冷誘導液液萃取-分散固相萃取凈化-超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法同時測定雞蛋中白僵菌素和4種恩鐮孢菌素殘留

劉柏林, 倪 曼, 單曉梅, 謝繼安, 戴雁羽, 張 程

(1. 安徽省疾病預防控制中心, 安徽 合肥 230601; 2. 安徽醫(yī)科大學, 安徽 合肥 230032)

恩鐮孢菌素(ENNs)和白僵菌素(BEA)是由鐮刀菌屬菌種產生的代謝產物[1-3],主要污染谷物及其制品[4-7]。常見的恩鐮孢菌素有恩鐮孢菌素A(ENNA)、恩鐮孢菌素A1(ENNA1)、恩鐮孢菌素B(ENNB)和恩鐮孢菌素B1(ENNB1)。近年來,隨著研究的深入,動物性食品和人類母乳中均檢出這兩類毒素[8-11]。國外學者研究表明BEA和ENNs具有遺傳毒性和細胞毒性[12-14],有些毒性甚至超過先前發(fā)現(xiàn)的其他生物毒素,可能與其他生物毒素產生協(xié)同毒害作用[15]。目前,對于BEA和ENNs毒性的研究,國內少有報道[16],且國標GB 2761-2017中還沒有規(guī)定這兩類毒素的限值。調查發(fā)現(xiàn),我國玉米、小麥及其制品受到BEA與ENNs不同程度的污染,山東省部分地區(qū)玉米及其制品中BEA的檢出率為82.3%, 4種ENNs的檢出率為3.8%～56.3%[17],韓小敏等[18]在從北京、安徽、寧夏等省(市/自治區(qū))采集的市售玉米及其制品中同時檢出BEA、ENNA、ENNA1與ENNB1,小麥及其制品中檢出BEA和4種ENNs,其中ENNB與ENNB1的含量達到111.95和71.66 μg/kg,且發(fā)現(xiàn)小麥及其制品中的污染水平甚至高于玉米及其制品。玉米、小麥及其制品是動物養(yǎng)殖的主要飼料,動物食用高毒素污染的飼料后,增加毒素在動物組織或副產品中殘留的風險,如牛奶與雞蛋[19]。新興生物毒素的污染引發(fā)的食品安全問題值得我們廣泛關注,開展動物源性食品中BEA和ENNs污染水平的檢測,為風險評估及制定BEA與ENNs的限值提供數(shù)據支持,同時,我省農村散養(yǎng)環(huán)節(jié)的雞蛋中BEA和ENNs缺少例行監(jiān)測,為此開展檢測具有重要意義。

近年來,液相色譜-串聯(lián)質譜法(LC-MS/MS)具有選擇性好、抗干擾能力強、靈敏度高、二級質譜可有效排除假陽性、分析通量高等優(yōu)勢,成為多種毒素檢測的首選方法[20]。目前,BEA和ENNs的檢測方法有高效液相色譜法(HPLC)[4]和LC-MS/MS[3,6-11,21],其中LC-MS/MS是主流分析方法,這些分析方法大多是以谷物及其制品、中草藥與食用油為基質樣品,結合液液萃取法[9],固相萃取法[8,18,22]及QuEChERS法[23,24]等前處理技術建立的,針對動物源性食品中BEA和ENNs的檢測方法[8-9,22]報道較少。動物源性食品的基質復雜,采用液液萃取法,提取液中的脂類等雜質較難除去,容易污染儀器,影響色譜柱壽命,而固相萃取法雖能夠除去干擾雜質,但前處理步驟復雜,操作時間長,檢測效率低,不適合批量分析。分散固相萃取(dispersive solid phase extraction, DSPE)法是結合液液萃取和固相萃取而建立的前處理技術,采用吸附劑吸附雜質,具有溶劑用量少、環(huán)保、經濟、簡單快速、靈敏度高等優(yōu)點[25]。冷誘導液-液萃取技術(CI-LLE)是基于水與乙腈混合液在溫度低于零度的條件下會發(fā)生相分離,極性強的化合物溶解在水相中,極性弱的化合物溶解在乙腈中[26],而實現(xiàn)液液萃取的目的。該技術于1999年被Yoshida等[27]首次報道后,被學者不斷研究和探索,與氣相色譜-質譜法(GC-MS)、LC-MS/MS等檢測技術聯(lián)用測定食品中的有害物質[28,29],應用領域進一步擴大。采用CI-LLE技術萃取后,將上層溶液再經DSPE方法凈化,能顯著降低基質效應的影響[30]?？紤]到選取的5種待測物均屬于低極性化合物,本實驗采用CI-LLE與DSPE相結合處理樣品,優(yōu)化冷凍溫度與時間、乙腈與水的比例及DSPE凈化劑用量等前處理條件,提高了BEA與ENNs的提取與凈化效率,充分發(fā)揮改良的DSPE法的優(yōu)勢,建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法(UPLC-MS/MS)準確測定雞蛋中BEA和4種ENNs毒素含量的分析方法。該方法靈敏度與準確度高、樣品前處理步驟簡便,經濟實用,適用于禽蛋食品中BEA與ENNs的高通量快速分析。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

ACQUITYTMUPLC超高效液相色譜-Xevo TQ質譜儀(美國Waters公司); Heidolph多點振蕩器(德國Heidolph公司); Milli-Q超純水制備儀(美國Millipore公司); Haier DW-86L33超低溫冰箱(海爾生物醫(yī)療有限公司); Legend Mach 1.6R高速冷凍離心機(美國Thermo Fisher公司), 15 mL與50 mL聚丙烯塑料離心管(美國Thermo Fisher公司)。

甲醇、乙腈、甲酸與乙酸(均為色譜純,德國Merck公司);乙酸銨、甲酸銨(色譜純,美國Sigma-Aldrich公司);N-丙基乙二胺(PSA)與C18凈化劑(均為50 μm,美國Agilent公司);氯化鈉(分析純,國藥集團化學試劑有限公司);恩鐮孢菌素A、恩鐮孢菌素A1、恩鐮孢菌素B與恩鐮孢菌素B1純度均大于99.0%,購自澳大利亞Bioaustralis公司;白僵菌素純度大于99.0%,購自加拿大TRC公司;13C45-白僵菌素標準儲備液購自青島Pribolab公司,質量濃度為25 mg/L。

雞蛋樣品采集于本省不同地區(qū)的農村散養(yǎng)戶、超市與農貿市場。

1.2 標準溶液的配制

分別稱取恩鐮孢菌素A、恩鐮孢菌素A1、恩鐮孢菌素B、恩鐮孢菌素B1和白僵菌素1 mg(準確至0.01 mg),分別用乙腈溶解并定容至10 mL,配制100 mg/L標準儲備溶液,-20 ℃下密封保存。

分別準確吸取5種標準貯備液100 μL于10 mL容量瓶中,加乙腈稀釋至刻度,得到1 mg/L的混合標準使用液;吸取同位素內標(13C45-BEA)儲備液400 μL于10 mL容量瓶中,加乙腈稀釋至刻度,得到1 mg/L的同位素內標使用液,密封后于-20 ℃保存。

表 1 5種待測物及白僵菌素同位素內標的質譜參數(shù)

1.3 樣品前處理

取10枚雞蛋,去殼,混合均勻,準確稱取2 g(精確到0.01g)混勻的蛋液于50 mL離心管中,加入25 μL同位素內標使用液,靜置30 min后,加入20 mL乙腈-水-乙酸(79∶20∶1, v/v/v)提取液,渦旋振蕩提取20 min,放入-40 ℃冷凍冰箱中靜置30 min,然后在4 ℃下以10 000 r/min離心10 min。移取2 mL上清液置于裝有70 mg C18凈化劑的15 mL離心管中,渦旋1 min后,10 000 r/min離心5 min,收集凈化液于另一個離心管中,40 ℃下氮氣吹干,用1 mL乙腈水溶液(80∶20, v/v)溶解殘留物,渦旋振蕩1 min, 4 ℃下10 000 r/min離心5 min,取上清液供UPLC-MS/MS分析。

1.4 分析條件

1.4.1色譜條件

色譜柱:Waters ACQUITY UPLC BEH C18柱(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm),保護柱(5 mm×2.1 mm, 1.7 μm);柱溫:40 ℃;樣品室溫度:10 ℃;流速:0.3 mL/min;流動相A: 5 mmol/L甲酸銨水溶液;流動相B:乙腈;梯度洗脫程序:0～3.0 min, 35%A～5%A; 3.0～4.0 min, 5%A; 4.0～4.5 min, 5%A～35%A; 4.5～6.0 min, 35%A。進樣量:5 μL。

1.4.2質譜條件

離子源:電噴霧電離(ESI+)源;毛細管電壓:3.0 kV;離子源溫度:150 ℃;脫溶劑氣溫度:500 ℃;脫溶劑氣流量:800 L/h;碰撞氣流量:0.12 mL/min;多反應監(jiān)測(MRM)模式。待測物的母離子、子離子及對應的碰撞能量、錐孔電壓等質譜參數(shù)見表1。

2 結果與討論

2.1 質譜條件的優(yōu)化

采用色譜柱進樣的方式將質量濃度為500 μg/L的5種標準品分別注入質譜中,一級質譜全掃描,正離子模式下,掃描目標物的特征離子,選擇響應值最高的離子作為母離子,分別往流動相中添加酸與銨鹽,發(fā)現(xiàn)5種待測物均產生[M+H]+與[M+NH4]+離子峰,比較了[M+H]+與[M+NH4]+離子峰響應值的強度,表明[M+NH4]+離子峰響應值明顯高于[M+H]+,其中ENNA的[M+NH4]+離子峰響應強度是[M+H]+離子峰的125倍,所以選擇[M+NH4]+離子作為各待測物的母離子(見表1)。按照歐盟2002/657/EC指令,低分辨率質譜檢測待測物時應選擇兩個適宜的子離子的要求,對母離子進行子離子掃描,選擇響應值高且信號穩(wěn)定的子離子為定量離子,響應值稍低的子離子為定性離子,通過儀器自動優(yōu)化功能優(yōu)化質譜參數(shù),各待測物子離子的碰撞能量、錐孔電壓見表1。

2.2 流動相的選擇

圖 1 BEA和4種ENNs標準品的總離子流色譜圖Fig. 1 Total ion current (TIC) chromatograms of BEA and four ENNs

2.3 樣品前處理條件的優(yōu)化

2.3.1提取溶劑的選擇

提取動物源性食品中的待測物時,甲醇和乙腈是兩種常用的有機溶劑,但雞蛋為高蛋白質樣品,純甲醇與乙腈會使蛋白質變性,樣品脫水,迅速結塊,影響提取效率。故選取了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-水-酸與乙腈-水-酸等溶劑作為提取溶劑。以陰性的雞蛋作為基質樣品,加入5 μg/L的混合標準溶液,通過計算加標回收率考察不同提取溶劑對5種待測物的提取效果,實驗發(fā)現(xiàn),采用甲醇-水和甲醇-水-酸為提取溶劑時,樣品沉淀物松散,-40 ℃冷凍萃取30 min后,溶解在甲醇中的脂類雜質難析出,甲醇與水相難分層,嚴重影響了待測物的提取效率,4種ENNs的回收率均比較低,為37.0%～68.6%。采用乙腈-水和乙腈-水-酸為提取溶劑時,5種待測物的回收率明顯高于甲醇-水和甲醇-水-酸溶劑(見圖2)。文獻[23]在提取溶劑中加入甲酸,可以提高真菌毒素的穩(wěn)定性,增加提取效率。本實驗比較了乙腈-水溶液中加入1%(v/v)甲酸與1%(v/v)乙酸的提取效果,5種待測物的回收率范圍分別為99.2%～151.0%與103%～144%, 1%甲酸與1%乙酸對回收率沒有明顯差異。但乙腈與水的比例不同會影響回收率大小。

圖 2 不同提取溶劑對5種待測物平均回收率的影響(n=3)Fig. 2 Effects of different extraction solvents on average recoveries of the five analytes (n=3)

因此,優(yōu)化了乙腈與水的比例,如圖3所示,當乙腈含量為49%～59%時,5種待測物的回收率均大于120%,乙腈含量為69%時,BEA的回收率大于120%, 4種恩鐮孢菌素的回收率范圍為87%～116%;當乙腈含量為79%, 5種待測物的回收率為73.1%～100.0%;隨著乙腈含量增加,5種待測物回收率降低。當乙腈-水溶液中乙腈的比例低時,有機相與水相未達到最佳穩(wěn)定平衡條件,溶解在乙腈中的脂類等雜質沉淀不完全,產生較強的基質效應。本實驗選取的5種待測物極性較小,需要高比例的有機相才能完成溶解,綜合考慮,確定乙腈-水-乙酸溶液(79∶20∶1, v/v/v)為最佳提取溶劑,消除了乙腈沉淀蛋白質時致樣品結塊的現(xiàn)象,渦旋能起到勻漿的效果,同時,避免提取更多脂肪、色素等雜質,使得提取效率更好。

圖 3 提取溶劑中乙腈的體積分數(shù)對5種待測物 回收率的影響(n=3)Fig. 3 Effects of volume ratio of acetonitrile in extraction solution on recoveries of the five analytes (n=3)

2.3.2萃取條件的選擇

因樣品提取液中含有一定量的水會影響后續(xù)步驟的濃縮效率,通常考慮在樣品提取液中加入一定量的無機鹽吸附水或使水與乙腈分層后再取乙腈層濃縮。本實驗采用CI-LLE法分離樣品提取液中的水與乙腈,需對該法的冷凍溫度和時間進行優(yōu)化,以提高方法的萃取效率,結果表明,采用-20 ℃冷凍時,需要2 h水與乙腈才能明顯分層,-30 ℃冷凍時,需要1 h, -40 ℃時,30 min后乙腈與水分層明顯,可明顯觀察到底層溶液有沉淀物析出,且5種待測物的平均加標回收率為90%～101%。乙腈的冰點為-45.7 ℃,若溫度選擇-45 ℃以下,提取液結冰,影響待測物分配到乙腈層,提取效率低,故選擇-40 ℃冷凍30 min作為萃取條件,縮短樣品處理時間,提高了濃縮時的效率。

2.3.3凈化劑及含量的選擇

提取液-40 ℃下冷凍30 min, 4 ℃ 10 000 r/min離心后,取上層2 mL提取液直接濃縮近干、復容后,進樣液的顏色較深,無法除去,易對儀器與色譜柱造成污染,5種待測物的平均回收率為128%,超出了70%～120%的范圍,說明存在基質效應。因此,離心后的2 mL上層溶液需經DSPE進一步凈化。本實驗比較了PSA、C18及兩者混合使用的凈化效果,添加2.5 μg/L的混合標準溶液到陰性雞蛋樣品中,按照1.3節(jié)前處理方法提取樣品,取2 mL上層溶液,分別加入50mg PSA、50 mg C18和50 mg PSA+50 mg C18等凈化劑。結果表明,經C18凈化后,5種待測物的回收率為67.0%～87.5%;采用PSA凈化時,5種待測物的回收率為69.3%～83.1%,可見,C18與PSA作為凈化劑時,5種待測物均能獲得較高的回收率,沒有明顯差異。但經C18凈化后的樣品液的顏色明顯比PSA凈化的淺;采用C18與PSA混合凈化時,BEA的回收率為86.8%, 4種ENNs的回收率為50.1%～61.2%,回收率較低,兩種凈化劑同時使用時,對待測物吸附作用較強,影響回收率結果,需要對兩者用量比例進行優(yōu)化。為節(jié)省凈化劑,本實驗選擇C18作為凈化劑,同時,考察了不同用量的C18對5種待測物加標回收率的影響,當使用70 mg C18作為凈化劑時,5種待測物能獲得最高的回收率,范圍為81.1%～101%,且均在70%～120%范圍之內,如圖4所示,當凈化劑用量大于70 mg時,C18對ENNB1、ENNA和ENNA1有吸附作用,回收率降低,因此,選擇70 mg C18作為本實驗的凈化劑。

圖 4 C18凈化劑用量對待測物回收率的影響(n=3)Fig. 4 Effects of dosages of C18 absorbent on recoveries of the five analytes (n=3)

2.4 基質效應

基質效應(ME)主要是由于樣品在離子化時基質成分與目標化合物相互競爭電離而導致目標化合物的質譜信號強度有不同程度的增強或減弱[31],是影響結果準確性的一個重要因素,常被用于評價樣品前處理方法,基質效應越強,方法的準確性越低[32]。本實驗采用1.3節(jié)樣品前處理方法制備空白雞蛋基質提取液,然后分別以乙腈-水溶液(80∶20, v/v)和空白雞蛋基質提取液為溶劑,配制溶劑標準曲線和基質校準曲線,通過公式ME=(基質標準曲線斜率/溶劑標準曲線斜率-1)×100%[33]來計算5種待測物的基質效應,以評價基質中干擾物對分析物的影響。結果表明,BEA、ENNB、ENNB1、ENNA1與ENNA的基質效應分別為2.70%、45.1%、24.2%、31.5%與5.16%, 5種待測物的ME均大于0,屬于基質增強效應;且ENNB、ENNB1、ENNA1的ME在20%～50%之間,為中等基質效應;因此,本實驗在所有樣品和標準曲線中加入全碳標記的穩(wěn)定同位素內標(13C45-BEA),以內標法定量分析BEA,消除基質效應;對于無法獲得穩(wěn)定同位素內標的4種恩鐮孢菌素采用基質匹配標準曲線來消除樣品的基質效應,從而保證檢測結果的準確性。

2.5 方法學驗證

2.5.1線性關系、檢出限和定量限

以陰性雞蛋為基質樣品,稱取8份,按1.3節(jié)方法提取和凈化,濃縮后復溶獲得空白雞蛋基質提取液,將8份空白基質提取液合并為一份,混勻后,使用該提取液配制0.1、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0與50.0 μg/L的系列混合標準溶液,加入白僵菌素的同位素內標,使質量濃度為2.5 μg/L,供UPLC-MS/MS分析。待測物BEA采用內標法定量,以待測物與相對應同位素內標的峰面積之比為縱坐標(yIS),相應的質量濃度為橫坐標(x, μg/L);待測物ENNA、ENNA1、ENNB與ENNB1采用外標法定量,以待測物的峰面積為縱坐標(y),相應的質量濃度為橫坐標(x, μg/L),繪制基質標準曲線。結果表明,5種待測物在0.1～50.0 μg/L范圍內線性關系良好,相關系數(shù)(r2)均大于0.998(見表2)。

圖 5 實際雞蛋樣品中BEA的色譜圖(9.82 μg/kg)Fig. 5 Chromatograms of BEA in actual egg samples (9.82 μg/kg)

在陰性雞蛋樣品中添加不同濃度的混合標準溶液,按照上述前處理方法與色譜條件進行分析,分別以3倍和10倍信噪比(S/N)對應的加標濃度定義檢出限(LOD)與定量限(LOQ),以LOD與LOQ評估方法的靈敏度,如表2所示,5種待測物的LOD范圍為0.05～0.15 μg/kg, LOQ的范圍為0.20～0.50 μg/kg。

2.5.2準確度及精密度

本實驗取陰性空白雞蛋樣品,分別添加低、中、高3個濃度水平(0.5、5.0和25.0 μg/kg)的混合標準溶液,按樣品前處理方法進行提取與凈化,每個加標濃度進行6次重復實驗,回收率結果見表3, 5種待測物的平均加標回收率為81.1%～106%,相對標準偏差(RSD)為0.27%～9.79%。

表 2 5種待測物的線性范圍、線性方程、相關系數(shù)、檢出限及定量限

2.6 實際樣品的測定

應用本方法對隨機購買的114份雞蛋樣品(69份來自農村散養(yǎng)戶,45份來自市售超市與農貿市場)進行檢測,其中4種恩鐮孢菌素均未檢出,BEA有檢出,BEA在農村散養(yǎng)雞蛋中檢出率為30.4%(21/69份),含量范圍為0.31～9.82 μg/kg,平均含量1.68 μg/kg, 45份市售雞蛋中僅1份樣品中檢出BEA,含量為4.30 μg/kg。雞蛋陽性樣品的TIC色譜如圖5所示,待測物BEA檢出,4種ENNs的含量低于方法檢出限。

3 結論

本文建立了冷誘導液液萃取-分散固相萃取凈化-超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法同時測定雞蛋樣品中白僵菌素與4種恩鐮孢菌素的分析方法。對前處理方法與色譜條件進行了優(yōu)化,并進行了一系列的方法學驗證。該方法前處理簡單快速,降低了分析成本,提高了檢測效率,避免復雜的凈化過程中目標物的損失,適合批量禽蛋樣品中白僵菌素與恩鐮孢菌素快速、準確定量檢測。