五味子鮮果采后“殺青”加工對其藥材品質(zhì)的影響

劉磊　馬偉　吳修紅　楊大宇　張曉燕　牛露露　張淑香

中圖分類號 R282.4 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2021）21-2599-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2021.21.07

摘 要 目的：研究五味子鮮果采后“殺青”加工對其藥材品質(zhì)的影響，為中藥材產(chǎn)地加工的科學化、合理化提供新思路。方法：以15份五味子鮮果為樣品，每3份為一組，分別采用50 ℃烘干、曬干、微波“殺青”后50 ℃烘干、燙漂“殺青”后50 ℃烘干、蒸制“殺青”后50 ℃烘干等5種方法進行初加工。借助《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2012版）建立15份五味子干燥品的高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜并進行相似度評價;通過聚類分析評價不同加工方法所得五味子干燥品的相似性。同時，采用HPLC法測定各干燥品中五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子酯乙、五味子甲素、五味子乙素和五味子丙素等7種木脂素類成分的含量變化。結(jié)果：15份五味子干燥品的指紋圖譜中共得到7個共有峰，除曬干樣品色譜圖與對照指紋圖譜的相似度相對較低外，其他加工方法所得干燥品的色譜圖的相似度均大于0.900。聚類分析結(jié)果顯示，五味子微波“殺青”后50 ℃烘干和燙漂“殺青”后50 ℃烘干的6份樣品聚為第1類;蒸制“殺青”后50 ℃烘干的3份樣品聚為第2類;50 ℃烘干和曬干的6份樣品聚為第3類。含量測定結(jié)果顯示，50 ℃烘干和曬干樣品中7種木脂素成分的總含量差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）;微波、燙漂和蒸制“殺青”后再50 ℃烘干的樣品中7種木脂素成分的總含量均顯著高于50 ℃烘干和曬干樣品（P<0.01）。結(jié)論：先采用燙漂、微波等方法“殺青”后再干燥處理的五味子樣品的品質(zhì)要優(yōu)于直接曬干和烘干的樣品。

關鍵詞 五味子;采后加工;殺青;高效液相色譜指紋圖譜;木脂素類

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To study the effects of “green removing” processing technology of fresh fruit of Schisandra chinensis after harvested on the quality of medicinal material， and to provide new ideas for the scientific and rational processing of Chinese medicinal material. METHODS： Fifteen fresh fruits of S. chinensis were used as samples， with 3 samples in each group. The sample were processed preliminarily by 5 methods， such as drying at 50 ℃， drying in the sun， drying at 50 ℃ after “green removing” processing with microwave， drying at 50 ℃ after “green removing” processing with blanching， drying at 50 ℃ after “green removing” processing with steaming. HPLC fingerprints of 15 batches of dried S. chinensis products were established and similarity evaluation was conducted according to Similarity Evaluation System of TCM Chromatographic Fingerprints （2012 edition）. Cluster analysis was used to evaluate the similarity of dried S. chinensis products with different processing methods. At the same time， HPLC method was adopted to determine the content changes of seven lignans in dried products， such as schisandrol A， schisandrol B， schisantherin A， schisantherin B， schizandrin A， schisandrin B and schisandrin C. RESULTS： A total of 7 common peaks were obtained in the fingerprints of 15 batches of dried S. chinensis products. Except that the similarity between the chromatograms of dried samples in the sun and the control fingerprint was relatively low， the similarities of chromatograms of dried products by other processing methods were greater than 0.900. Cluster analysis showed that 6 samples dried at 50 ℃ after “green removing” processing with microwave and dried at 50 ℃ after “green removing” processing with blanching were grouped into the first category; 3 samples dried at 50 ℃ after “green removing” processing with steaming were grouped into the second category; 6 samples dried at 50 ℃ and dried in sun were grouped into the third category. The content determination results showed that there was no significant difference in the total content of seven lignans in the samples dried at 50 ℃ and dried in the sun （P>0.05）. The total contents of seven lignans in the samples dried at 50 ℃ after “green moving” processing with microwave， blanching and steaming were significantly higher than those dried at 50 ℃ and dried in sun （P<0.01）. CONCLUSIONS： The quality of S. chinensis samples dried after “green moving” processing with microwave and blanching is better than those directly dried in sun and dried in oven.

KEYWORDS? ?Schisandra chinensis; Processing after harvested; HPLC fingerprint; Lignans

五味子為木蘭科植物五味子Schisandra chinensis（Turcz.）Baill.的干燥成熟果實[1]，是東北的道地藥材?，F(xiàn)代研究表明，五味子中以木脂素類、多糖類、揮發(fā)油類、有機酸類等化學成分為主，其中木脂素類化學成分為其重要的藥理活性成分之一[2]。五味子屬于漿果，為了便于貯藏和運輸，五味子鮮果采摘后的干制是必不可少的一道初加工工序。五味子鮮果采摘后果實細胞仍會進行活躍的新陳代謝，這種現(xiàn)象稱為“采后生理”，表現(xiàn)為未成熟的果實可以繼續(xù)成熟、已成熟的果實會老化腐爛[3]。由于果實在采摘后光合作用基本停止，呼吸成為新陳代謝的主要過程，因此果實細胞會繼續(xù)通過呼吸作用消耗有機物質(zhì)，為生命活動提供能量[4]?！皻⑶唷笔侵竿ㄟ^一定的方法和條件將采收獲得的生物體或組織器官中相關酶系等滅活。對中藥材采用適宜的工藝和技術方法進行“殺青”，破壞鮮活藥材中的酶活性，有利于保留其功效物質(zhì)和保持其良好品質(zhì)，對藥材品質(zhì)的形成具有重要影響[5]。

五味子的傳統(tǒng)干燥方法主要為自然晾曬、烘干或者曬烘結(jié)合，干燥周期較長，而干燥周期內(nèi)果實細胞中的代謝酶會繼續(xù)消耗內(nèi)含物質(zhì)，為其生命活動提供能量[4]。本課題組前期將五味子鮮果先進行微波“殺青”處理后再進行干燥，所得干燥品中五味子醇甲的含量明顯高于傳統(tǒng)曬干品，這提示五味子鮮果經(jīng)“殺青”處理后可能有利于其木脂素類活性成分的保留，進而影響藥材品質(zhì)的形成。鑒于此，本研究擬采用高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜、聚類分析等方法，并結(jié)合五味子中主要的7種木脂素類成分（五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子酯乙、五味子甲素、五味子乙素和五味子丙素）的含量變化，考察五味子鮮果采后“殺青”加工對其品質(zhì)的影響，為中藥材產(chǎn)地加工的科學化、合理化提供新思路。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有Thermo Ultimate 3000型HPLC儀（美國Thermo Fisher Scientific公司），F(xiàn)A2004型分析天平（上海津平科學儀器有限公司），Benchtop Pro 3L ES-55型凍干機（美國SP Scientific公司），M1-L202B型微波爐（廣州美的廚房電器制造有限公司），GZX-9070MBE型電熱鼓風干燥箱、XMTD-204型電熱恒溫水浴鍋（上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠），SFY-001型鹵素水分測定儀（上海花潮實業(yè)有限公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

五味子鮮果于2018年9月20號采摘自黑龍江省通河縣清河林業(yè)局紅太陽五味子種植基地，經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學藥學院吳修紅教授鑒定為木蘭科植物五味子S.chinensis （Turcz.） Baill.的成熟果實。五味子醇甲對照品（批號110857-201815，純度99.7%）、五味子酯甲對照品（批號111529-201706，純度95.2%）、五味子甲素對照品（批號110764-201915，純度99.5%）、五味子乙素對照品（批號110765-201813，純度99.1%）均購自中國食品藥品檢定研究院;五味子醇乙對照品（批號B21323，純度≥98%）、五味子酯乙對照品（批號B21330，純度≥98%）、五味子丙素對照品（批號B21321，純度≥98%）均購自上海源葉生物科技有限公司;乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為屈臣氏飲用水。

2 方法與結(jié)果

2.1 五味子干燥品的制備

將采收的五味子鮮果分成15份，每份約200 g，每3份樣品為一組，每組的鮮果采用同一種加工方式。分別采用50 ℃烘干、曬干、微波“殺青”后50 ℃烘干、燙漂“殺青”后50 ℃烘干、蒸制“殺青”后50 ℃烘干等5種方法對五味子鮮果進行初加工（所得樣品的編號為S1～S15），具體制備方法見表1。加工過程中每間隔一定時間稱取樣品2 g，采用鹵素水分測定儀測定樣品中的水分含量。因2020年版《中國藥典》（一部）五味子項下規(guī)定，五味子藥材及其飲片的水分含量均不得高于16%[1]，因此本研究選擇各組樣品均在干燥至其中水分含量約10%時即停止。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液的制備 精密稱取五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子酯乙、五味子甲素、五味子乙素和五味子丙素對照品各約10 mg，分別置于不同5 mL量瓶中，用甲醇溶解并制備成上述對照品質(zhì)量濃度分別為1.90、1.96、1.09、1.94、1.96、1.92、2.02 mg/mL的各單一對照品貯備液，備用。精密吸取上述7種單一對照品貯備液適量，置于同一10 mL量瓶中，加甲醇定容，搖勻，制成上述成分質(zhì)量濃度分別為0.095、0.098、0.109、0.097、0.098、0.096、0.101 mg/mL的混合對照品溶液，備用。

2.2.2 供試品溶液的制備 取15份五味子干燥品粉末（過三號篩，下同）約5 g，精密稱定，置于250 mL圓底燒瓶中，分別加85%乙醇100 mL加熱回流提取3次，每次分別提取3、2、1 h;收集合并3次提取液的濾液，然后水浴蒸干溶劑，再將其轉(zhuǎn)移至60 ℃烘箱中烘干，然后用甲醇溶解并定容至25 mL，以微孔濾膜（0.45 μm）濾過，即得[6]。

2.3 色譜條件

在文獻[2，7]的基礎上設置本研究的色譜條件。以Diamonsil C18為色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），以乙腈（A）-水（B）為流動相進行梯度洗脫（0～10 min，38%A→44A%;10～18 min，44%A→45%A;18～28 min，45%A→48%A;28～35 min，48%A→60%A;35～37 min，60%A→47%A;37～65 min，47%A→48%A;65～67 min，48%A→60%A;67～76 min，60%A→61%A;76～78 min，61%A→85%A;78～95 min，85%A→98%A;95～105 min，98%A）;柱溫為30 ℃，流速為1.0 mL/min;檢測波長為217 nm;進樣量為10 μL。

2.4 HPLC指紋圖譜的建立及分析

2.4.1 精密度試驗 取同一供試品溶液（樣品編號為S1），按“2.3”項下色譜條件連續(xù)進樣測定6次，記錄峰面積。以1號峰（五味子醇甲）為參照峰，計算得各共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于3%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.4.2 重復性試驗 取同一五味子干燥品（樣品編號為S1）粉末6份，每份約5 g，精密稱定，分別按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，然后按“2.3”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以1號峰（五味子醇甲）為參照峰，計算得各共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于3%（n=6），表明本方法的重復性較好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液（樣品編號為S1），分別于室溫下放置0、4、8、12、18、24 h時按“2.3”項下條件進樣測定，記錄峰面積。以1號峰（五味子醇甲）為參照峰，計算得各共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于3%（n=6），表明該供試品溶液在室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.4 指紋圖譜的生成及相似度評價 取“2.1”項下15份五味子干燥品各適量，分別按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液后，按“2.3”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。將15份五味子干燥品的色譜圖分別導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2012版）中，設置時間窗寬度為0.1 min，通過多點校正和色譜峰匹配生成樣品疊加指紋圖譜，采用中位數(shù)法生成對照指紋圖譜（R），并以對照指紋圖譜為參照對各樣品的圖譜進行相似度評價。結(jié)果顯示，15份五味子干燥品共得到7個共有峰。相似度評價結(jié)果顯示，除曬干品（S4～S6）外，其余各樣品與對照指紋圖譜的相似度均在0.900以上。這表明，不同加工方法對五味子藥材的化學成分譜產(chǎn)生了一定的影響，尤其是曬干樣品與其他方法加工樣品的成分差異相對較大。15份五味子干燥品的疊加指紋圖譜和對照指紋圖譜（R）見圖1，相似度評價結(jié)果見表2。

2.4.5 聚類分析 將15份五味子干燥品的7個共有峰峰面積除以稱樣量所得比值導入SPSS 23.0軟件中，將測量度設置成平方歐氏距離，采用組間連接聚類分析法進行聚類分析，得到聚類分析樹狀圖（圖2）。結(jié)果顯示，當平方歐氏距離為10時，15份五味子干燥品可被聚為3類：第1類包括S7～S12，即微波“殺青”后50 ℃烘干和燙漂“殺青”后50 ℃烘干的6個樣品;第2類包括S13～S15，即蒸制“殺青”后50 ℃烘干的3個樣品;第3類包括S1～S6，即曬干和50 ℃烘干的6個樣品。

2.5 五味子干燥品中7種木脂素類成分的含量測定

2.5.1 線性關系考察 精密吸取“2.2.1”項下各單一對照品貯備液適量，置于同一10 mL量瓶中，加甲醇定容，制成五味子醇甲質(zhì)量濃度分別為0.380 0、0.570 0、0.760 0、0.950 0、1.140 0 mg/mL，五味子醇乙質(zhì)量濃度分別為0.076 0、0.114 0、0.190 0、0.228 0、0.266 0 mg/mL，五味子酯甲質(zhì)量濃度分別為0.021 8、0.065 4、0.109 0、0.152 6、0.196 2 mg/mL，五味子酯乙質(zhì)量濃度分別為0.038 8、0.097 0、0.155 2、0.213 4、0.271 6 mg/mL，五味子甲素質(zhì)量濃度分別為0.078 4、0.117 6、0.196 0、0.235 2、0.274 4 mg/mL，五味子乙素質(zhì)量濃度分別為0.076 8、0.153 6、0.230 4、0.307 2、0.384 0 mg/mL，五味子丙素質(zhì)量濃度分別為0.121 2、0.202 0、0.282 8、0.363 6、0.444 4 mg/mL的系列混合對照品線性工作液。取上述線性工作液，分別按“2.3”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以各待測成分的進樣量為橫坐標（x，μg）、峰面積為縱坐標（y）進行線性回歸。結(jié)果顯示，各待測成分在其進樣量范圍內(nèi)均與其對應峰面積呈良好的線性關系（r均大于0.999 0），詳見表3。

2.5.2 精密度試驗 取“2.2.1”項下混合對照品溶液，按“2.3”項下色譜條件連續(xù)進樣測定5次，記錄峰面積。結(jié)果顯示，五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子酯乙、五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素峰面積的RSD分別為0.98%、1.12%、1.36%、1.34%、1.28%、1.01%、1.89%（n=5），均小于2.00%，表明儀器精密度良好。

2.5.3 重復性試驗 精密稱取五味子干燥品粉末（樣品編號為S1）6份，每份5 g，分別按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，然后按“2.3”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并根據(jù)“2.5.1”項下標準曲線計算各成分的含量。結(jié)果顯示，五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子酯乙、五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素含量的RSD分別為0.91%、0.86%、1.77%、1.37%、0.99%、1.62%、1.83%（n=6），均小于2.00%，表明該方法的重復性較好。

2.5.4 穩(wěn)定性試驗 取供試品溶液（樣品編號為S1）適量，分別于室溫下放置0、4、8、12、16、20、24 h時按“2.3”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果顯示，五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子酯乙、五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素峰面積的RSD分別為0.68%、0.84%、2.06%、1.43%、1.22%、1.71%、1.60%（n=7），表明該供試品溶液在室溫下放置24 h穩(wěn)定性良好。

2.5.5 加樣回收率試驗 精密稱定已知含量的五味子干燥品粉末（樣品編號為S7）1 g，共6份，分別按約1 ∶ 1（m/m）精密加入各對照品（加入按“2.2.1”項下方法制備的單一對照品溶液），按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，然后按“2.3”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率。結(jié)果顯示，五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子酯乙、五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素的平均加樣回收率分別為99.41%、101.28%、100.72%、100.40%、100.22%、100.26%、101.42%，RSD分別為0.63%、1.40%、2.02%、1.40%、2.23%、1.83%、2.25%（n=6），表明本方法的準確度較好，詳見表4。

2.5.6 含量測定 分別取15份五味子干燥品粉末（過三號篩）各約5 g，精密稱定，每個樣品平行稱定3份。各樣品分別按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，然后按“2.3”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，根據(jù)“2.5.1”項下標準曲線計算7種木脂素類成分的含量及其總和。采用GraphPad Prism 8.0軟件進行統(tǒng)計分析，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Dunnet檢驗，檢驗水準α=0.05。結(jié)果顯示，五味子50 ℃烘干和曬干樣品中7種木脂素成分的總含量差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）;微波“殺青”后50 ℃烘干、燙漂“殺青”后50 ℃烘干和蒸制“殺青”后50 ℃烘干樣品中7種木脂素類成分的總含量均顯著高于50 ℃烘干和曬干樣品（P<0.01）。不同干燥方法所得五味子樣品中7種木脂素類成分的含量測定結(jié)果見表5。

3 討論

在中藥材的初加工過程中采用“殺青”方法進行處理已不鮮見。研究發(fā)現(xiàn)，“殺青”可以使中藥材中分解代謝物的相關酶失活，從而影響藥材中初級和次級代謝產(chǎn)物含量的高低和存在方式[5，8]。比如，賈金萍等[9]利用核磁共振氫譜代謝組學技術研究了青翹初加工過程中“殺青”對其代謝輪廓的影響，發(fā)現(xiàn)“殺青”這一過程可有效避免連翹中苯乙醇苷類成分（如連翹酯苷A等）、木脂素類成分（如連翹苷等）、黃酮類成分（如蘆丁等）以及一些初級代謝產(chǎn)物（如蔗糖等）被酶解;苗遠晴等[10]研究發(fā)現(xiàn)，“打頂”后微波“殺青”可明顯提高初花期和盛花期肉蓯蓉中松果菊苷和毛蕊花糖苷的總保留量;宋健等[11]研究發(fā)現(xiàn)，“殺青”和烘干的金銀花中綠原酸和木犀草苷的含量均比鮮品曬干和鮮品陰干的樣品高。

安開龍等[12]曾以11種木脂素類成分和5-羥甲基糠醛（5-HMF）的含量為指標，采用真空冷凍干燥、陰干、曬干、不同溫度（40、50、55 ℃）熱風烘干、不同溫度（45、55 ℃）真空干燥的方法對五味子鮮果進行處理。結(jié)果顯示，45 ℃真空干燥樣品中五味子醇甲和11種木脂素類成分的總含量最高、有害成分5-HMF的含量較低，50 ℃熱風烘干的樣品次之，但差別不大。根據(jù)上述研究結(jié)果，筆者從成本、成分含量和實用性方面進行綜合分析后，認為五味子可采用50 ℃烘干的方法進行處理。因此，本研究分別以50 ℃烘干和傳統(tǒng)干燥方式——曬干的樣品為對照，通過HPLC指紋圖譜、聚類分析和7種主要木脂素類成分含量的變化來考察“殺青”處理對五味子藥材品質(zhì)的影響。

筆者通過HPLC指紋圖譜和聚類分析發(fā)現(xiàn)，曬干樣品與其他干燥方法處理的樣品間的指紋圖譜相似性有較大差異，說明初加工方法的不同能使五味子藥材的化學成分譜產(chǎn)生一定改變。進一步進行定量分析發(fā)現(xiàn)，先“殺青”再干燥處理的五味子樣品中7種木脂素類成分的總含量顯著高于50 ℃烘干和曬干樣品，尤以燙漂“殺青”后烘干的樣品中總含量相對較高;而50 ℃烘干和曬干樣品中7種木脂素類成分總含量差異不大。關于燙漂“殺青”后烘干樣品中7種木脂素類成分的總含量較微波和蒸制“殺青”后烘干樣品相對較高，筆者認為可能原因如下：燙漂能夠快速破壞五味子鮮果中內(nèi)源酶的活性，減少干燥過程中內(nèi)源酶對五味子內(nèi)含物質(zhì)的分解和消耗;微波和蒸制“殺青”雖然同樣能使五味子鮮果中的內(nèi)源酶失活，但是處理時間相對較長，這亦會破壞五味子中木脂素類成分的穩(wěn)定。關于50 ℃烘干樣品與曬干樣品中7種木脂素類成分總含量差異無統(tǒng)計學意義，筆者分析可能原因如下：雖然50 ℃烘干較曬干的耗時相對較短，但是這一溫度也會在一定程度上增加果實中內(nèi)源酶的活性，從而加劇干燥初期果實組織的呼吸活動，最終導致五味子內(nèi)含物質(zhì)的分解和消耗[13]。

綜上所述，本研究結(jié)合HPLC指紋圖譜、聚類分析和7種木脂素類成分的定量分析結(jié)果，初步證實了先采用燙漂、微波等方法“殺青”后再干燥處理的五味子樣品的品質(zhì)要優(yōu)于直接曬干和烘干的樣品。本研究后期擬通過多組學聯(lián)合分析方法進一步深入研究五味子鮮果采后“殺青”對藥材品質(zhì)的影響，并結(jié)合加工成本與實際收益綜合考量是否在五味子鮮果的初加工過程中加入“殺青”這一環(huán)節(jié)。

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（收稿日期：2021-06-10 修回日期：2021-09-14）

（編輯：林 靜）