β2－糖蛋白Ⅰ的多重作用及其抗體在血液系統(tǒng)疾病中的研究進(jìn)展*

王詩雨，李莉娟，黃梅，郭曉嘉，張連生（蘭州大學(xué)第二醫(yī)院血液科，蘭州730030）

β2－糖蛋白Ⅰ（β2-glycoprotein I，β2-GPⅠ）是一種由肝細(xì)胞合成的糖蛋白，在血漿中根據(jù)其功能活性的不同以游離形式和脂蛋白相關(guān)形式存在?？功?-GPⅠ抗體是抗磷脂抗體綜合征（antiphospholipid syndrome，APS）最具特征的抗體之一，其與抗心磷脂抗體（anticardiolipin antibody，aCL）及狼瘡抗凝物質(zhì)（Lupus anticoagulant，LA）等其他磷脂或磷脂復(fù)合物共同組成了抗磷脂抗體（antiphospholipid antibody，aPL）。許多健康人的血漿中有低滴度、低親和力的天然抗β2-GPⅠ抗體，其血漿濃度隨著年齡的增長而增加［1-2］。

現(xiàn)有研究表明，β2-GPⅠ在調(diào)節(jié)出凝血、補(bǔ)體、血管生成及免疫等方面具有重要作用，其作為一種存在于血漿中的多功能磷脂結(jié)合糖蛋白，對β2-GPⅠ功能的研究可能對臨床上多種血液系統(tǒng)疾病的輔助診斷、治療及預(yù)后判斷有重要價(jià)值。在檢驗(yàn)方面，分離純化β2-GPⅠ對研究其功能具有重要意義，臨床上對抗β2-GPⅠ抗體的檢測也逐漸從ELISA過度到靈敏度及特異性更高的化學(xué)發(fā)光免疫分析法（chemiluminescence immunoassay，CLIA）。

本文從β2-GPⅠ的結(jié)構(gòu)入手，綜述了β2-GPⅠ的作用、β2-GPⅠ及其抗體相關(guān)檢測方法、其在血液系統(tǒng)疾病中的研究進(jìn)展，為進(jìn)一步輔助臨床診斷及治療提供一定依據(jù)。

1 β2-GPⅠ結(jié)構(gòu)

β2-GPⅠ屬于補(bǔ)體控制蛋白超家族，由5個(gè)高度同源補(bǔ)體控制結(jié)構(gòu)域串聯(lián)而成，即結(jié)構(gòu)域Ⅰ（DomainⅠ，DⅠ）－結(jié)構(gòu)域Ⅴ（DomainⅤ，DⅤ）［3］。研究表明，β2-GPⅠ在血漿中至少有“O”、“J”、“S”三種構(gòu)型；游離狀態(tài)時(shí)，DⅠ和DⅤ之間相互作用形成閉合的環(huán)狀“O”型；當(dāng)遇到暴露的陰性磷脂表面時(shí)，由于DⅤ與陰性磷脂親和性強(qiáng)，閉合環(huán)狀會(huì)打開，并形成魚鉤狀結(jié)構(gòu)“J”型，錨定在陰性磷脂表面，DⅠ此時(shí)可完全暴露，“J”型可能是β2-GPⅠ在血漿中的活性形式［4-5］。

β2-GPⅠ在機(jī)體中的構(gòu)型變化可由分子相互作用、翻譯后修飾、遺傳改變或內(nèi)環(huán)境變化引起，這種構(gòu)型上的轉(zhuǎn)化暴露了DⅠ中的隱秘表位，從而使抗β2-GPⅠ抗體與之結(jié)合，β2-GPⅠ抗原抗體復(fù)合物的形成會(huì)導(dǎo)致自身免疫病患者血栓形成風(fēng)險(xiǎn)增加［4，6］。有學(xué)者認(rèn)為β2-GPⅠ可能存在幾種中間形式，這些中間形式可能導(dǎo)致了β2-GPⅠ在機(jī)體內(nèi)的多種反應(yīng)活性，但這些中間形式的穩(wěn)定性及作用目前還亟待研究。β2-GPⅠ的大致結(jié)構(gòu)如圖1。

圖1 β2-GPⅠ的“O”型及“J”型結(jié)構(gòu)及其與抗體的可能結(jié)合方式

2 β2-GPⅠ的多重作用

2.1 調(diào)節(jié)出凝血 β2-GPⅠ不僅具有抗凝作用，還具有促凝及調(diào)節(jié)血小板的作用，其對出凝血的調(diào)節(jié)平衡取決于周圍環(huán)境，但機(jī)體中這種平衡是如何維持的目前尚不清楚，并且β2-GPⅠ在血液中的各種作用并不是獨(dú)立存在的，各種作用之間可能互相影響。

2.1.1 抗凝作用 β2-GPⅠ作為一種磷脂結(jié)合糖蛋白，具有生理抗凝劑的作用，其可以下調(diào)凝血酶生成、抑制凝血酶誘導(dǎo)的纖維蛋白生成和血小板聚集，并可以抑制血栓調(diào)節(jié)蛋白復(fù)合物形成，使正常血漿中的活化的部分凝血活酶時(shí)間（activated partial thromboplastin time，APTT）延長［7-9］。但在疾病狀態(tài)中，其多表現(xiàn)為促凝作用。

2.1.2 促凝作用 對APS的研究表明，β2-GPⅠDⅠ的表位甘氨酸40－精氨酸43（Glycine 40-Arginine 43，G40-R43）主要負(fù)責(zé)結(jié)合血栓形成相關(guān)的抗體，可能與其促凝作用密切相關(guān)［10］。β2-GPⅠ可通過抑制蛋白C活化和破壞抗凝血膜聯(lián)蛋白Ⅴ（annexin 5）的晶體防護(hù)層來實(shí)現(xiàn)其促凝作用［8］。臨床上，抗β2-GPⅠDⅠ和抗磷脂酰絲氨酸／凝血酶原抗體及aCL等aPL的共存提示嚴(yán)重的血栓形成風(fēng)險(xiǎn)，對存在血栓形成風(fēng)險(xiǎn)的患者，需積極予以監(jiān)測aPL水平及出凝血指標(biāo)［11-12］。Kelchtermans等［13］對抗β2-GPⅠ抗體類別的meta分析表明，抗β2-GPⅠIgG與血栓形成的相關(guān)性更高，但在少數(shù)疾病中抗β2-GPⅠIgM與血栓形成更為相關(guān)。

2.1.3 調(diào)節(jié)血小板作用 β2-GPⅠ具有調(diào)節(jié)血小板的作用，這種調(diào)節(jié)作用會(huì)對出凝血產(chǎn)生不同程度的影響。在疾病狀態(tài)中，β2-GPⅠ抗原抗體復(fù)合物的形成可以激活血小板受體如糖蛋白Ⅰb-α（glycoproteinⅠb-α，GPⅠb-α）、載脂蛋白E受體2（apolipoprotein E receptor 2，ApoER2）、G蛋白偶聯(lián)受體（G protein coupled receptor，GPCR）和血小板糖蛋白受體Ⅵ（glycoproteinⅥ，GPⅥ）等，并與血小板因子4（platelet factor4，PF4）相互作用，從而影響血小板活化，而血小板活化后會(huì)表達(dá)組織因子（tissue factor，TF），并釋放其他不同的促凝介質(zhì)，促進(jìn)血栓的形成，乙酰肝素酶抑制劑可以抑制這一過程；在另一方面，β2-GPⅠ能夠抑制血小板與血管性血友病因子（von Willebrand factor，vWF）的結(jié)合，干擾vWF依賴性血小板粘附，進(jìn)而抑制血栓形成［14-18］。這種促凝與抗凝的反向作用體現(xiàn)了β2-GPⅠ在調(diào)節(jié)出凝血平衡中的重要性。

2.2 調(diào)節(jié)補(bǔ)體 β2-GPⅠ屬于補(bǔ)體控制蛋白超家族，其在體內(nèi)外均有補(bǔ)體調(diào)節(jié)作用，其在生理上對補(bǔ)體的調(diào)節(jié)程度是未知的［8］。Gropp等［19］認(rèn)為β2-GPⅠ具有作為補(bǔ)體抑制的輔助因子的作用，其可通過經(jīng)典及旁路兩種不同的途徑抑制補(bǔ)體激活，“J”型β2-GPⅠ可以更好的結(jié)合C3，為補(bǔ)體因子H提供結(jié)合位點(diǎn)，從而介導(dǎo)補(bǔ)體因子Ⅰ對C3降解及C3b裂解，在調(diào)節(jié)補(bǔ)體中起重要作用。aPL對補(bǔ)體的激活會(huì)產(chǎn)生C5a，從而誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞組織因子依賴性促凝活性［20］。β2-GPⅠ這種對補(bǔ)體的調(diào)節(jié)作用可能使其參與了血栓形成及炎癥免疫等多種機(jī)體反應(yīng)。

2.3 調(diào)節(jié)血管生成 β2-GPⅠ對血管生成的調(diào)節(jié)作用同樣取決于DⅠ。研究顯示，β2-GPⅠ對血管生成的調(diào)節(jié)作用有劑量依賴性，N-β2GPⅠ（nickedβ2-GPⅠ）在較低濃度下具有血管生成特性，在較高濃度下則具有抗血管生成特性［21］。一方面，β2-GPⅠ可以下調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞上的血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）受體激酶插入域受體／胎肝激酶1（kinase insert domain receptor／fetal liver kinase 1，KDR／Flk1）的表達(dá)，并阻止絲裂原活化蛋白激酶／細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（mitogen-activated protein kinases／extracellular signal-regulated kinase，MAPK／ERK）和磷脂酰肌醇3－激酶／蛋白激酶B／糖原合酶激酶－3β（phosphatidylinositol 3-kinase／protein kinaseB／glycogen synthase kinase-3β，PI3K／Akt／GSK3β）途徑中VEGF下游效應(yīng)分子的磷酸化；另一方面，β2-GPⅠ衍生的肽還以劑量依賴性反應(yīng)增加了可溶性fms樣酪氨酸激酶1（soluble fms-like tyrosine kinase 1，sFlt-1）的表達(dá)，從兩個(gè)方面起到了抗血管生成的作用［22-24］。β2-GPⅠ的這種抗血管生成作用可能在實(shí)體腫瘤治療中有一定價(jià)值。

2.4 調(diào)節(jié)免疫 β2-GPⅠ具有結(jié)合并中和脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）的能力，其與LPS的結(jié)合可以直接或間接觸發(fā)凝血，在感染免疫中具有一定的調(diào)節(jié)作用。體外研究證實(shí)，β2-GPⅠ可以抑制LPS誘導(dǎo)的單核細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)促炎因子，對炎癥有負(fù)性調(diào)控作用；另一方面，β2-GPⅠ及其抗體釋放的信號(hào)可以刺激內(nèi)皮細(xì)胞釋放出微粒／細(xì)胞外囊泡，這些微粒／囊泡可以以自分泌或旁分泌的方式刺激周圍的靜止細(xì)胞，進(jìn)而有一定的促炎作用［25］。感染患者β2-GPⅠ水平與C反應(yīng)蛋白（C reaction protein，CRP）、白細(xì)胞介素－6（interleukin-6，IL-6）等炎癥指標(biāo)水平及體溫呈顯著負(fù)相關(guān)，因此高水平的β2-GPⅠ可能抑制了炎癥進(jìn)展，并且可以作為感染程度的判定指標(biāo)之一［26-27］。

此外，β2-GPⅠ在細(xì)胞免疫中也起到一定程度作用。體外研究表明樹突狀細(xì)胞（dendritic cell，DC）可以將β2-GPⅠ衍生的肽呈遞給T細(xì)胞，并激活β2-GPⅠ反應(yīng)性CD4＋T細(xì)胞的增殖和活化，導(dǎo)致Th1細(xì)胞因子如γ－干擾素（interferon-γ，IFN-γ）為主的產(chǎn)生，并可以促進(jìn)B細(xì)胞產(chǎn)生抗β2-GPⅠ抗體，形成抗原抗體復(fù)合物導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化等疾病的發(fā)生［6，28-29］。He等［30］研究表明β2-GPⅠ可以促進(jìn)骨髓衍生樹突狀細(xì)胞（bone marrow derived dendritic cells，BMDCs）的增殖，DC分泌的細(xì)胞因子和DC-T細(xì)胞相互作用可以增強(qiáng)β2-GPⅠ誘導(dǎo)的Th2分化，導(dǎo)致部分患者的免疫失衡。DC、T細(xì)胞和B細(xì)胞在APS患者針對β2-GPⅠ的免疫反應(yīng)的啟動(dòng)和持續(xù)中起著重要作用。對于存在血栓形成高危因素的患者，可以同時(shí)檢測β2-GPⅠ及淋巴細(xì)胞亞群的水平，預(yù)測血栓形成風(fēng)險(xiǎn)。

3 β2-GPⅠ及其抗體分離檢測

β2-GPⅠ是由肝細(xì)胞合成的具有326個(gè)氨基酸的單鏈蛋白，平均相對分子量（M r）為54 200，人血漿含量約為200 μg／mL［3］。獲得純化β2-GPⅠ對研究其功能有重要意義，純化β2-GPⅠ常用的方法是通過高氯酸沉淀，但高氯酸可能會(huì)影響分子的完整性，而利用聚乙二醇（PEG）4000沉淀配合Heparin-Sepha-rose CL-6B親和層析和Source 15S離子交換層析的方法可以有效地從人血漿中提取純度＞95%的完整β2-GPⅠ［1，31］。將純化的人β2-GPⅠ用DL－二硫蘇糖醇（DL-dithiothreitol，DTT）激活的硫氧還蛋白－1（Thioredoxin-1，TRX-1）脫氧，然后用谷胱甘肽（Glutathione，GSH）來阻斷游離硫醇，可以在體外獲得穩(wěn)定的還原β2-GPⅠ，這種還原的β2-GPⅠ在體外具有天然生物活性，并具有抗氧化應(yīng)激和抗炎能力，有助于對其功能的進(jìn)一步研究［32］。

抗β2-GPⅠ抗體作為APS重要的抗體之一，在臨床上主要的檢測方法是ELISA，其過程繁瑣，需要75～80 min進(jìn)行樣本溫育、酶結(jié)合物溫育及底物溫育等步驟，但ELISA對設(shè)備儀器條件及操作人員水平要求不高。2019年《抗磷脂抗體檢測的臨床應(yīng)用專家共識(shí)》指出可以應(yīng)用CLIA對抗β2-GPⅠ抗體進(jìn)行檢測，CLIA是一種全自動(dòng)的方法，并且僅需20～25 min孵育及Meg-wash（利用磁力分離技術(shù)清洗掉無用底物）即可讀取結(jié)果，較ELISA更快捷，并具有更高的靈敏度、特異性及準(zhǔn)確性，可以提高抗體的檢出率，但費(fèi)用昂貴，因此在臨床上較少應(yīng)用，可作為ELISA的一種替代方法［33-34］。此外，還有斑點(diǎn)印記檢測法、薄層色譜法等，由于靈敏度較差及檢測流程復(fù)雜被淘汰［35-36］。

4 β2-GPⅠ及其抗體在血液系統(tǒng)疾病中的相關(guān)研究及意義

4.1 免疫性血小板減少癥 免疫性血小板減少癥（immune thrombocytopenia，ITP）是一種以自身抗體介導(dǎo)的血小板破壞和代償性血小板生成不足為特征的疾病，該抗體可加速血小板破壞并抑制其產(chǎn)生。對具有抗GPⅡb／Ⅲa抗體的ITP患者體內(nèi)和體外研究發(fā)現(xiàn)，低水平的β2-GPⅠ與補(bǔ)體激活能力增強(qiáng)相關(guān)，β2-GPⅠ可以作為抗GPⅡb／Ⅲa介導(dǎo)的ITP治療的潛在診斷生物標(biāo)志物和治療靶標(biāo)［37］。

有10%～70%的ITP患者出現(xiàn)一種或多種aPL陽性，具體取決于疾病的活動(dòng)程度［38］。Dayama等［39］研究表明，在約12%的ITP患者中檢測到aPL陽性，其中以慢性ITP患者比例最高，并以抗β2-GPⅠ抗體最為常見，慢性ITP患者的血漿抗β2-GPⅠIgG水平升高，并與激素耐藥顯著相關(guān)，抗β2-GPⅠ抗體可能是ITP患者APS或其他自身免疫病進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)的影響因素，并可以作為激素治療反應(yīng)的預(yù)測指標(biāo)之一［40］。2020版中國ITP治療指南［41］提出，合并GPⅠb特異性自身抗體陽性的ITP患者使用丙種球蛋白的治療效果不佳，建議有條件的患者檢測糖蛋白特異性自身抗體，有助于丙種球蛋白的療效預(yù)判。

目前并未發(fā)現(xiàn)除ITP外的其他血液系統(tǒng)自身免疫相關(guān)疾病與β2-GPⅠ及其抗體的相關(guān)研究，對于其他血液系統(tǒng)自身免疫性疾病是否具有相關(guān)性，仍需進(jìn)一步研究。

4.2 白血病 體外研究表明，用β2-GPⅠ抗原抗體復(fù)合物處理單核細(xì)胞或THP-1細(xì)胞可以增加TF、髓樣分化因子88（myeloid differentiation factor88，MyD88）、β干擾素TIR結(jié)構(gòu)域銜接蛋白（TIR-domain-containing adaptor inducing interferon-β，TRIF）以及腫瘤壞死因子（tumor necrosis factorα，TNF-α）的表達(dá)，TLR4及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑有助于上述作用的形成［42-43］。β2-GPⅠ可能因其調(diào)節(jié)出凝血及抗血小板的作用參與了白血病的疾病進(jìn)展，目前對于β2-GPⅠ在白血病的研究僅限于對急性髓系白血病THP-1細(xì)胞系及相關(guān)信號(hào)通路，對其在臨床上的應(yīng)用研究相對較少，針對不同類型白血病β2-GPⅠ是否有某種確切意義仍需相關(guān)實(shí)驗(yàn)佐證。

4.3 淋巴瘤 小樣本研究表明新診斷的非霍奇金淋巴瘤（non-Hodgkin′s lymphoma，NHL）患者抗β2-GPⅠ抗體水平升高，以IgA及IgM升高為主，抗β2-GPⅠ抗體的升高與無事件生存期（events free survival，EFS）縮短呈正相關(guān)［44-45］。NHL患者可能確實(shí)存在抗β2-GPⅠ抗體等aPL的升高，但不一定會(huì)增加患者的血栓形成風(fēng)險(xiǎn)，并與疾病的嚴(yán)重程度，血栓形成風(fēng)險(xiǎn)，治療結(jié)果或總體生存率無關(guān)［46-47］。

目前對于抗β2-GPⅠ抗體在淋巴瘤中的作用觀點(diǎn)不盡相同，但我們建議對于抗β2-GPⅠ抗體陽性的腫瘤患者，在初始治療期間應(yīng)考慮進(jìn)行預(yù)防性抗凝治療，以預(yù)防血栓栓塞事件的發(fā)生。

5 展望

目前對于β2-GPⅠ的研究主要集中在APS，其在機(jī)體中具有調(diào)節(jié)出凝血、調(diào)節(jié)補(bǔ)體、調(diào)節(jié)血管生成及參與免疫調(diào)節(jié)等多重作用，仍具有很大的研究空間。目前在臨床檢驗(yàn)方面，CLIA法的使用很大程度上提升了抗β2-GPⅠ抗體檢測的效率及準(zhǔn)確性。根據(jù)β2-GPⅠ在不同疾病及宿主功能不同，給與針對性的治療將有助于預(yù)防血栓形成、炎癥感染及疾病進(jìn)展等。β2-GPⅠ作為潛在的新型治療靶點(diǎn)，其在血液系統(tǒng)出凝血疾病及自身免疫相關(guān)性疾病中具有一定的研究價(jià)值，并且對其免疫調(diào)節(jié)功能的研究將有助于炎癥調(diào)控及部分血栓栓塞性疾病的風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測。