AdipoRon減輕對乙酰氨基酚誘導的小鼠急性肝損傷

何小姣，黃 崧

(1.武警重慶總隊醫(yī)院藥劑科，重慶 400061；2.陸軍軍醫(yī)大學第一附屬醫(yī)院急救創(chuàng)傷中心，重慶 400038)

藥物性肝損傷在臨床實踐中常常發(fā)生，其中以非甾體類抗炎藥物濫用最為常見[1-2]。對乙酰氨基酚(acetaminophen，APAP)又名撲熱息痛，在臨床上主要用來解熱鎮(zhèn)痛、抗炎，然而因患者不遵醫(yī)囑、誤服或過量使用等，可引起肝小葉中央型細胞壞死，進而引發(fā)一系列病理生理學改變，甚至肝衰竭死亡，是引起肝毒性的常見藥物之一[3-5]。研究新的肝保護藥物對APAP誘導的急性肝損傷具有重要的臨床意義。

脂聯(lián)素是機體含量豐富的脂肪因子，在維持內環(huán)境能量平衡中發(fā)揮著關鍵作用，其可通過抑制糖異生而提高胰島素的敏感性，被認為是治療糖尿病的有效靶點[6-7]。多項國內外研究顯示，脂聯(lián)素在肥胖、代謝綜合征、非酒精性脂肪肝和動脈粥樣硬化的治療中均有良好的效果，能夠延緩疾病的發(fā)展進程[7-11]。脂聯(lián)素除了具有代謝調節(jié)功能外，在炎癥的調節(jié)中也起著重要的作用。在肥胖患者中，脂聯(lián)素的下調與各種炎癥標志物的升高有關[12]；在膿毒癥引起的急性肺損傷、急性缺血性腎損傷以及急性胰腺炎動物模型中，采用脂聯(lián)素干預均可抑制促炎細胞因子的產生，進而減輕炎癥損傷[13-15]；另外在體外細胞實驗中，脂聯(lián)素對體外培養(yǎng)的巨噬細胞和內皮細胞均具有抗炎作用[16-17]。然而，因脂聯(lián)素半衰期短，限制了其在臨床上的開發(fā)應用。AdipoRon是一種合成且半衰期長的小分子脂聯(lián)素受體激動劑，其藥物作用與脂聯(lián)素在治療糖尿病和動脈粥樣硬化中的有益作用相似，并且也能減輕脊髓損傷動物的炎癥反應[18-20]。而其在APAP誘導的急性肝損傷中的作用及相關機制未見報道。因此，本研究探討AdipoRon對APAP誘導的急性肝損傷、炎癥反應、肝細胞凋亡和動物生存率的影響，以期為臨床提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

APAP和AdipoRon購自Sigma公司(美國)；丙氨酸轉氨酶(alanine transaminase，ALT)、天冬氨酸轉氨酶(aspartate transaminase，AST)、總膽紅素(total bilirubin，TBIL)、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)、髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所；腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測試劑盒購自深圳欣博盛生物科技有限公司；內參β-actin、Cleaved-Caspase-3一抗及二抗均購自Cell Signaling公司；凋亡原位檢測試劑盒購自美國羅氏公司；BCA蛋白定量分析試劑盒購自美國Thermo公司；化學發(fā)光ECL試劑盒購自美國Advantsta公司。

1.2 實驗動物與分組

雄性C57BL/6小鼠128只，6～8周齡，體質量18～22 g，購于陸軍軍醫(yī)大學實驗動物中心，實驗動物生產許可證號：SCXK(渝)2017-0002。在IVC動物房內給予水、食物1周，12 h晝夜交替，環(huán)境溫度控制在(24±2)℃，待小鼠適應環(huán)境后進行實驗。所有動物實驗操作均嚴格按照大學動物實驗中心動物倫理規(guī)范進行，并經動物倫理委員會批準。

動物實驗分組：48只C57BL/6小鼠按隨機數字表法分為對照組、AdipoRon組、APAP模型組、AdipoRon低劑量(50 mg/kg)+APAP模型組、AdipoRon中劑量(100 mg/kg)+APAP模型組和AdipoRon高劑量(200 mg/kg)+APAP模型組，每組8只。AdipoRon低劑量+APAP模型組、AdipoRon中劑量+APAP模型組和AdipoRon高劑量+APAP模型組小鼠分別每天固定時間給予50、100和200 mg/kg DSMO∶食用玉米油(1∶9)溶劑灌胃，AdipoRon組給予200 mg/kg DSMO∶食用玉米油溶劑灌胃，對照組和APAP模型組給予等量DSMO∶食用玉米油溶劑灌胃，連續(xù)3 d后，參考文獻[2]建立急性肝損傷模型，禁食水后腹腔注射APAP(400 mg/kg)，6 h后麻醉處死小鼠，收集血清和肝組織備用。

1.3 生存實驗

80只小鼠按隨機數字表法分為4組，每組20只：正常對照組(給予等量DSMO∶食用玉米油溶劑)、AdipoRon組(200 mg/kg)、APAP模型組(400 mg/kg)、AdipoRon(200 mg/kg)+APAP模型組，觀察并記錄各組小鼠72 h生存率，采用Kaplan-Meier法繪制小鼠生存率曲線圖。

1.4 肝損傷相關指標檢測

按照試劑盒說明書操作要求，首先制備上樣樣本(根據實際情況稀釋相應倍數)，依次加樣與相應試劑，直至最后一步顯色，酶標儀下相應波長得到OD值，根據換算公式得出ALT、AST、LDH、TBIL和MPO的含量。

1.5 酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測血清TNF-α含量

按酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測試劑盒說明書提前制作加樣樣本，根據操作步驟，依次完成各種試劑與上樣樣本的加樣，直至最后一步顯色，記錄酶標儀450 nm波長下各樣本OD值，根據標準曲線換算各樣本實際含量。

1.6 HE染色觀察肝組織結構

在4%多聚甲醛中固定肝組織，依序脫水、包埋、切片、HE染色、封片，光學顯微鏡下觀察肝組織結構并記錄保存。

1.7 TUNEL染色檢測細胞凋亡

按照產品說明及操作步驟，逐步完成每一項操作，直至末端轉移酶反應最終產生深棕色沉淀物(即凋亡細胞的細胞核染成棕黃色)，然后切片用蘇木精輕度復染，光學顯微鏡下觀察組織結構并記錄保存。

1.8 Western blot法檢測Caspase-3蛋白水平

根據蛋白提取試劑盒說明書，稱取相同質量于-80 ℃儲存的肝組織，冰上超聲勻漿，以低溫高速12 000 g離心10 min后，取上清液制作蛋白上樣樣本，制備12.5%濃度的SDS-PAGE膠，恒壓80 V電泳，250 mA電流電轉至NC膜，5%脫脂牛奶封閉2 h，4 ℃冰箱孵育一抗(1∶1 000或1∶4 000)過夜，第2天室溫下與相應二抗(1∶2 000)孵育，ECL發(fā)光，U盤保存圖片，后期根據圖片中條帶灰度值檢測目的蛋白相對表達量。

1.9 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 AdipoRon改善APAP誘導的急性肝損傷

與對照組相比，AdipoRon組小鼠血清各生化指標均無明顯變化(P>0.05)，APAP模型組ALT、AST、TBIL和LDH水平明顯升高(P<0.05)；與APAP模型組相比，AdipoRon高劑量+APAP模型組的ALT、AST、TBIL和LDH水平均下降，AdipoRon中劑量+APAP模型組的ALT、AST水平下降，AdipoRon低劑量+APAP模型組僅AST水平下降，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表1。HE染色結果顯示，對照組肝細胞形態(tài)正常，無變性壞死，肝小葉結構完整清晰，肝索、肝竇分界明顯；APAP模型組肝組織局部肝細胞腫脹、變性壞死，小葉結構遭到明顯破壞，肝條索結構模糊甚至消失，中央靜脈或其周圍存在大量紅細胞及相應壞死病灶，并伴隨炎性細胞浸潤；AdipoRon低、中、高劑量處理后各組肝組織充血腫脹減輕，肝條索走向變清晰，細胞壞死面積明顯減少，表明APAP可使肝組織產生嚴重的組織病理學變化，而AdipoRon干預后可改善組織病理學表現(圖1)。在動物生存率分析實驗中，因AdipoRon(200 mg/kg)+APAP模型組生化指標均顯著降低，故采用高劑量AdipoRon干預做生存率分析，結果顯示AdipoRon(200 mg/kg)+APAP模型組72 h的生存率高于APAP模型組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖2。

圖1 各組小鼠肝組織HE染色結果(×200)

表1 各組小鼠血清ALT、AST、TBIL、LDH含量比較

*:與APAP模型組比較，P<0.05

2.2 AdipoRon減輕APAP誘導的急性肝損傷炎癥反應

與對照組相比，APAP模型組小鼠血清TNF-α水平明顯升高(P<0.05)；與APAP模型組相比，AdipoRon高劑量+APAP模型組血清TNF-α水平明顯降低(P<0.05)，而AdipoRon中、低劑量處理組血清TNF-α水平無明顯變化(P>0.05)。與對照組相比，APAP模型組肝組織中MPO水平明顯升高；與APAP模型組相比，AdipoRon高劑量+APAP模型組肝組織中MPO水平降低，而AdipoRon中、低劑量處理組MPO水平無明顯變化(P>0.05)，見表2。

表2 各組小鼠TNF-α、MPO含量比較

2.3 AdipoRon通過抑制Caspases-3蛋白激活減輕肝細胞凋亡

APAP模型組肝組織中可見大量TUNEL陽性的凋亡細胞，細胞核呈褐色；AdipoRon高劑量+APAP模型組細胞核中TUNEL陽性細胞的數量減少(圖3)。Western blot結果表明，APAP模型組Cleaved-Caspase-3含量高于對照組，而AdipoRon高劑量+APAP模型組Cleaved-Caspase-3含量低于APAP模型組(P<0.05)，見圖4。

圖3 各組小鼠肝組織TUNEL染色結果比較(×200)

*:與對照組比較，P<0.05；#:與APAP模型組比較，P<0.05

3 討論

肝是人體最大的代謝與免疫器官，在維護機體健康中發(fā)揮著重要作用[21]。藥物性肝損傷在臨床上時有發(fā)生，而APAP作為解熱鎮(zhèn)痛藥物，在臨床實踐中被廣泛使用，若使用不當，可能會引發(fā)急性肝細胞損傷，甚至導致不可逆性肝衰竭而死亡[22]。因此，研究藥物性肝損傷的發(fā)病機理及新型保肝藥物對于制定臨床治療策略尤為重要。

脂聯(lián)素是一種重要的脂肪因子，在代謝和炎癥中發(fā)揮著多種調節(jié)作用[7-15]。有研究發(fā)現，在肥胖患者中脂聯(lián)素不僅可以調節(jié)糖脂代謝，而且可以抑制各種炎癥標志物的升高[12]。還有研究顯示，脂聯(lián)素可以在體內外發(fā)揮抗炎作用[13-17]。然而脂聯(lián)素半衰期短，導致其臨床開發(fā)應用受到限制。AdipoRon是一種小分子脂聯(lián)素受體激動劑，可在糖尿病等多種代謝性疾病中發(fā)揮改善作用[18]。多項研究顯示AdipoRon可減輕炎癥損傷，抑制促炎細胞因子的分泌[12-15]。本研究發(fā)現，AdipoRon能抑制APAP誘導的小鼠ALT、AST、TBIL和LDH升高，減輕肝細胞損傷，減少炎癥因子分泌，同時提高小鼠生存率。因此，AdipoRon可能在APAP誘導的急性肝損傷中發(fā)揮保護作用，這對于臨床肝保護藥物研發(fā)具有潛在的應用價值。

在APAP誘導的急性肝損傷模型中，促炎細胞因子TNF-α的誘導在肝損傷的病理發(fā)生發(fā)展過程中起著非常重要的作用[23]。而體內外的多項研究均顯示AdipoRon具有抗炎作用[13-17]，且AdipoRon對腎小管上皮細胞、心肌細胞以及內皮細胞中TNF-α的產生均具有抑制作用[17，24-25]。在本研究中，AdipoRon可抑制APAP誘導產生的TNF-α，其結果與MPO的結果相一致，MPO活性的增加被認為是炎癥損傷中中性粒細胞活化和積聚的代表性指標，AdipoRon高劑量+APAP模型組MPO的含量顯著低于APAP模型組，表明AdipoRon的抗炎作用能夠減輕APAP誘導的急性肝損傷。

脂聯(lián)素不僅具有抗炎作用，而且在多種疾病中發(fā)揮著抗凋亡作用。多項研究表明，脂聯(lián)素可以減輕血管內皮細胞、神經元細胞的凋亡[26-28]。而在動物實驗中也表現出相同的作用，其可抑制缺血后心肌細胞凋亡和糖尿病誘導的腎細胞凋亡[29-30]。本研究采用AdipoRon預處理后，Western blot結果顯示AdipoRon可抑制肝Caspases凋亡蛋白的激活，抑制Caspase-3的裂解，并減少TUNEL陽性細胞的數量。因此，AdipoRon對APAP誘導的急性肝損傷的保護作用可能與其抗炎和抗凋亡有關。

綜上所述，AdipoRon可降低APAP誘導的炎癥反應和肝細胞凋亡，從而減輕肝損傷，提高生存率。AdipoRon可能成為一種治療急性肝炎的潛在藥物，但其在急性肝炎中起保護作用的分子機制仍有待進一步研究。