在線固相萃取/凈化-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定番茄、大米和圓白菜中8種氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留

劉 欣, 孫秀蘭, 曹 進

(1. 江南大學(xué)食品學(xué)院, 江蘇 無錫 214122; 2. 中國食品藥品檢定研究院, 北京 100050)

氨基甲酸酯類農(nóng)藥是一類分子中含有氨基甲酸酯結(jié)構(gòu)的人工合成農(nóng)藥,是一種新型廣譜的殺蟲、殺螨除草劑[1,2]。自20世紀(jì)70年代以來,隨著有機磷農(nóng)藥相繼被不同國家禁用或者限制使用,氨基甲酸酯類農(nóng)藥因選擇性強、藥效好、殘留期短且種類多,使用量逐年增加,被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)和林牧業(yè)中[3,4]。氨基甲酸酯類農(nóng)藥的廣泛使用會導(dǎo)致其在食品中造成殘留,從而威脅人類健康[5,6]。因此食品中氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留的快速準(zhǔn)確檢測對保障食品安全具有重大意義,為減少復(fù)雜基質(zhì)對檢測結(jié)果的影響,需要樣品前處理過程中能夠最大限度地凈化目標(biāo)成分,除去目標(biāo)雜質(zhì)。

氨基甲酸酯類農(nóng)藥種類多,極性強,熱穩(wěn)定性差,氣相色譜法不適用于測定非揮發(fā)性或熱不穩(wěn)定性農(nóng)藥[7,8],因此目前大多采用靈敏度高、適用范圍廣的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)進行測定[9,10]。在線固相萃取是區(qū)別于傳統(tǒng)離線固相萃取的全自動在線凈化方式,采用閥切換即可完成樣品的上樣、富集和純化,溶劑使用量少,提高了檢測的靈敏度和準(zhǔn)確度[11-13]。堵燕鈺等[14]和張海超[15]使用在線凈化-液相色譜-高分辨質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)測定了食品中氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留,方法的回收率穩(wěn)定,重復(fù)性良好,精密度高,證明在線凈化方法可滿足氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留檢測的要求。

大米是人們?nèi)粘Ｉ铒嬍持兄匾闹魇持?番茄和圓白菜價格實惠,也是人們經(jīng)常選擇的蔬菜。我國國家標(biāo)準(zhǔn)[16]《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中農(nóng)藥最大殘留限量》中規(guī)定了氨基甲酸酯類農(nóng)藥在食品中的最大殘留限量,其中滅多威(methomyl)在番茄和圓白菜中的最大殘留限量均為0.2 mg/kg,甲萘威(carbaryl)在大米、番茄和圓白菜中的最大殘留限量均為1 mg/kg,異丙威(isoprocarb)在大米中的最大殘留限量為0.2 mg/kg,抗蚜威(pirimicarb)在番茄和圓白菜中的最大殘留限量為0.5 mg/kg和5 mg/kg。嚴(yán)格的最大殘留限量對樣品前處理方法提出了更大的挑戰(zhàn),因此建立操作簡單、準(zhǔn)確高效的前處理方法具有重要意義[17,18]。

本文以常見的大米、番茄和圓白菜作為代表性基質(zhì),使用自行搭建的在線前處理/凈化技術(shù)對目標(biāo)物進行富集和純化,結(jié)合高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)測定滅多威、抗蚜威、速滅威(metolcarb)、殘殺威(propoxur)、甲萘威、異丙威、甲硫威(methiocarb)和仲丁威(fenobucarb)等8種氨基甲酸酯類農(nóng)藥。相對于以往多種氨基甲酸酯類農(nóng)藥分析中常用的離線固相萃取凈化方法,該方法樣品凈化自動化程度高,簡單快速,分析效率高，溶劑消耗少，成本低,可滿足世界各國對氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留限量的檢測要求。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(Qtrap 6500,美國AB Sciex公司);全自動智能氮吹儀(FV4,得泰儀器科技有限公司);旋渦混勻器(VORTEX-5,南京貝登醫(yī)療股份有限公司);醫(yī)用離心機(GTR1-B,北京新時代北利醫(yī)療器械有限公司);機械超聲波清洗機(北京世紀(jì)科璽公司);分析天平(XP205和AL204,德國Mettler公司); Milli-Q超純水器(美國Millipore公司); ACQUITY UPLC CSH C18色譜柱(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm,美國Waters公司); CAPCELL PAK C18凈化柱(50 mm×2.0 mm, 15 μm,北京迪澤爾科技有限公司)。

滅多威、抗蚜威、速滅威、殘殺威、甲萘威、異丙威、甲硫威、仲丁威標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥97.63%)均購自德國Dr. Ehrenstorfer公司。甲醇、乙酸乙酯、丙酮、乙腈、二氯甲烷(色譜純),以及甲酸(質(zhì)譜純)購自美國Thermo Fisher Scientific公司;氯化鈉(分析純)購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司;實驗用水為超純水(電阻率≥18.2 MΩ·cm), Milli-Q Plus超純水設(shè)備制得;大米、番茄和圓白菜均為實驗室日常抽檢樣品。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

分別準(zhǔn)確稱取8種氨基甲酸酯類標(biāo)準(zhǔn)品適量,用甲醇分別配制成1.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液,于-20 ℃避光保存。取8種標(biāo)準(zhǔn)儲備液各100 μL,用甲醇定容至10 mL,得到10 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液,于4 ℃避光保存。使用10%(v/v)乙腈水溶液將10 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液稀釋為適當(dāng)濃度的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.3 樣品提取

將番茄樣品絞碎勻漿,圓白菜樣品切碎勻漿,大米樣品直接粉碎過40目篩。稱取上述番茄5.0 g、圓白菜和大米各2.0 g(精確到0.1 g),置于50 mL聚丙烯離心管中,圓白菜和大米中加入3 mL水(番茄中不加水),以1 000 r/min旋渦1 min,加入2 g氯化鈉和10 mL 0.5%(v/v)甲酸乙腈溶液,于旋渦混合器上混合3 min,以5 000 r/min離心5 min,將上清液轉(zhuǎn)移至另一根離心管中,再用5 mL 0.5%(v/v)甲酸乙腈溶液重復(fù)以上提取過程,合并提取液。于40 ℃下氮吹至干,加入2 mL 10%(v/v)乙腈水溶液,渦旋溶解殘渣后,過0.45 μm微孔濾膜。

表 1 在線固相萃取/凈化的梯度條件

1.4 樣品在線凈化

使用CAPCELL PAK C18柱作為在線凈化柱,通過改變0.1%(v/v)甲酸水(A相)和乙腈(B相)的比例實現(xiàn)上樣、淋洗、洗脫和柱平衡4個階段(見表1)。在線凈化系統(tǒng)流路圖見圖1,六通閥處于位置A(position A)時進行上樣,使用注射器進樣,使樣品提取液充滿1 mL定量環(huán),同時使用初始流動相(A相和B相的體積比為9∶1)對在線固相萃取柱進行平衡。進樣處理時將六通閥由position A切換至position B,先由初始流動相帶動樣品提取液流經(jīng)在線固相萃取柱,使目標(biāo)化合物完全吸附到在線固相萃取柱上,雜質(zhì)流進廢液,隨后通過調(diào)節(jié)流動相的比例,使目標(biāo)化合物從在線固相萃取柱上洗脫,此時收集洗脫液,上機測定。

圖 1 在線凈化系統(tǒng)流路圖Fig. 1 Flow diagram of online purification system

1.5 LC-MS/MS分析

1.5.1色譜條件

分析柱為ACQUITY UPLC CSH C18色譜柱(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm);柱溫為40 ℃;流動相A為0.1%(v/v)甲酸水溶液,B為乙腈;流速為0.3 mL/min。梯度洗脫程序:0～1.0 min, 10%B; 1.0～4.0 min, 10%B～50%B; 4.0～5.0 min, 50%B～90%B; 5.0～8.0 min, 90%B; 8.0～8.1 min, 90%B～10%B; 8.1～10.0 min, 10%B。進樣量為5 μL。

1.5.2質(zhì)譜條件

電離方式:電噴霧電離、正離子模式(ESI+);離子源溫度:550 ℃;監(jiān)測方式:多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式;電噴霧電壓(IS): 5.5 kV;霧化氣壓力(GS1): 344.75 kPa;輔助加熱氣壓力(GS2): 344.75 kPa;氣簾氣壓力(CUR): 275.8 kPa。8種氨基甲酸酯農(nóng)藥的保留時間、定性離子、定量離子、去簇電壓和碰撞能見表2。

表 2 8種氨基甲酸酯類農(nóng)藥的保留時間和質(zhì)譜參數(shù)

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件優(yōu)化

選用填料粒徑為1.7 μm的ACQUITY UPLC CSH C18色譜柱,其基于亞乙基橋顆?；|(zhì)的鍵合相,可以為物質(zhì)的分離提供良好的峰形。實驗考察了水-乙腈、0.1%甲酸水溶液-乙腈、0.1%甲酸水溶液-甲醇等流動相對色譜分離及靈敏度的影響。發(fā)現(xiàn)使用乙腈作為有機相時,多數(shù)物質(zhì)的響應(yīng)要好于甲醇。同時,在正離子模式下,水相中加入甲酸,有助于分析物形成[M+H]+,峰形更對稱,也提高了分析靈敏度,因此本實驗最終使用0.1%甲酸水溶液-乙腈作為流動相。通過優(yōu)化梯度洗脫程序,8種氨基甲酸酯農(nóng)藥在10 min內(nèi)即可達到最佳分離,最佳條件下的色譜圖見圖2。

圖 2 8種氨基甲酸酯農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(100 ng/mL)的 提取離子流色譜圖Fig. 2 Extracted ion current chromatograms of the eight carbamate pesticides (100 ng/mL) in mixed standard solution

2.2 質(zhì)譜條件優(yōu)化

根據(jù)氨基甲酸酯類農(nóng)藥分子結(jié)構(gòu)的特征,選擇了電噴霧電離、正離子模式,用注射泵分別將質(zhì)量濃度為100 ng/mL的單標(biāo)準(zhǔn)溶液以7 μL/min的流速注入質(zhì)譜儀中,首先進行一級質(zhì)譜分析,找到每種藥物穩(wěn)定的母離子[M+H]+峰。然后分別以8種藥物的分子離子作為母離子進行子離子掃描分析,通過調(diào)節(jié)碰撞能,選取各目標(biāo)物質(zhì)的最優(yōu)子離子。以信號最強的子離子作為定量離子,信號次強的子離子作為定性離子,對各離子對進行去簇電壓、碰撞能、碰撞室入口電壓及出口電壓的優(yōu)化,確定各目標(biāo)物質(zhì)的質(zhì)譜參數(shù)(見表1),確保每種物質(zhì)的響應(yīng)和離子化效率達到最佳。

2.3 樣品提取溶劑的選擇

根據(jù)待測樣品及目標(biāo)物的性質(zhì)進行提取溶劑的選擇。本實驗采用甲醇、乙酸乙酯、丙酮、乙腈和0.5%(v/v)甲酸乙腈溶液作為提取溶劑,進行加標(biāo)回收試驗來比較提取效果,加標(biāo)水平為20 μg/kg,每個水平平行測定6次(見圖3)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),使用丙酮和乙酸乙酯提取時,番茄樣品溶出的色素較多,使用甲醇作為提取溶劑時回收率在50%以下。使用0.5%甲酸乙腈溶液提取時回收率最高,這是因為乙腈通用性和組織穿透能力強,而且甲酸提供了酸性環(huán)境,有利于氨基甲酸酯類農(nóng)藥的穩(wěn)定,故選用0.5%甲酸乙腈作為提取溶劑。

圖 3 不同提取溶劑對8種氨基甲酸酯類農(nóng)藥回收率的 影響(n=6)Fig. 3 Effects of different extraction solvents on the recoveries of the eight carbamate pesticides (n=6)

2.4 復(fù)溶溶劑中乙腈體積分?jǐn)?shù)的優(yōu)化

樣品提取液氮吹后使用乙腈水溶液作為復(fù)溶溶劑。復(fù)溶溶劑中乙腈的體積分?jǐn)?shù)會影響凈化柱對目標(biāo)化合物的吸附。乙腈體積分?jǐn)?shù)越小,目標(biāo)化合物越穩(wěn)定吸附富集到前處理柱上。實驗對比了乙腈體積分?jǐn)?shù)分別為80%、60%、40%、30%、20%、10%時8種氨基甲酸酯類農(nóng)藥的回收率,結(jié)果見圖4。當(dāng)乙腈體積分?jǐn)?shù)不高于10%時,8種氨基甲酸酯類農(nóng)藥均可完全富集到前處理柱上,實驗最終確定復(fù)溶溶劑中乙腈的體積分?jǐn)?shù)為10%。

圖 4 復(fù)溶溶劑中乙腈的體積分?jǐn)?shù)對8種氨基甲酸酯農(nóng)藥 回收率的影響(n=6)Fig. 4 Effects of proportion of acetonitrile in resolution solvent on the recoveries of the eight carbamate pesticides (n=6)

2.5 在線固相萃取條件的優(yōu)化

在線固相萃取包括上樣、淋洗、洗脫和平衡4個步驟。本實驗使用CAPCELL PAK C18柱作為在線凈化柱,其填充劑為無定形硅膠鍵合十八烷基,可用于大部分在反相體系中進行分離的物質(zhì)的富集純化。本實驗對流動相的種類及流速、上樣和洗脫時流動相比例進行了優(yōu)化。

2.5.1流動相

實驗對比分析了水-乙腈和0.1%(v/v)甲酸水溶液-乙腈作為流動相時目標(biāo)分析物的富集純化效果。發(fā)現(xiàn)當(dāng)使用純水作為水相時,目標(biāo)物在上樣階段無法吸附到在線凈化柱上,使用0.1%(v/v)甲酸水溶液作為水相時,可以滿足目標(biāo)物在凈化柱上有效的富集和洗脫。

2.5.2流動相比例

上樣時,流動相中的乙腈體積分?jǐn)?shù)越小,凈化柱對8種氨基甲酸酯類農(nóng)藥的富集作用越強。滅多威的回收率受流動相中乙腈體積分?jǐn)?shù)的影響較大,當(dāng)乙腈體積分?jǐn)?shù)高于35%時,滅多威的回收率僅為5%;當(dāng)乙腈體積分?jǐn)?shù)不高于10%時,滅多威的回收率才可達到95%以上。當(dāng)流動相中乙腈體積分?jǐn)?shù)低于30%時,其他7種氨基甲酸酯類農(nóng)藥即可完全吸附到凈化柱上,故確定上樣時流動相中乙腈的體積分?jǐn)?shù)為10%。

洗脫時,當(dāng)流動相中乙腈體積分?jǐn)?shù)低于55%時,仲丁威和甲硫威均不能被洗脫;當(dāng)乙腈體積分?jǐn)?shù)為65%及以上時,所有的物質(zhì)均可被完全洗脫,經(jīng)色譜分析,洗脫液中乙腈的體積分?jǐn)?shù)對色譜峰形及靈敏度無影響,均能保持尖銳對稱的峰形,故確定洗脫時流動相中乙腈的體積分?jǐn)?shù)為65%。

2.6 方法學(xué)考察

2.6.1線性關(guān)系和檢出限

配制每種化合物的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,按確定的分析條件進行測定,以各物質(zhì)的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、定量離子峰面積為縱坐標(biāo)進行線性回歸,繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。結(jié)果表明,各物質(zhì)在各自線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,線性相關(guān)系數(shù)(r)均大于0.995(見表3)。

表 3 8種氨基甲酸酯農(nóng)藥的線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限

以各目標(biāo)化合物信噪比(S/N)分別為3和10時計算檢出限(LOD)和定量限(LOQ), 8種氨基甲酸酯類農(nóng)藥的LOD和LOQ分別為0.01～0.30 ng/mL和0.05～1.0 ng/mL,均較低于文獻值。堵燕鈺等[14]對茶葉中5種氨基甲酸酯類農(nóng)藥進行檢測的檢出限為0.3～1 μg/kg,張海超[15]對5種蔬菜基質(zhì)中24種氨基甲酸酯類農(nóng)藥進行檢測的定量限為1 μg/kg和5 μg/kg。

2.6.2回收率和精密度

對陰性番茄、大米和圓白菜基質(zhì)進行3個水平的加標(biāo)回收試驗,使得最終凈化液中各物質(zhì)的加標(biāo)水平分別為2、10、20 ng/mL,每個水平進行6組平行實驗,計算回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(見表4)。結(jié)果表明,8種氨基甲酸酯類農(nóng)藥在3個加標(biāo)水平下的加標(biāo)回收率為73.76%～112.32%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.28%～13.14%,說明方法具有良好的準(zhǔn)確性和精密度。

2.6.3在線凈化柱的重復(fù)性

使用CAPCELL PAK C18柱進行200次實驗后,使用混合標(biāo)準(zhǔn)溶液上樣并收集洗脫液,與混合溶液同時進行質(zhì)譜分析與定量,發(fā)現(xiàn)洗脫液與原混合溶液中8種氨基甲酸酯類農(nóng)藥的含量相差在5%以內(nèi),說明凈化柱的效能穩(wěn)定,重復(fù)使用性強。

2.7 與離線凈化方法的比較

采用現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)NY/T 1679-2009《植物性食品中氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留的測定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》的離線固相萃取凈化方法時,番茄、大米和圓白菜中8種氨基甲酸酯類農(nóng)藥的加標(biāo)回收率為55.68%～99.13%, RSD為1.48%～26.46%,表明離線方法的重復(fù)性和準(zhǔn)確度均不如在線凈化方法。

在實驗操作上,離線SPE凈化方法的整個凈化過程近80 min,而在線凈化方法無需進行上樣洗脫等人工操作及氮氣吹干,整個凈化過程僅需12 min,有效簡化了樣品的前處理步驟,也縮短了前處理的時間,減少了有機溶劑的和耗材的使用量。

2.8 實際樣品的測定

根據(jù)優(yōu)化的凈化條件與儀器條件,對實驗室的番茄、大米和圓白菜各10份樣品進行檢測。結(jié)果表明,抽檢的30份樣品中均未檢出氨基甲酸酯類農(nóng)藥。說明此次抽檢的樣品總體質(zhì)量較好。在加標(biāo)回收率實驗中已經(jīng)證明本方法的回收率高,重復(fù)性好,因此可以對樣品中的氨基甲酸酯類農(nóng)藥進行有效監(jiān)測。

3 結(jié)論

本文采用在線固相萃取,結(jié)合高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對番茄、大米和圓白菜中8種氨基甲酸酯類農(nóng)藥進行富集純化和分析檢測。該法操作簡單,準(zhǔn)確度和回收率高,重復(fù)性好,具有準(zhǔn)確、快速、靈敏、環(huán)保等優(yōu)點,可滿足番茄、大米和圓白菜中氨基甲酸酯類農(nóng)藥分析的要求。與離線固相萃取方法相比,該方法在準(zhǔn)確度、靈敏度和重復(fù)性,以及前處理操作步驟和所需時間等方面都具有明顯的優(yōu)勢。

農(nóng)藥種類繁多,性質(zhì)也千差萬別,可繼續(xù)開發(fā)針對其他農(nóng)藥的在線凈化-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法,從而為我國食品中農(nóng)藥殘留的監(jiān)測提供技術(shù)支持。在此基礎(chǔ)上,可開發(fā)更多種類的填料應(yīng)用到在線凈化柱中,并將不同填料的凈化柱的凈化效果進行對比,為日后研究提供參考。