的平均值）。另外，按照“2.1”項(xiàng)下方法對(duì)灌胃后大鼠雙側(cè)后足關(guān)節(jié)進(jìn)行炎性評(píng)分。

2.3 大鼠血清中IL-1β、TNF-α、IL-6含量的測(cè)定

采用ELISA法進(jìn)行檢測(cè)。各組大鼠體質(zhì)量等基本情況觀察結(jié)束后，以10%水合氯醛進(jìn)行麻醉，于腹主動(dòng)脈取血。血樣于室溫靜置2 h后，以3 000 r/min離心10 min，吸取上層血清，按試劑盒說明書相關(guān)方法操作，以酶標(biāo)儀測(cè)定血清中TNF-α、IL-6、IL-1β的含量。

2.4 大鼠踝關(guān)節(jié)病理形態(tài)學(xué)觀察

關(guān)節(jié)炎性評(píng)分后，處死各組大鼠并剖離脾臟組織，再剖取其關(guān)節(jié)組織（包括踝關(guān)節(jié)和膝關(guān)節(jié)）。將踝關(guān)節(jié)置于EDTA脫鈣液中脫鈣2個(gè)月，將膝關(guān)節(jié)置于-80 ℃下保存?zhèn)溆?。將脫鈣后的踝關(guān)節(jié)組織經(jīng)梯度乙醇脫水、石蠟包埋、切片后，取各組大鼠切片（共36張，另外18張用于免疫組化實(shí)驗(yàn)）以二甲苯和梯度乙醇進(jìn)行脫蠟和水合;然后將上述組織切片置于蘇木精染色液中染色1 min，以自來水沖洗后，再置于鹽酸乙醇溶液中浸泡3 s;繼續(xù)以自來水沖洗后，將上述組織切片置于伊紅染色液中染色1 min，再進(jìn)行脫水、封閉，然后置于顯微鏡下觀察大鼠踝關(guān)節(jié)病理形態(tài)學(xué)變化情況。

2.5 大鼠膝關(guān)節(jié)組織中NLRP3、ASC、caspase-1蛋白表達(dá)水平的檢測(cè)

采用Western blot法進(jìn)行檢測(cè)。取“2.4”項(xiàng)下凍存的各組大鼠膝關(guān)節(jié)組織適量，經(jīng)剪碎、裂解后，以12 000? ? r/min離心5 min，取上清液，采用BCA蛋白測(cè)定試劑盒檢測(cè)蛋白濃度。蛋白經(jīng)變性后，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），轉(zhuǎn)膜70 min，以5%脫脂牛奶封閉2 h;以TBST緩沖液清洗10 min×3次，加入GAPDH、NLRP3、caspase-1P10、ASC一抗（稀釋度均為 1 ∶ 1 000），于4 ℃孵育過夜;以 TBST緩沖液清洗 10 min×3次，加入二抗（稀釋度為1 ∶? 50 000），于室溫孵育2 h;以TBST緩沖液清洗10 min×3次，加入ECL發(fā)光液顯色，經(jīng)全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)成像。采用Image J v1.8.0軟件進(jìn)行分析，以cleaved-caspase-1/caspase-1的比值表示caspase-1的蛋白表達(dá)水平，以目的蛋白與內(nèi)參GAPDH灰度值的比值表示NLRP3、ASC的蛋白表達(dá)水平。

2.6 大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織中NLRP3蛋白表達(dá)水平的檢測(cè)

采用免疫組化法進(jìn)行檢測(cè)。取“2.5”項(xiàng)下脫鈣后的各組大鼠踝關(guān)節(jié)組織切片（共18張），經(jīng)脫蠟后，采用1%胰酶修復(fù)液于37 ℃條件下孵育1.5 h;以磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.4）沖洗5 min×3次，滴加3% H2O2溶液適量，靜置10 min以修復(fù)抗原;以PBS沖洗5 min×3次，滴加山羊血清封閉20 min后，甩去多余液體，滴加NLRP3一抗（稀釋度為1 ∶ 100）50 μL，4 ℃孵育過夜;以PBS沖洗5 min×3次，滴加二抗，于37 ℃孵育30 min;以PBS沖洗3 min×3次，甩去多余液體，滴加DAB顯色液，室溫孵育8 min，于光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。當(dāng)切片中出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒則為目的蛋白陽性表達(dá)。采用IPP6.0軟件分析蛋白陽性表達(dá)部分的光密度，并計(jì)算陽性率，以表示目的蛋白的表達(dá)水平。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

3 結(jié)果

3.1 TTM對(duì)AA模型大鼠體質(zhì)量、足腫脹度、關(guān)節(jié)炎性評(píng)分的影響

與空白組比較，模型組大鼠雙側(cè)足腫脹度、關(guān)節(jié)炎性評(píng)分均顯著升高（P<0.05或P<0.01），體質(zhì)量顯著降低（P<0.05）;與模型組比較，雷公藤多苷片組和TTM各劑量組大鼠雙側(cè)足腫脹度（TTM低劑量組原發(fā)側(cè)足腫脹度除外）、關(guān)節(jié)炎性評(píng)分均顯著降低（P<0.05或P<0.01），TTM低劑量組大鼠體質(zhì)量顯著升高（P<0.05），詳見表1。

3.2 TTM對(duì)AA模型大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6含量的影響

與空白組比較，模型組大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6含量均顯著升高（P<0.01）;與模型組比較，雷公藤多苷片組和TTM各劑量組大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6含量均顯著降低 （P<0.05或P<0.01），詳見表2。

3.3 TTM對(duì)AA模型大鼠踝關(guān)節(jié)病理形態(tài)學(xué)的影響

空白組大鼠滑膜細(xì)胞無增生、充血、水腫以及炎癥細(xì)胞浸潤，軟骨細(xì)胞呈橢圓形緊密排列;模型組大鼠滑膜細(xì)胞增生明顯，可見滑膜組織充血、炎性細(xì)胞浸潤、軟骨細(xì)胞破壞、血管翳生成;雷公藤多苷片組和TTM各劑量組大鼠滑膜細(xì)胞增生、滑膜組織充血及軟骨細(xì)胞破壞等病理改變均較模型組減輕，炎性細(xì)胞浸潤減少，詳見圖1。

3.4 TTM對(duì)AA模型大鼠膝關(guān)節(jié)組織中NLRP3、ASC、caspase-1蛋白表達(dá)的影響

與空白組比較，模型組大鼠膝關(guān)節(jié)組織中NLRP3、ASC、caspase-1蛋白表達(dá)水平均顯著升高 （P<0.05或P<0.01）;與模型組比較，雷公藤多苷片組和TTM各劑量組大鼠膝關(guān)節(jié)組織中上述蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P<0.05或P<0.01），詳見圖2、表3。

3.5 TTM對(duì)AA模型大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織中NLRP3蛋白表達(dá)的影響

與空白組比較，模型組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織中NLRP3蛋白表達(dá)水平顯著升高（P<0.01）;與模型組比較，雷公藤多苷片組和TTM各劑量組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織中NLRP3蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P<0.05或P<0.01），詳見表4、圖3。

4 討論

本研究結(jié)果顯示，經(jīng)完全弗氏佐劑干預(yù)后，模型大鼠雙側(cè)足腫脹度、關(guān)節(jié)炎性評(píng)分以及血清中TNF-α、IL- 1β、IL-6含量均顯著升高（P<0.05或P<0.01），體質(zhì)量顯著降低（P<0.05）;滑膜細(xì)胞增生明顯，可見滑膜組織充血、炎癥細(xì)胞浸潤、軟骨細(xì)胞破壞、血管翳生成，表明模型大鼠體內(nèi)炎癥反應(yīng)加劇，關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重。經(jīng)不同劑量TTM干預(yù)后，大鼠上述大部分指標(biāo)均明顯逆轉(zhuǎn)，滑膜細(xì)胞增生、滑膜組織充血及軟骨細(xì)胞破壞等病理改變均減輕，炎性細(xì)胞浸潤減少，提示TTM對(duì)AA模型大鼠具有明顯的改善作用。

NLRP3炎癥小體是由受體蛋白、ASC和caspase-1前體（pro-caspase-1）組成的多蛋白復(fù)合體，在正常細(xì)胞中表達(dá)較少[3]。在一些免疫性疾病中，NLRP3可被激活，從而組裝成多蛋白復(fù)合體，進(jìn)而活化caspase-1;活化的caspase-1可將pro-IL-1β和pro-IL-18切割成成熟的IL-1β、IL-18，進(jìn)而釋放至細(xì)胞外，誘導(dǎo)炎癥的發(fā)生[16-17]。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)TTM干預(yù)后，模型大鼠膝關(guān)節(jié)組織中NLRP3、ASC、caspase-1蛋白表達(dá)水平以及踝關(guān)節(jié)滑膜組織中NLRP3蛋白表達(dá)水平均顯著降低。這提示，TTM可通過抑制NLRP3/caspase-1信號(hào)通路的活性，發(fā)揮改善關(guān)節(jié)炎的作用。

綜上所述，TTM可改善大鼠AA;其作用機(jī)制可能與抑制NLRP3/caspase-1信號(hào)通路的活性，降低炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6的表達(dá)有關(guān)。

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（收稿日期：2021-07-01 修回日期：2021-09-13）

（編輯：唐曉蓮）