黑糌粑功效成分花青素及抗氧化性的分析

◎ 扎西窮達(dá)，曹葉偉，朱肖翔，次仁卓嘎，尼 珍

（西藏自治區(qū)食品藥品檢驗(yàn)研究院，西藏 拉薩 850000）

黑糌粑是用黑青稞炒熟后磨成粉狀，是西藏傳統(tǒng)特色食品，黑糌粑營(yíng)養(yǎng)豐富，風(fēng)味獨(dú)特[1]。目前，對(duì)黑糌粑的分析研究主要集中在對(duì)其中基礎(chǔ)營(yíng)養(yǎng)成分的測(cè)定研究，而對(duì)關(guān)鍵功能特性和功能物質(zhì)，特別是對(duì)一些顏色較深的黑糌粑中花青素總量等研究報(bào)道很少，本研究中選取與黑糌粑功能及作用相關(guān)的重要理化指標(biāo)進(jìn)行分析，為黑糌粑的品質(zhì)分析提供參考依據(jù)。

黑糌粑作為藏區(qū)人們食用的重要主食之一，能為食用者提供能量，還能提供提高免疫力等作用的功能因子[2]，因此，針對(duì)黑糌粑具有降血脂、降血糖、抗氧化和抗癌等輔助功效，分別選取花青素含量、抗氧化性指標(biāo)進(jìn)行分析。

1 材料與方法

1.1 材料

拉薩堆龍古榮黑糌粑（7批）、山南隆子加玉黑糌粑（6批），共13批。

1.2 試劑

超純水、Tris-HCl、鄰苯三酚、磷酸緩沖液、過(guò)氧化氫、氫氧化鈉、乙二胺四乙酸二鈉、十二水合硫酸鐵銨、鹽酸、正丁醇、乙醇，除另有說(shuō)明外，所有試劑均為分析純；原花青素標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品（純度＞98%）；甲酸、甲醇、乙腈為色譜純。

1.3 儀器

液相色譜儀，配有二極管陣列檢測(cè)器；TU-1810D紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；Scilogex MX-S渦旋混合器；電子天平，感量為0.000 1 g；離心機(jī)，轉(zhuǎn)速可達(dá)8 000 r·min-1以上；超低溫冰箱，（-80±5）℃；超聲波清洗器，40 kHz；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，帶有溫度控制；控溫磁力攪拌器，帶有溫度控制。

1.4 方法

1.4.1 樣品中總花青素的含量

（1）溶液的配制。標(biāo)準(zhǔn)溶液：稱取原花青素對(duì)照品1.5 mg，甲醇溶解稀釋至5 mL，制成0.3 mg·mL-1原花青素標(biāo)準(zhǔn)溶液。2.0%硫酸鐵銨溶液：精密稱取硫酸鐵銨0.20 g，加2 mol·L-1鹽酸溶液溶解并稀釋至10 mL，搖勻。5%鹽酸/正丁醇溶液：于100 mL容量瓶中加入約2/3的正丁醇，精密加入鹽酸5.0 mL，用正丁醇溶解至刻度。

（2）測(cè)定。①標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：分別精密吸取原花青素標(biāo)準(zhǔn)溶液0.10 mL、0.25 mL、0.50 mL、1.00 mL和1.50 mL至10 mL比色管中，分別加甲醇2.90 mL、2.75 mL、2.50 mL、2.00 mL和1.50 mL，搖勻（定容到3 mL）。分別吸取上述溶液1 mL，加入6 mL的5%鹽酸/正丁醇溶液、0.2 mL的2.0%硫酸鐵銨溶液至具塞試管中，于沸水浴中加熱40 min，冰浴冷卻15 min；用1 mL甲醇、6 mL 5%鹽酸/正丁醇溶液和0.2 mL的2.0%硫酸鐵銨溶液做空白，于546 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值。②試樣制備。稱樣品充分混勻后取2.0 g于15 mL離心管中，加10.0 mL甲醇，攪拌均勻后離心，取上清液0.5 mL用甲醇稀釋至10 mL制成樣品待測(cè)液。③試樣中原花青素含量的測(cè)定。取樣品待測(cè)液1.0 mL，加入6 mL的5%鹽酸/正丁醇溶液、0.2 mL的2.0%硫酸鐵銨溶液至具塞試管中，于沸水浴中加熱40 min，冰浴冷卻15 min，分別測(cè)定其吸光度值，以空白試劑調(diào)零，根據(jù)式（1）計(jì)算樣品中原花青素的含量[3]。

式中：Xi-試樣中被測(cè)組分含量，mg·g-1；Ci-被測(cè)組分濃度，mg·mL-1；V-定容體積，mL；f-稀釋倍數(shù)；M-樣品質(zhì)量，g。

（3）儀器條件。紫外分光光度計(jì)，波長(zhǎng)為546 nm。

1.4.2 矢車菊素和矢車菊素-3-O-葡萄糖苷含量

（1）溶液的配制。單一組分標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱取標(biāo)準(zhǔn)品各5.0 mg，甲醇定容至10 mL，配制成500 mg·L-1標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，-18 ℃以下貯存，備用?；旌蠘?biāo)準(zhǔn)溶液：根據(jù)各種黃酮類物質(zhì)在儀器上的響應(yīng)值，逐一吸取一定單一體積標(biāo)準(zhǔn)溶液配制成混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，再稀釋成不同質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，用于制作標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，混合標(biāo)準(zhǔn)溶液現(xiàn)用現(xiàn)配。

（2）測(cè)定。稱取2 g試樣（精確到0.01 g）于50.0 mL棕色離心管中，加入約5 mL 80%乙醇溶液，混合，室溫下超聲30 min，3 500 r·min-1離心5 min，上清液轉(zhuǎn)入10 mL棕色容量瓶中，殘?jiān)儆眉s5 mL 80%乙醇溶液按上述步驟重復(fù)提取1次，合并2次提取液，用80%乙醇溶液定容至10.0 mL，準(zhǔn)確吸取10 mL提取液于50 mL旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中，35 ℃下減壓蒸發(fā)除去乙醇，濃縮至約3 mL。C18固相萃取小柱依次用約5 mL甲醇和約5 mL水預(yù)淋洗、活化后，將樣品提取濃縮液加至小柱中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶用5 mL水清洗，清洗液轉(zhuǎn)入小柱中，抽濾，棄除濾液。再用約8 mL甲醇分別清洗兩次，清洗液加入到小柱中，收集濾液，甲醇定容至10.0 mL，過(guò)濾膜，待測(cè)定[4]。

（3）儀器條件。高效液相色譜法配二極管陣列；檢測(cè)波長(zhǎng)：520 nm；色譜柱：C18色譜柱，柱長(zhǎng)250 mm，內(nèi)徑4.6 mm，顆粒度5 μm；流速：0.8 mL·min-1；進(jìn)樣量：10 μL；流動(dòng)相：流動(dòng)相A：20%甲酸；流動(dòng)相B：100%乙腈。洗脫梯度條件見(jiàn)表1。

表1 洗脫梯度表

1.4.3 水溶物抗氧化性

（1）樣品處理。精確稱取黑糌粑粉2.0 g于離心管中，加入20 mL超純水，渦旋混勻，超聲提取30 min，渦旋混勻，放入離心機(jī)中3 500 r·min-1離心10 min，得上層清液為樣品溶液。

（2）超氧陰離子自由基測(cè)定。取4.5 mL 0.05 mol·L-1、pH 8.2的Tris-HCl緩沖溶液于試管中，置25 ℃水浴中預(yù)熱20 min，按順序加入0.1 mL樣品，0.4 mL 2.5 mmol·L-1鄰苯三酚，混勻后在25 ℃水浴中準(zhǔn)確反應(yīng)4 min，立即用8 mol·L-1的鹽酸2滴中止反應(yīng)，測(cè)定波長(zhǎng)299 nm處的吸光值，記為A測(cè)定。以0.1 mL蒸餾水代替樣品，按同樣方法測(cè)定吸光度，記為A對(duì)照[5]，根據(jù)式（2）計(jì)算：

（3）羥自由基測(cè)定。按順序分別在試管中加入1 mL 0.15 mol·L-1、pH 7.4的磷酸緩沖液，0.5 mL樣品，1 mL 1.3%過(guò)氧化氫（新鮮配制），1 mL 0.95 mmol·L-1乙二胺四乙酸二鈉（新鮮配制），混合后在30 ℃水浴中反應(yīng)30 min后，在波長(zhǎng)550 nm處測(cè)吸收度，記為C測(cè)定?？瞻滓?.5 mL蒸餾水代替樣品，按同樣方法測(cè)定吸光度，記為C對(duì)照[6]，根據(jù)式（3）計(jì)算：

（4）儀器條件。紫外分光光度計(jì)；波長(zhǎng)：299 nm、550 nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 總花青素含量結(jié)果與分析

2.1.1 總花青素含量結(jié)果

黑糌粑具有獨(dú)特的黑紫色，這主要與其中含有花青素密切相關(guān)?；ㄇ嗨匾彩呛隰佤慰寡趸?、去除自由基功能的重要基礎(chǔ)物質(zhì)，分析黑糌粑中的花青素總量，對(duì)了解和評(píng)價(jià)黑糌粑功能特性具有重要的參考作用。對(duì)13批黑糌粑樣品已原花青素計(jì)，總花青素含量結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 黑糌粑總花青素含量表

2.1.2 總花青素含量分析

通過(guò)對(duì)黑糌粑樣品中總花青素?cái)?shù)據(jù)分析表明，總花青素含量為0.451～0.916 mg·g-1，大部分集中在0.5～0.7 mg·g-1，其中山南隆子加玉黑糌粑3總花青素含量最高，拉薩堆龍古榮黑糌粑6含量最低。按不同產(chǎn)地比較，山南隆子加玉黑糌粑的花青素含量普遍高于拉薩堆龍古榮黑糌粑（見(jiàn)圖1），不同產(chǎn)地的黑糌粑中總原花青素含量相差較大，這可能與種植環(huán)境、青稞種類及土壤等有一定的影響。

圖1 黑糌粑中總花青素含量圖

2.2 矢車菊素和矢車菊素-3-O-葡萄糖苷含量結(jié)果和分析

2.2.1 矢車菊素和矢車菊素-3-O-葡萄糖苷含量結(jié)果

花青素，是自然界一類廣泛存在于植物中的天然色素，已知花青素有20多種，食物中重要的有6種左右[7]。黑糌粑中花青素主要存在的形式為矢車菊素及其葡萄糖糖苷。對(duì)黑糌粑花青素種類矢車菊素和矢車菊素-3-O-葡萄糖苷的含量結(jié)果見(jiàn)表3。矢車菊素和矢車菊素-3-O-葡萄糖苷對(duì)照品及黑糌粑樣品色譜圖見(jiàn)圖2。

圖2 矢車菊素和矢車菊素-3-O-葡萄糖苷對(duì)照品及黑糌粑樣品色譜圖

表3 黑糌粑花青素種類及含量表

2.2.2 矢車菊素和矢車菊素-3-O-葡萄糖苷含量分析

通過(guò)表3發(fā)現(xiàn)，矢車菊素含量為0.034 4～0.046 7 mg·g-1，含量最高的樣品是山南隆子加玉黑糌粑3；矢車菊素-3-O-葡萄糖苷含量在0.008 6～0.0166 mg·g-1，含量最高的樣品還是山南隆子加玉黑糌粑3，這與總花青素含量最高結(jié)果一致，也表明黑糌粑花青素主要以矢車菊素和矢車菊素-3-O-葡萄糖苷存在，與抗氧化能力等正相關(guān)。一些樣品中矢車菊素與其糖苷含量較低，說(shuō)明這些樣品中游離形式的花青素含量低，可能與樣品的產(chǎn)地和加工方法相關(guān)。

2.3 水溶物抗氧化性含量結(jié)果與分析

2.3.1 水溶物抗氧化性含量結(jié)果

黑糌粑中含有一定量的抗氧化物質(zhì)。氧化反應(yīng)和脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)積極參與人體正常的生理生化反應(yīng)和免疫反應(yīng)，保持機(jī)體內(nèi)正常的氧化還原電勢(shì)以及在人體的新陳代謝中起著重要作用。因此，研究和評(píng)價(jià)物質(zhì)的抗氧化活性，有利于促進(jìn)人體的健康和多種疾病的預(yù)防與調(diào)控。

羥基自由基和超氧陰離子自由基是人體中能夠產(chǎn)生的重要自由基，對(duì)人體健康具有重要影響[8]，通過(guò)分析黑糌粑中水溶性物質(zhì)對(duì)這些自由基的抑制和清除效果，對(duì)了解不同種類黑糌粑產(chǎn)品的功能特性具有重要的參考價(jià)值。選取兩批拉薩堆龍古榮黑糌粑和兩批山南隆子加玉黑糌粑進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 黑糌粑水溶物抗氧化性表（單位：%）

2.3.2 水溶物抗氧化性含量分析

通過(guò)對(duì)4批黑糌粑樣品中水溶性物質(zhì)抑制人體代謝中可產(chǎn)生的羥自由基和超氧陰離子自由基能力的數(shù)據(jù)分析，結(jié)果表明，黑糌粑對(duì)羥自由基抑制率達(dá)到56.36%～89.34%，其中山南隆子加玉黑糌粑3抑制羥自由基的能力最強(qiáng)，幾種黑糌粑對(duì)羥自由基的抑制效果均比較明顯；黑糌粑對(duì)超氧陰離子自由基的抑制率達(dá)到52.95%～55.45%，其中拉薩堆龍古榮黑糌粑1對(duì)超氧陰離子自由基的抑制能力最好，但所有樣品對(duì)超氧陰離子的抑制率均低于0.15 mg·mL-1Vc標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

3 結(jié)論

黑糌粑中含有水溶性花青素、其他多酚類物質(zhì)、超氧化物歧化酶等抗氧化、去除自由基的活性物質(zhì)。若自由基產(chǎn)生過(guò)多或清除過(guò)慢，積累濃度過(guò)高時(shí)，會(huì)造成機(jī)體損傷，加速機(jī)體衰老并誘發(fā)各種疾病，如癌癥、糖尿病和動(dòng)脈粥樣硬化等。黑糌粑中這些活性物質(zhì)能通過(guò)清除機(jī)體自由基的方式降低各種疾病的發(fā)生率。

黑糌粑中呈現(xiàn)特有的黑紫色物質(zhì)，主要是含有花青素有密切關(guān)系，其中黑糌粑中花青素主要由矢車菊素和矢車菊素-3-O-葡萄糖苷形式存在，這些物質(zhì)其主要作用抗氧化，有效的自由基清除率。通過(guò)黑糌粑功效成分及作用分析，花青素含量為0.451～0.916 mg·g-1，大部分集中在0.5～0.7 mg·g-1；其中花青素種類中矢車菊素含量為0.034 4～0.046 7 mg·g-1，矢車菊素-3-O-葡萄糖苷含量在0.008 6～0.016 6 mg·g-1；黑糌粑對(duì)羥自由基抑制率達(dá)到56.36%～89.34%，對(duì)超氧陰離子自由基的抑制率達(dá)到52.95%～55.45%。

通過(guò)對(duì)黑糌粑一些關(guān)鍵特征指標(biāo)進(jìn)行分析檢測(cè)，結(jié)果表明，山南隆子加玉黑糌粑3含量高于其他樣品，且這些指標(biāo)含量分布有一定的高低，這可能與原料生產(chǎn)產(chǎn)地環(huán)境、加工條件都有一定關(guān)系，也對(duì)不同產(chǎn)地樣品之間功能特性和作用等狀況進(jìn)行了解、評(píng)價(jià)；為黑糌粑產(chǎn)品的品質(zhì)、功能特性的分析、監(jiān)測(cè)等提供重要的思路和參考方法。