柱前衍生-高效液相色譜法比較使君子果實(shí)與種仁炮制前后使君子氨酸的含量*

廖佳慧，楚洪軍，謝 瑞，許詩(shī)怡，游元元,2

（1.成都醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，四川 成都 610500；2.四川省高校結(jié)構(gòu)特異性小分子藥物研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610500）

使君子為使君子科植物使君子Quisqualis indica L.的干燥成熟果實(shí)，具有殺蟲(chóng)、健脾、止瀉等功效，李時(shí)珍評(píng)價(jià)其為“小兒諸病要藥”[1-2]。2020年版《中華人民共和國(guó)藥典》（下簡(jiǎn)稱(chēng)《中國(guó)藥典》）使君子項(xiàng)下有果實(shí)與種仁兩個(gè)藥用部位，有生用與炒用兩種用法[3]。呂文海等[4]研究發(fā)現(xiàn)使君子的果實(shí)與種仁化學(xué)成分差異較大，而加熱前后也有明顯的含量及效用區(qū)別，提示使君子以不同部位及制法入藥時(shí)其化學(xué)組分并不一致，進(jìn)而影響臨床療效?，F(xiàn)行《中國(guó)藥典》僅以胡蘆巴堿作為使君子的唯一含量測(cè)定指標(biāo)，且無(wú)論果實(shí)或種仁、生品或炮制品皆為同一含量限度要求，但胡蘆巴堿本身的生理活性與使君子的功效并不吻合[5]，故現(xiàn)行使君子質(zhì)量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)值得商榷。

使君子中含有的使君子氨酸（quisqualic acid，QA）有明確的驅(qū)殺蛔蟲(chóng)、蟯蟲(chóng)、絳蟲(chóng)等腸道寄生蟲(chóng)的作用[6-8]，與藥材的驅(qū)蟲(chóng)功效相符，可將QA作為質(zhì)量標(biāo)志物對(duì)藥材進(jìn)行品質(zhì)評(píng)價(jià)。QA為非蛋白氨基酸，基本無(wú)紫外吸收，難以直接用HPLC-UV法進(jìn)行檢測(cè)，但被衍生化后則生成紫外吸收較強(qiáng)的衍生物，故可采用柱前衍生-高效液相色譜（Pre-column derivatization HPLC）法對(duì)QA進(jìn)行分析[9-10]。本研究以2,4-二硝基氯苯為衍生劑，建立了使君子中QA的柱前衍生-高效液相色譜含量測(cè)定方法，并對(duì)15批市售使君子不同入藥部位及炮制前后的QA含量進(jìn)行測(cè)定和比較，以期為完善該藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 LC-20at高效液相色譜儀，包括紫外檢測(cè)器、Lcsolution色譜工作站（日本島津公司）；XPE26電子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；SK250H超聲波清洗器（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司）；HH-4水浴鍋（北京中興偉業(yè)儀器有限公司）；GL-16冷凍離心機(jī)（四川蜀科儀器有限公司）。

1.2 試藥 使君子氨酸（南京沛微生物科技有限公司，批號(hào)：TRCW150707，純度＞97%）；15批使君子藥材分別購(gòu)自于成都荷花池中藥材市場(chǎng)、飲片公司及網(wǎng)絡(luò)渠道，經(jīng)成都醫(yī)學(xué)院中藥學(xué)教研室游元元教授鑒定為使君子科植物使君子Quisqualis indica L.的成熟果實(shí)，樣品信息見(jiàn)表1。甲醇為色譜純，水為超純水，其他所用試劑均為分析純。

表1 樣品信息

2 方法與結(jié)果

2.1 使君子不同樣品的制備 取15批市售使君子，每批部分去除果殼后得種仁。分別取果實(shí)與種仁適量，按2020年版《中國(guó)藥典》四部“炮制通則”中清炒法與面煨法處理。得到15批藥材兩個(gè)藥用部位（果實(shí)與種仁）各3種制品（生品、清炒品、煨制品），分別粉碎、過(guò)篩，備用。

2.2 色譜條件 采用Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動(dòng)相為0.2%磷酸鹽水溶液（A）-甲醇（B），以1 mL/min的流速進(jìn)行梯度洗脫（0～8 min，5%B→15%B；8～15 min，15%B→20%B；15～22 min，20%B→30%B；22～30 min，30%B→38%B；30～35 min，38%B→38%B），檢測(cè)波長(zhǎng)為360 nm，柱溫為30 ℃，進(jìn)樣量為10 μL。

2.3 對(duì)照品溶液的制備 取使君子氨酸對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，加水制成每1 mL含0.42 mg的對(duì)照品儲(chǔ)備溶液。精密量取對(duì)照品儲(chǔ)備溶液1 mL置試管中，加入0.05 mol/L 2，4-二硝基氯苯溶液3 mL，再加入0.01 mol/L硼砂緩沖液適量，搖勻，于80 ℃水浴條件下加熱30 min，冷卻至室溫，轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，用硼砂緩沖液稀釋至刻度，4 ℃9 000/min離心10 min，上清液用0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.4 供試品溶液的制備 取使君子樣品粉末約0.25 g，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，加入石油醚10 mL，浸泡15 min，濾去溶劑，于脫脂后的粉末中精密加入水10 mL，室溫浸提30 min，離心10min，濾過(guò)，精密量取續(xù)濾液1mL置試管中，加入0.05 mol/L 2，4-二硝基氯苯溶液3 mL，再加入0.01 mol/L硼砂緩沖液適量，于80 ℃水浴條件下加熱30 min，冷卻至室溫，轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，用硼砂緩沖液稀釋至刻度，4 ℃9 000/min離心10 min，上清液用0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.5 陰性對(duì)照品溶液的制備 按本品處方比例，制備不含使君子氨酸的陰性對(duì)照品。

2.6 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 取對(duì)照品、供試品及陰性對(duì)照樣品溶液，按照“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖1。使君子氨酸衍生物與相鄰色譜峰分離良好，理論塔板數(shù)不低于20 000。

圖1 各成分HPLC 圖譜

2.7 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.3”項(xiàng)下對(duì)照品儲(chǔ)備溶液適量，按“2.3”項(xiàng)下方法自“置試管中，加0.05 mol/L 2，4-二硝基氯苯溶液3 mL”步驟起操作，依次配置8個(gè)不同濃度的系列濃度溶液，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，測(cè)定峰面積。分別以QA對(duì)照品峰面積Y為縱坐標(biāo)，QA對(duì)照品濃度X為橫坐標(biāo)，繪制工作曲線，計(jì)算回歸方程。結(jié)果顯示QA在3.2～420.0 μg/mL范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系，回歸方程為Y=1 367.4X-4 494.3（r=0.999 7）。

2.8 檢測(cè)限和定量限的考察 取“2.3”項(xiàng)下對(duì)照品儲(chǔ)備溶液適量，加水逐級(jí)稀釋后按“2.3”項(xiàng)下方法從“置試管中，加0.05 mol/L 2，4-二硝基氯苯溶液3 mL”步驟起操作，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣并記錄色譜圖。經(jīng)計(jì)算QA的檢測(cè)限（S/N=3）為1 μg，定量限（S/N=10）為3 μg。

2.9 精密度試驗(yàn) 精密吸取“2.3”項(xiàng)下對(duì)照品溶液，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積并計(jì)算其RSD。QA峰面積的RSD為0.14%，表明儀器精密度良好。

2.10 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份使君子種仁生品供試品溶液，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件分別于0、2、4、6、12、24 h進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)定峰面積并計(jì)算RSD。QA峰面積的RSD為1.78%，表明樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.11 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批使君子種仁生品粉末5份，每份約0.25 g，精密稱(chēng)定，按照“2.4”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，按回歸方程計(jì)算QA含量及RSD。QA的平均含量為1.43 mg/g，RSD為1.18%，表明該方法的重復(fù)性良好。

2.12 加樣回收試驗(yàn) 取同一批使君子種仁生品粉末9份，每份約0.25 g，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，分為低、中、高3組，分別加入5.26 mg/mL的QA對(duì)照品溶液150、300、400 μL，按照“2.4”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按色譜條件進(jìn)樣測(cè)定并計(jì)算回收率。QA的平均回收率為101.95%，RSD為2.21%，表明該方法的加樣回收率良好，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=9）

2.13 樣品測(cè)定 取15批使君子果實(shí)與種仁的生品、清炒品及煨制品，按照“2.4”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，按回歸方程計(jì)算QA含量，結(jié)果見(jiàn)表3、圖2～4。表明果實(shí)中QA含量均低于相同處理方式的種仁中QA含量，QA含量的趨勢(shì)為生品＞清炒品＞煨制品。

表3 使君子不同樣品中QA 含量測(cè)定結(jié)果

圖2 生用果實(shí)與種仁QA 含量比較

圖3 果實(shí)炮制前后QA 含量比較

圖4 種仁炮制前后QA 含量比較

3 討 論

中藥質(zhì)量標(biāo)志物是指存在于中藥材和中藥產(chǎn)品中固有的或加工制備過(guò)程中形成的，與中藥的功能屬性密切相關(guān)且能夠反映中藥安全性和有效性的標(biāo)示性化學(xué)物質(zhì)[11]。文獻(xiàn)報(bào)道QA為使君子驅(qū)蟲(chóng)的主要有效成分，可以在一定程度上表征藥材的品質(zhì)，符合質(zhì)量標(biāo)志物的要求。

本實(shí)驗(yàn)采用了柱前衍生-高效液相色譜法對(duì)QA進(jìn)行含量測(cè)定。在同樣采用此法進(jìn)行QA含量測(cè)定的文獻(xiàn)報(bào)道中[12]，使君子樣品需回流法脫脂3次后再用水處理3 h，繁瑣而費(fèi)時(shí)，而本實(shí)驗(yàn)方法的樣品前處理更簡(jiǎn)單方便。衍生過(guò)程中，文獻(xiàn)方法需使用6種試劑進(jìn)行衍生，按文獻(xiàn)提示操作重復(fù)實(shí)驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)衍生并不完全，而本法的衍生過(guò)程只需3種試劑，衍生效果較理想。文獻(xiàn)方法的色譜條件中水相的pH值為9.2，不利于色譜柱的使用和保存，本法的水相pH值為7.6，適用于大多數(shù)C18柱。

15批市售使君子藥材果實(shí)中的QA含量均低于種仁?！端幮源衷u(píng)》記載[13]：使君子以果實(shí)及種仁入藥的情況均存在，但以種仁入藥最為多見(jiàn)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果佐證了使君子種仁入藥為主的合理性。無(wú)論果實(shí)或種仁，加熱炮制后QA含量均有下降，且加熱程度越劇烈，QA的下降程度越大。推測(cè)原因?yàn)樗幉闹羞€存在其他種類(lèi)的氨基酸，與QA共存時(shí)遇熱會(huì)發(fā)生聚合反應(yīng)[14]；藥材中的葡萄糖、果糖等還原糖還可能在加熱條件下與QA發(fā)生美拉德反應(yīng)[15]。故以驅(qū)蟲(chóng)為主要治療目標(biāo)時(shí)，使君子藥材的炮制加熱程度應(yīng)注意掌握。

15批使君子樣品中的QA含量有較明顯差異，以生品果實(shí)為例，不同批次間QA含量可相差近5倍。推測(cè)是儲(chǔ)存時(shí)間、儲(chǔ)存條件的差異影響了藥材的品質(zhì)。

本研究將與使君子功效密切相關(guān)的化合物QA作為質(zhì)量標(biāo)志物，建立了測(cè)定其含量的柱前衍生-高效液相色譜法。該方法操作簡(jiǎn)便，衍生化完全，方法學(xué)考察結(jié)果良好，為完善使君子質(zhì)量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)提供了參考。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示種仁中的QA含量高于果實(shí)，而經(jīng)加熱炮制后QA含量有所下降，這為使君子入藥部位及制法的合理選擇提供了依據(jù)。