不同炮制方法對紫蘇子中咖啡酸、迷迭香酸、木犀草素和芹菜素含量變化的影響*

史勤怡，張倩玉，劉 莉，曾 超，劉金花

（1.徐州市兒童醫(yī)院，江蘇 徐州 221002；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣西 南寧 530023）

紫蘇子為紫蘇Perilla frutescens (L.) Britt.的干燥成熟果實(shí)，在臨床使用上多用于紫蘇子的炮制品[1-2]。在臨床上，生紫蘇子用于腸燥便秘，而炒紫蘇子緩和辛散，多用于人的咳喘[3-4]。紫蘇子炒制前后藥性和藥理作用均有不同程度的變化，說明炒制前后其成分含量和種類有可能發(fā)生了改變?？Х人釋儆诒揭蚁┧犷惢衔?，在多種植物中存在，主要的藥理作用包括調(diào)節(jié)免疫、保護(hù)心血管和降血糖等作用[5]；迷迭香酸具有抗炎、免疫抑制等藥理作用[6-9]；木犀草素為黃酮類化合物，主要的藥理作用有抗炎、抗菌、抗過敏等[10-11]；芹菜素也為黃酮類化合物，具有抗炎、抗腫瘤和機(jī)體免疫調(diào)節(jié)等藥理作用[12-15]。目前，對紫蘇子不同炮制品活性成分含量變化的研究未見報道。筆者以紫蘇子不同炮制品中的4種活性成分（咖啡酸、迷迭香酸、木犀草素和芹菜素）為測定的目標(biāo)成分，采用HPLC法測定紫蘇子不同炮制品化學(xué)成分含量的變化，為進(jìn)一步對紫蘇子不同炮制品的質(zhì)量變化和藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供參考依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 1260-П高效液相色譜儀（安捷倫科技有限公司）；電子分析天平[賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司，十萬分之一]；超聲清洗器（KQ3200DE型，昆山市超聲儀有限公司）；分析天平[Practum224-1CN型，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司]；高速臺式離心機(jī)（TGL-16G型，上海安亭科學(xué)儀器廠）；電熱恒溫水浴鍋（HWS-26型，上海齊欣科學(xué)儀器有限公司）；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（DHG-9203A型，上海齊欣科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 藥材及試劑 紫蘇子藥材采摘于廣西桂林市龍勝縣，經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院主任中藥師曾超鑒定，紫蘇子為紫蘇Perilla frutescens (L.) Britt.的干燥成熟果實(shí)。紫蘇子不同炮制品，在實(shí)驗(yàn)室自行炮制；因?qū)嶒?yàn)研究需要，紫蘇子的炮制方法分為陰干炮制、烘干炮制（60℃）、烘干炮制（80℃）、清炒炮制和微波炮制（12 min），按照《中華人民共和國藥典》（2020年版）進(jìn)行相關(guān)檢查，結(jié)果均符合規(guī)定。乙腈（Merck色譜純），甲醇（分析純，天津市進(jìn)豐化工有限公司），水為超純水。對照品信息見表1。

表1 對照品信息

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：Thermo ODS-2 Hypersil（4.6 mm×250 mm，5 μm），以乙腈-0.1%磷酸水溶液為流動相，洗脫程序?yàn)樘荻认疵摚ㄒ姳?），咖啡酸、迷迭香酸、木犀草素和芹菜素的檢測波長分別為320、330、350和340 nm，流速為1.0 mL/min，柱溫為30 ℃，進(jìn)樣量為10 μL，色譜柱的理論塔板數(shù)按迷迭香酸峰計算應(yīng)不低于3 000。4個成分都能達(dá)到較好分離，分離度R＞1.5，樣品中其它成分對測定成分無干擾。按照上述條件各組分分離度良好。（見圖1）

圖1 紫蘇子HPLC 圖

表2 梯度洗脫表

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 分別精密稱取咖啡酸、迷迭香酸、木犀草素和芹菜素對照品各適量，加70%甲醇使溶解，配制成每1 mL分別含咖啡酸82.75 μg、迷迭香酸1 925.28 μg、木犀草素152.24 μg、芹菜素112.68 μg的混合對照品溶液，備用。

2.2.2 供試品溶液的制備 精密稱定中藥紫蘇子藥材樣品粗粉約1.0 g，放至具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇25 mL后，稱其重量，然后水浴回流提取藥材1 h后取出，放至室溫，再次稱重，如果重量減少就使用70%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，用0.45 μm濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.2.1”項下配制好的混合對照品溶液0.3、1.0、3.0、5.0、9.0 mL，至10 mL棕色容量瓶中，然后加入70%甲醇溶液至刻度，輕輕搖勻，即配得一系列混合對照品溶液。按照“2.1”項下的色譜條件，分別注入一系列的混合對照品溶液進(jìn)高效液相色譜儀中，測定并記錄對應(yīng)成分的峰面積。以各成分的質(zhì)量濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)，各成分的峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，繪制各成分的線性方程，即得線性回歸方程和對應(yīng)的相關(guān)系數(shù)（見表3）。結(jié)果表明，咖啡酸、迷迭香酸、木樨草素和芹菜素在對應(yīng)成分濃度范圍之內(nèi)成良好的線性關(guān)系。

表3 紫蘇子中各成分的線性回歸方程

2.3.2 精密度試驗(yàn) 按照“2.1”項下的色譜條件，精密吸取“2.2.1”項下的混合對照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，然后分別記錄各活性成分對應(yīng)的峰面積，并計算混合對照品中咖啡酸、迷迭香酸、木犀草素和芹菜素峰面積的RSD值。由測得的峰面積計算混合對照品中咖啡酸、迷迭香酸、木犀草素和芹菜素峰面積的RSD值，即RSD值分別為0.62%、0.35%、0.94%、0.72%，均小于3.0%，表明所用液相色譜儀的精密度較好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取陰干炮制品紫蘇子粗粉1.0 g，精密稱定，按照“2.2.2”項下的方法制備供試品溶液，然后分別在供試品溶液制備后0、2、4、8、12、24 h，按照“2.1”項下色譜條件分別依法測定對應(yīng)成分并記錄對應(yīng)成分的峰面積。結(jié)果計算得紫蘇子中的咖啡酸、迷迭香酸、木犀草素和芹菜素峰面積的RSD值，即RSD值分別為2.08%、0.97%、1.62%、1.86%，均小于3.0%，說明供試品溶液24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.4 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取中藥紫蘇子不同炮制品藥材粗粉1.0 g，每種紫蘇子炮制品稱取6份，按照“2.2”項下的供試品制備方法制備供試品溶液，按“2.1”項下條件測定各供試品的峰面積，計算紫蘇子不同炮制品中咖啡酸、迷迭香酸、木犀草素和芹菜素的平均含量。結(jié)果測得陰干炮制品中的咖啡酸、迷迭香酸、木犀草素和芹菜素平均藥材含量分別為0.149 6、3.019 0、0.237 3、0.153 6 mg/g；烘干炮制品（60 ℃）中的咖啡酸、迷迭香酸、木犀草素和芹菜素平均藥材含量分別為0.136 5、2.915 2、0.231 9、0.155 8 mg/g；烘干炮制品（80 ℃）中的咖啡酸、迷迭香酸、木犀草素和芹菜素平均藥材含量分別為0.135 9、2.811 2、0.231 5、0.156 8 mg/g；清炒炮制品中的咖啡酸、迷迭香酸、木犀草素和芹菜素平均藥材含量分別為0.115 7、2.751 9、0.241 0、0.169 6 mg/g；微波炮制品（12 min）中的咖啡酸、迷迭香酸、木犀草素和芹菜素平均藥材含量分別為0.140 9、2.988 5、0.234 9、0.161 7 mg/g。

結(jié)果計算得陰干炮制品中的咖啡酸、迷迭香酸、木犀草素和芹菜素藥材含量的RSD分別為1.42%、0.91%、1.57%、0.85%；烘干炮制品（60 ℃）中的咖啡酸、迷迭香酸、木犀草素和芹菜素藥材含量的RSD分別為0.98%、0.75%、1.08%、0.96%；烘干炮制品（80 ℃）中的咖啡酸、迷迭香酸、木犀草素和芹菜素藥材含量的RSD分別為1.51%、1.02%、1.45%、0.90%；清炒炮制品中的咖啡酸、迷迭香酸、木犀草素和芹菜素藥材含量的RSD分別為1.14%、1.52%、1.08%、1.39%；微波炮制品（12 min）中的咖啡酸、迷迭香酸、木犀草素和芹菜素藥材含量的RSD分別為1.82%、1.37%、0.98%、1.25%。其RSD值均小于3.0%，結(jié)果表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.5 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取同一批次不同炮制品紫蘇子藥材粗粉，即陰干炮制品、烘干炮制品（60 ℃）、烘干炮制品（80 ℃）、清炒炮制品、微波炮制品（12 min），藥材粗粉各6份每份0.5 g，加入適量的咖啡酸、迷迭香酸、木犀草素和芹菜素對照品，按照“2.2.2”項下的方法制備成供試品溶液，按照“2.1”項下條件測定，根據(jù)線性方程，分別計算陰干炮制品、烘干炮制品（60 ℃）、烘干炮制品（80 ℃）、清炒炮制品和微波炮制品（12 min）紫蘇子中的咖啡酸、迷迭香酸、木犀草素和芹菜素活性成分的平均回收率和對應(yīng)的RSD值。

結(jié)果計算得陰干炮制品中的咖啡酸、迷迭香酸、木犀草素和芹菜素活性成分的平均加樣回收率分別為100.31%、97.95%、101.02%、98.96%，其RSD分別為1.69%、2.45%、1.72%、2.88%；烘干炮制品（60 ℃）中的咖啡酸、迷迭香酸、木犀草素和芹菜素活性成分的平均加樣回收率分別為99.40%、98.83%、100.14%、97.98%，其RSD分別為1.78%、2.07%、2.40%、1.56%；烘干炮制品（80 ℃）中的咖啡酸、迷迭香酸、木犀草素和芹菜素活性成分的平均加樣回收率分別為98.62%、99.65%、98.81%、99.84%，其RSD分別為1.25%、2.32%、1.58%、1.91%；清炒炮制品中的咖啡酸、迷迭香酸、木犀草素和芹菜素活性成分的平均加樣回收率分別為98.72%、101.27%、99.35%、98.62%，其RSD分別為2.19%、1.87%、2.82%、1.75%；微波炮制品（12 min）中的咖啡酸、迷迭香酸、木犀草素和芹菜素活性成分的平均加樣回收率分別為99.83%、98.61%、102.06%、97.98%，其RSD分別為2.73%、1.80%、1.92%、2.26%。其RSD值均小于3.0%，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該方法準(zhǔn)確性良好。

2.4 樣品含量測定 分別稱取紫蘇子不同炮制品藥材粗粉各3份，每份1.0 g，按照“2.2.2”項下的方法制備供試品溶液，按照“2.1”項下的色譜條件測定紫蘇子的4種活性成分，并采用線性方程計算紫蘇子中的咖啡酸、迷迭香酸、木犀草素和芹菜素的平均含量（mg/g），結(jié)果見表4。

表4 不同炮制品紫蘇子平均含量測定結(jié)果（n＝3）

3 討 論

3.1 流動相的選擇 本實(shí)驗(yàn)采用HPLC法測定紫蘇子不同炮制品中的咖啡酸、迷迭香酸、木犀草素和芹菜素活性成分含量，考察了洗脫程序所使用的流動相，實(shí)驗(yàn)考察中發(fā)現(xiàn)流動相中加入不同種類的有機(jī)酸對4種活性成分的峰型和分離度有一定的影響。本試驗(yàn)采用甲醇-0.1%冰醋酸、乙腈-0.1%冰醋酸、甲醇-0.1%磷酸、乙腈-0.1%磷酸、甲醇-0.2%冰醋酸等流動相進(jìn)行試驗(yàn)考察，結(jié)果說明乙腈-0.1%磷酸作為流動相梯度洗脫，紫蘇子中的咖啡酸、迷迭香酸、木犀草素和芹菜素的峰型和分離效果較好，目標(biāo)成分與雜峰達(dá)到基線分離。因此可以推測本實(shí)驗(yàn)方法快速穩(wěn)定、簡便、重復(fù)性好等，可用于中藥紫蘇子藥材的提取、工藝優(yōu)化及其藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)等相關(guān)研究。

3.2 波長的選擇 中藥方劑成分復(fù)雜，本實(shí)驗(yàn)采用HPLC法測定5種不同炮制品的紫蘇子中的4種活性成分的含量，通過前期預(yù)試驗(yàn)，試驗(yàn)考察了流動相、柱溫、流速等外部因素，從實(shí)驗(yàn)結(jié)果中選擇峰型較好，基線較平穩(wěn)，分離度較好的實(shí)驗(yàn)色譜條件。對于本試驗(yàn)?zāi)繕?biāo)成分波長的選擇，是考慮到中藥紫蘇子中4個活性成分的最佳紫外吸收，使被測的活性成分都有較好的紫外吸收，通過試驗(yàn)比較后發(fā)現(xiàn)，中藥紫蘇子中的活性成分咖啡酸、迷迭香酸、木犀草素和芹菜素分別在320 nm、330 nm、350 nm和340 nm波長下有較好的紫外吸收，因此試驗(yàn)選擇波長切換法測定不同炮制品紫蘇子中4種活性成分的含量，此試驗(yàn)方法操作簡單、測定速度快、儀器靈敏度高，對中藥紫蘇子藥材的質(zhì)量控制有一定的參考價值，對于其它中藥材的質(zhì)量分析控制也有一定的指導(dǎo)作用。

3.3 柱溫、流速的選擇 本實(shí)驗(yàn)通過考察4種不同柱溫20 ℃、25 ℃、30 ℃和35 ℃對分離度、出峰時間及基線的影響，經(jīng)過分析色譜峰可知，柱溫影響較小，因此本試驗(yàn)柱溫采用30 ℃；同時研究者還考察3種不同的流速0.8 mL/min、1.0 mL/min、1.2 mL/min對分離度和基線的影響，色譜圖直觀顯示當(dāng)流速為1.0 mL/min時，其分離度較好，基線也較平衡，故本試驗(yàn)采用的流速為1.0 mL/min。

3.4 結(jié)果分析 根據(jù)含量測定結(jié)果可知，5種不同干燥及炮制方法制備的紫蘇子樣品中咖啡酸、迷迭香酸、木犀草素、芹菜素的含量分別為0.116 0～0.150 6 mg/g、2.752 6～3.032 5 mg/g、0.221 9～0.240 5 mg/g、0.153 2～0.170 2mg/g，其中陰干炮制品樣品中咖啡酸、迷迭香酸含量最高，分別為0.150 6 mg/g、3.032 5 mg/g，清炒炮制品樣品中木犀草素、芹菜素含量最高，分別為0.2405mg/g、0.170 2 mg/g。5種不同干燥及炮制方法制備的紫蘇子樣品中4種成分的含量具有一定的差異，這可能與藥材的炮制方法或者干燥方法有關(guān)，有待進(jìn)一步研究。綜上，本研究建立的5種不同干燥及炮制方法制備的紫蘇子樣品中4個成分的含量測定方法穩(wěn)定可靠，可為其質(zhì)量控制提供參考，也為其中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供借鑒。

3.5 小結(jié) 本實(shí)驗(yàn)建立了高效液相色譜法測定紫蘇子不同炮制品中的4種活性成分咖啡酸、迷迭香酸、木犀草素和芹菜素含量的方法，可用于比較不同炮制品有效成分的含量差異，該方法為闡明紫蘇子不同炮制品的藥理作用機(jī)制的研究提供科學(xué)依據(jù)，為提高中藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供指導(dǎo)，可作為紫蘇子及其不同炮制品的質(zhì)量控制方法，以及擴(kuò)大到其它中藥材及其炮制品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。