混合型離子交換液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)雞蛋中10種氨基糖苷類藥物殘留

魏莉莉, 薛 霞, 武傳香, 丁 一, 盧蘭香, 王 駿, 劉艷明*

(1. 山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院, 山東 濟(jì)南 250101; 2. 山東省食品藥品安全檢測(cè)工程技術(shù)研究中心, 山東 濟(jì)南 250101)

氨基糖苷類藥物(aminoglycosides, AGs)是一種廣譜的抗生素,對(duì)革蘭氏陰性菌有顯著的抗菌效果[1],在畜牧業(yè)和養(yǎng)殖業(yè)應(yīng)用廣泛。AGs不僅治療動(dòng)物疾病,還可以用作飼料添加劑,促進(jìn)動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育[2]。AGs具有一定的耳毒性、腎毒性和神經(jīng)肌肉阻滯作用[3],該類抗生素被畜禽動(dòng)物食用后,主要存在于肝臟、腎臟、肌肉、奶和蛋中,因此可以通過蛋中抗生素殘留檢測(cè)方法的建立,來監(jiān)測(cè)家禽動(dòng)物食品的質(zhì)量狀況。

世界各國(guó)均建立了AGs在禽蛋中的最高殘留限量(MRL)。歐盟[4]規(guī)定雞蛋中新霉素的MRL為500 μg/kg,產(chǎn)蛋期禁止使用卡那霉素、安普霉素、大觀霉素;我國(guó)GB 31650-2019[5]規(guī)定雞蛋中大觀霉素的MRL為2 000 μg/kg,新霉素的MRL為500 μg/kg,潮霉素B不得檢出。目前文獻(xiàn)中對(duì)AGs的檢測(cè)針對(duì)的基質(zhì)多是蜂蜜、乳制品、肉制品、水產(chǎn)品等[6-13],對(duì)于雞蛋中AGs的檢測(cè)相關(guān)報(bào)道較少。建立雞蛋中AGs殘留量的快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法,對(duì)維護(hù)人類的飲食健康具有重要意義。

目前AGs殘留的檢測(cè)技術(shù)已經(jīng)取得很大進(jìn)展。酶聯(lián)免疫法操作相對(duì)簡(jiǎn)單,但無法準(zhǔn)確定性,常作為篩查方法[14]。氣相色譜法需要衍生,步驟繁瑣[15];液相色譜法直接測(cè)定AGs時(shí)需要通用型的檢測(cè)器,檢出限高[16],間接測(cè)定時(shí)需要對(duì)分析物進(jìn)行柱前或柱后衍生,重現(xiàn)性差[17]。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法由于抗基質(zhì)干擾能力強(qiáng)、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn),在AGs的檢測(cè)方面應(yīng)用最為廣泛。在傳統(tǒng)的反相色譜中,需要加入離子對(duì)試劑改善AGs的色譜保留行為,但離子對(duì)試劑進(jìn)入質(zhì)譜后容易產(chǎn)生離子抑制。親水作用色譜和離子交換色譜由于對(duì)極性化合物有很好的保留,與MS/MS聯(lián)用,可以解決上述問題。

PRiME HLB固相萃取柱能夠去除雞蛋中磷脂、脂肪、蛋白質(zhì)等常見的基質(zhì)干擾物,常被用作動(dòng)物源性食品中多種獸藥殘留測(cè)定的凈化手段。目前,未有該固相萃取柱在AGs凈化方面的應(yīng)用。本研究采用PRiME HLB固相萃取柱凈化,Obelisc R色譜柱分離,MS/MS檢測(cè),實(shí)現(xiàn)了雞蛋中鏈霉素、雙氫鏈霉素、潮霉素B、卡那霉素、阿米卡星、妥布霉素、安普霉素、大觀霉素、新霉素、慶大霉素等10種AGs的同時(shí)檢測(cè)。該方法操作簡(jiǎn)單、避免了離子對(duì)試劑的使用,能夠滿足國(guó)內(nèi)外對(duì)雞蛋中AGs殘留量的檢測(cè)要求。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

島津LC-30AD超高效液相色譜儀,配自動(dòng)進(jìn)樣器和柱溫箱(日本Shimadzu公司), 8050三重四極桿質(zhì)譜儀,配有電噴霧電離源(ESI)(日本Shimadzu公司); 3-18K臺(tái)式高速離心機(jī)(德國(guó)Sigma公司); BT 125D電子天平(德國(guó)Sartorius公司); MS3型旋渦混合器(德國(guó)IKA公司); SB-800DTD超聲波清洗儀(寧波新芝生物科技股份有限公司); Milli-Q超純水系統(tǒng)(美國(guó)Millipore公司);固相萃取裝置(美國(guó)Supelco公司)。

鏈霉素(STREP, CAS號(hào):3810-74-0,純度90.3%)、雙氫鏈霉素(DHSTREP, CAS號(hào):5490-27-7,純度94.4%)、潮霉素B(HYGRO, CAS號(hào):31282-04-9,純度90.0%)、阿米卡星(AMIK, CAS號(hào):1257517-67-1,純度99.0%)、安普霉素(APRA, CAS號(hào):65710-07-8,純度81.5%)、大觀霉素(SPEC, CAS號(hào):22189-32-8,純度89.4%)、新霉素(NEO)、慶大霉素(GENT, CAS號(hào):1405-41-0,純度90.8%)(德國(guó)Dr. Ehrenstorfer公司);卡那霉素(KANA, CAS號(hào):25389-94-0,純度97.0%)(北京曼哈格生物科技有限公司);妥布霉素(TOBRA, CAS號(hào):32986-56-4,純度94.0%)(美國(guó)Stanford Chemicals公司);甲醇、乙腈、甲酸(色譜純,德國(guó)Merck公司);甲酸銨(色譜純,美國(guó)Fisher公司);三氯乙酸(TCA)、乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)、鹽酸、氫氧化鈉、氨水、乙酸銨(分析純,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);所用水為超純水。

Prime HLB固相萃取柱(200 mg, 6 mL)(美國(guó)Waters公司)。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液:準(zhǔn)確稱取適量的10種標(biāo)準(zhǔn)品,分別溶解于10.0 mL水中,配制成質(zhì)量濃度為1 000 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,于4 ℃避光保存。

混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液:取各標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液,混合,用水逐級(jí)稀釋,配成質(zhì)量濃度為10、1和0.1 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液。

試劑標(biāo)準(zhǔn)工作溶液:取5、10、20 μL 1 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液和5、10、20 μL 10 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液,用甲酸-乙腈-水(10∶5∶85, v/v/v)定容至1.0 mL,配成5、10、20、50、100、200 μg/L試劑標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.3 色譜-質(zhì)譜條件

色譜柱:SIELC Obelisc R (150 mm×2.1 mm, 5 μm,美國(guó)SIELC公司);流動(dòng)相:A相為乙腈溶液,B相為1%(v/v)甲酸溶液(含1 mmol/L甲酸銨);柱溫:40 ℃;進(jìn)樣量:5 μL;梯度洗脫程序:0～3.0 min,75%A; 3.0～6.0 min,75%A～20%A; 6.0～8.0 min,20%A～5%A; 8.0～11.0 min,5%A; 11.0～11.1 min,5%A～75%A; 11.1～16.0 min,75%A。

電噴霧離子源(ESI);多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式;正離子掃描方式;霧化氣流量:3 L/min;加熱氣流量:10 L/min;接口溫度:300 ℃; 脫溶劑管溫度:250 ℃;加熱塊溫度:400 ℃;干燥氣流量:10 L/min。10種氨基糖苷類藥物的定量離子對(duì)、定性離子對(duì)、駐留時(shí)間、Q1 pre bias、Q3 pre bias見表1。

表 1 10種氨基糖苷類藥物的MS/MS參數(shù)

1.4 樣品處理

1.4.1提取

準(zhǔn)確稱取2.5 g試樣(精確至0.01 g)于50 mL離心管中,加入10 mL 10 mmol/L乙酸銨緩沖溶液(含0.4 mmol/L EDTA和50 g/L三氯乙酸)渦旋混勻,超聲15 min, 8 000 r/min離心5 min,將上清液轉(zhuǎn)移至另一50 mL離心管中,殘?jiān)儆?0 mL提取液重復(fù)提取一次,合并兩次的上清液,用10 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)pH至6.5,用水定容至25 mL。過濾,收集濾液待凈化。

1.4.2凈化

依次用3 mL甲醇、3 mL水活化Prime HLB固相萃取柱。準(zhǔn)確移取20 mL上清液,以不高于1 mL/min的流速全部通過固相萃取柱,棄去濾液;用3 mL超純水淋洗兩次,3 mL甲醇-水(5∶95, v/v)淋洗一次,棄去淋洗液,將小柱抽干;用2 mL甲酸-乙腈-水(10∶5∶85, v/v/v)溶液洗脫并收集洗脫液,抽干固相萃取柱,渦旋混勻后,經(jīng)微孔濾膜過濾,供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀分析測(cè)定。

1.4.3基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作溶液

取6份空白樣品于50 mL離心管中,按1.4.1節(jié)和1.4.2節(jié)操作,制得空白提取液。分別吸取5、10、20 μL 1 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液和5、10、20 μL 10 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液,用空白提取液定容至1.0 mL,配成5、10、20、50、100、200 μg/L的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.5 基質(zhì)效應(yīng)研究

將基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作溶液和試劑標(biāo)準(zhǔn)工作溶液分別注入超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀,按1.3節(jié)進(jìn)行測(cè)定,得到各組分的峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo),以標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,以曲線的斜率評(píng)價(jià)基質(zhì)效應(yīng)(ME)?；|(zhì)效應(yīng)計(jì)算公式[7]為:ME=(基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率/試劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率-1)×100%。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取條件的選擇

2.1.1提取溶劑的選擇

由于AGs類藥物難溶于甲醇、乙腈等有機(jī)溶劑,因此通常采用緩沖液進(jìn)行提取,同時(shí)加入三氯乙酸既可以去除蛋白質(zhì),也可以溶解該類藥物。結(jié)合文獻(xiàn),本研究考察了提取液1(10 mmol/L乙酸銨緩沖液、50 g/L TCA)[6]、提取液2(10 mmol/L乙酸銨緩沖液、50 g/L TCA、0.4 mmol/L EDTA)[18]和提取液3(10 mmol/L乙酸銨緩沖液、50 g/L TCA、0.4 mmol/L EDTA、5 g/L NaCl)[19]3種提取溶劑對(duì)雞蛋中氨基糖苷類藥物回收率的影響。向空白雞蛋基質(zhì)中加入100 μg/kg的標(biāo)準(zhǔn)品,用上述提取溶劑進(jìn)行提取,基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作曲線進(jìn)行定量,計(jì)算回收率。由圖1可以看出,用提取溶劑1和提取溶劑2提取后HYGRO的回收率在73%左右,而用提取溶劑3提取后,HYGRO的回收率為53.2%,表明氯化鈉的加入會(huì)降低HYGRO的回收率。對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)一步分析時(shí)發(fā)現(xiàn)用提取液1提取后STREP、DHSTREP和HYGRO的基質(zhì)效應(yīng)分別為-79%、-73%和-40%,用提取液2提取后對(duì)應(yīng)的基質(zhì)效應(yīng)分別為-0.3%、-12.5%和-12.1%,說明EDTA的加入會(huì)減少STREP、DHSTREP和HYGRO的基質(zhì)效應(yīng)。綜合以上因素,選擇提取液2(10 mmol/L乙酸銨緩沖液、50 g/L TCA、0.4 mmol/L EDTA)為提取溶劑。

圖 1 采用不同提取液時(shí)雞蛋中10種氨基糖苷類藥物的 加標(biāo)回收率Fig. 1 Recoveries of the ten aminoglycosides spiked in eggs with different extraction solvents

2.1.2提取體積和次數(shù)的選擇

分別用10 mL、5 mL+5 mL、20 mL、10 mL+10 mL、30 mL提取溶劑提取100 μg/kg的空白加標(biāo)樣品,10種氨基糖苷的回收率見圖2。對(duì)樣品只提取1次時(shí),當(dāng)提取劑的體積達(dá)到20 mL時(shí),回收率基本穩(wěn)定;當(dāng)用20 mL提取劑分兩次提取時(shí),回收率有明顯提高,因此,選擇提取體積為20 mL,提取次數(shù)2次。

圖 2 提取體積和提取次數(shù)對(duì)雞蛋中10種氨基糖苷類藥物 加標(biāo)回收率的影響Fig. 2 Effects of extract dosages and times on the recoveries of the ten aminoglycosides spiked in eggs

圖 3 固相萃取柱對(duì)雞蛋中10種氨基糖苷類藥物 加標(biāo)回收率的影響Fig. 3 Effect of SPE cartridges on the recoveries of the ten aminoglycosides spiked in eggs

2.2 凈化條件的選擇

2.2.1固相萃取柱的選擇

雞蛋樣品中含有豐富的蛋白質(zhì)、卵磷脂及固醇類物質(zhì),干擾分析物的測(cè)定,需要對(duì)樣品進(jìn)行凈化和富集。本研究比較了Oasis PRiME HLB(200 mg/6 mL, Waters)、WCX(60 mg/3 mL, Waters)、MCX (60 mg/3 mL, Waters)和SupelMIP(50 mg/3 mL, Supelco)4種固相萃取柱對(duì)10種氨基糖苷回收率的影響(見圖3)。

MCX是混合型強(qiáng)陽離子交換柱,與氨基糖苷類藥物的作用較強(qiáng),只用氨水甲醇很難完全洗脫,因此回收率較低;WCX是一種弱陽離子交換柱,與MCX固相萃取柱相比,回收率有所提高,但是大部分化合物的回收率仍低于80%,可能的原因?yàn)樘崛∫褐腥纫宜嵩黾恿巳芤旱碾x子強(qiáng)度,影響了氨基糖苷類藥物的保留;SupelMIP是針對(duì)氨基糖苷類物質(zhì)的分子印跡柱,但是對(duì)HYGRO和SPEC的回收率低于50%; PRiME HLB是一種通用型的固相萃取柱,在凈化蛋白質(zhì)、磷脂等方面具有優(yōu)越的性能,對(duì)10種氨基糖苷類藥物的回收率均能達(dá)到70%以上。因此本研究選擇PRiME HLB作為凈化柱。

2.2.2上樣溶液pH的選擇

氨基糖苷類藥物屬于堿性化合物,分子中含有多個(gè)氨基和羥基,每種組分具有多個(gè)pKa值,在不同的pH值條件下,以不同的離子或分子形式存在于溶液中,進(jìn)而影響目標(biāo)物在PRiME HLB上的保留。本研究考察了上樣溶液pH值對(duì)10種氨基糖苷類藥物回收率的影響(見圖4)。結(jié)果表明,TOBRA、NEO、GENT受pH值影響較小,可以忽略不計(jì);STREP、DHSTREP、SPEC、HYGRO在酸性條件下回收率較低,AMIK、KANA、APRA在堿性條件下回收率較低;在中性條件下,10種氨基糖苷的回收率最好。因此,上樣溶液的pH值要控制在6～7。

圖 4 pH對(duì)雞蛋中10種氨基糖苷類藥物加標(biāo)回收率的影響Fig. 4 Effect of pH on the recoveries of the ten aminoglycosides spiked in eggs

2.3 色譜條件的優(yōu)化

由于分子中氨基和羥基的存在,氨基糖苷類藥物在傳統(tǒng)的反相C18色譜柱上無保留,需要在流動(dòng)相中加入七氟丁酸、全氟戊酸等離子對(duì)試劑,與氨基糖苷類藥物結(jié)合形成疏水型離子對(duì),從而改善峰形、增強(qiáng)保留,但離子對(duì)試劑不易揮發(fā),對(duì)離子源有污染,影響質(zhì)譜離子化效率,從而降低靈敏度。為了避免離子對(duì)試劑的使用,本研究選擇親水作用色譜和離子交換色譜來分析氨基糖苷類藥物。

目前報(bào)道的氨基糖苷類藥物分離的固定相有:氨基[19]、未改性的裸硅膠[8]、酰胺[20]、兩性離子[21]和混合型兩性離子[19]。本研究考察了未改性裸硅膠BEH HILIC(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm, Waters公司)、酰胺鍵合的BEH Amide(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm, Waters公司)和混合型兩性離子鍵合的Obelisc R (150 mm×2.1 mm, 5 μm, SIELC) 3種類型的色譜柱。結(jié)果表明,Obelisc R色譜柱對(duì)10種氨基糖苷的分離最好,這歸因于氨基糖苷類藥物為堿性化合物,當(dāng)pH

2.4 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

氨基糖苷類抗生素的結(jié)構(gòu)中含有多個(gè)羥基,極性很強(qiáng),因此選擇電噴霧離子源。分別考察氨基糖苷類藥物在正離子和負(fù)離子模式下的響應(yīng),發(fā)現(xiàn)正離子模式比負(fù)離子模式的響應(yīng)高很多,這歸因于氨基糖苷類物質(zhì)的結(jié)構(gòu)中含有多個(gè)伯胺或仲胺基團(tuán),具有弱堿性,易被電離成正離子。將標(biāo)準(zhǔn)溶液注入HPLC-MS/MS儀,在全掃描模式下,獲得化合物的分子離子峰,結(jié)合各化合物的分子式,本研究選擇的分子離子峰均為[M+H]+;在產(chǎn)物離子掃描模式下,以各個(gè)化合物的分子離子峰為母離子,進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜掃描,獲得碎片離子,選擇兩對(duì)豐度較強(qiáng),基質(zhì)干擾較小的離子為子離子,優(yōu)化后的質(zhì)譜條件見表1。

2.5 基質(zhì)效應(yīng)

樣品中除分析物以外的組分常常對(duì)分析物的離子化效率產(chǎn)生顯著的干擾,影響分析結(jié)果的準(zhǔn)確性,因此需要對(duì)基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行評(píng)價(jià)。ME≈0,表明無明顯的基質(zhì)效應(yīng),若ME>0,表明基質(zhì)效應(yīng)增強(qiáng),若ME<0,表明基質(zhì)效應(yīng)抑制。雞蛋中10種氨基糖苷類藥物的基質(zhì)效應(yīng)見圖5,結(jié)果表明,STREP、AMIK、KANA基本無基質(zhì)效應(yīng),DHSTREP、TOBRA、HYGRO、APRA、SPEC、NEO的|ME|小于30%, GENT基質(zhì)效應(yīng)強(qiáng)。因此,本研究采用空白基質(zhì)溶液配制標(biāo)準(zhǔn)曲線,以消除基質(zhì)效應(yīng)的影響,提高分析結(jié)果的準(zhǔn)確性。

圖 5 雞蛋中10種氨基糖苷類藥物基質(zhì)效應(yīng)的評(píng)價(jià)圖Fig. 5 Matrix effects of the ten aminoglycosides spiked in eggs

2.6 方法學(xué)驗(yàn)證

2.6.1線性關(guān)系、檢出限與定量限

將基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作溶液(5、10、20、50、100、200 μg/L)進(jìn)行HPLC-MS/MS測(cè)定,獲得標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量色譜圖。以定量離子的峰面積(y)對(duì)其質(zhì)量濃度(x)作標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到線性回歸方程。分別向空白雞蛋樣品中加入2.5、5、12.5和25 ng的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),以S/N≥3確定方法的檢出限為2～5 μg/kg,以S/N≥10確定方法的定量限為5～10 μg/kg。10種氨基糖苷的線性范圍、回歸方程、線性相關(guān)系數(shù)、方法檢出限和定量限見表2。在質(zhì)量濃度5～200 μg/L范圍內(nèi),定量離子的峰面積與質(zhì)量濃度之間呈良好的線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)均大于0.99。空白雞蛋中10種氨基糖苷類藥物定量限水平的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)色譜圖見圖6。

圖 6 空白雞蛋中10種氨基糖苷類藥物定量限水平的 多反應(yīng)監(jiān)測(cè)色譜圖Fig. 6 MRM chromatograms of the ten aminoglycosides spiked in eggs at LOQs

2.6.2回收率與精密度

分別向空白雞蛋樣品中添加低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度水平的標(biāo)準(zhǔn)溶液,每個(gè)水平做6個(gè)平行實(shí)驗(yàn),測(cè)定10種氨基糖苷類藥物的回收率,考察方法的精密度(見表3)。由表3可知,雞蛋樣品中10種氨基糖苷類藥物的加標(biāo)回收率在68.1%～111.3%之間,RSD在1.2%～12.3%之間,方法的準(zhǔn)確度和精密度滿足GB/T 27404-2008《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范食品理化檢測(cè)》的要求。

表 2 10種氨基糖苷類藥物的線性范圍、回歸方程、 相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限

表 3 10種氨基糖苷類藥物在不同添加水平下的回收率和 精密度(n=6)

2.7 實(shí)際樣品分析

采用本方法對(duì)山東省各個(gè)超市采購(gòu)的20批次雞蛋樣品進(jìn)行測(cè)定,根據(jù)化合物的色譜保留時(shí)間和質(zhì)譜離子豐度進(jìn)行鑒別,所測(cè)樣品中均未檢出氨基糖苷類藥物殘留。

3 結(jié)論

本工作建立了雞蛋中10種氨基糖苷殘留量的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析方法。該方法前處理流程操作簡(jiǎn)便,目標(biāo)化合物獲得良好的回收率,檢測(cè)靈敏度高,重現(xiàn)性好,滿足方法確認(rèn)要求,適用于雞蛋中氨基糖苷類藥物殘留的批量檢測(cè)。