抗核抗體熒光核型在原發(fā)性膽汁性膽管炎和自身免疫性肝炎篩查中的作用評(píng)估*

王之青，鄭冰（上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海200127）

抗核抗體（antinuclear antibodies，ANA），又稱抗細(xì)胞抗體（anti-cellular antibody，AC），是包括針對(duì)真核細(xì)胞內(nèi)各種抗原成分的自身抗體總稱，其對(duì)自身免疫病具有較高的診斷敏感性。人喉鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系Hep-2（Human epithelial type 2）細(xì)胞含有數(shù)百種天然抗原，以Hep-2細(xì)胞為底物的間接免疫熒光法（indirect immunofluorescence assay，IFA）可檢測(cè)患者血清中不同自身抗體，并呈現(xiàn)相應(yīng)的熒光核型［1］。國(guó)際抗核抗體熒光核型共識(shí)（international consensus on ANA patterns，ICAP）目前定義并命名了30種熒光核型，每種核型名稱以AC（anticell）開(kāi)頭（AC-0～AC-29），并在ICAP網(wǎng)站（www.ANApatterns.org）歸納了不同熒光核型所對(duì)應(yīng)的臨床意義［2］。該工作對(duì)于闡述ANA熒光核型的免疫學(xué)相關(guān)性和優(yōu)化IFA檢測(cè)在患者疾病診斷中的應(yīng)

用具有重要意義。本研究通過(guò)分析原發(fā)性膽汁性膽管炎（primary biliary cirrhosis，PBC）和自身免疫性肝炎（autoimmune hepatitis，AIH）患者ANA熒光核型的檢出情況，評(píng)估HEp-2 IFA在PBC和AIH患者疾病篩查中的意義及相關(guān)核型與特異性自身抗體檢出率的相關(guān)性。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象 選取上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院2019年4—12月進(jìn)行自身免疫性肝?。╝utoimmune liver disease，ALD）篩查試驗(yàn)并明確診斷為PBC和AIH的患者，排除臨床信息不全的樣本。PBC和AIH的診斷依據(jù)分別為2017年歐洲肝病學(xué)會(huì)臨床實(shí)踐指南［3］和2015年我國(guó)AIH診斷和治療共識(shí)［4］。PBC患者106例，年齡（53.3±11.4）歲，其中女性92例（86.8%），男性14例（13.2%）；AIH患者138例，年齡（52.1±12.8）歲，其中女性120例（87.0%），男性18例（13.0%）。

1.2 試劑與儀器 自身抗體譜IgG檢測(cè)試劑盒（IFA）、ALD IgG類抗體檢測(cè)試劑盒（免疫印跡法，德國(guó)歐蒙公司），抗肌動(dòng)蛋白IgG抗體檢測(cè)試劑盒（酶聯(lián)免疫法，美國(guó)INOVA公司）；Sprinter-XL全自動(dòng)分析儀、EUROLineMaster Plus-A全自動(dòng)免疫印跡儀（德國(guó)歐蒙公司）。

1.3 方法 用IFA法檢測(cè)血清ANA、抗線粒體抗體（anti-mitochondrial antibody，AMA）和抗平滑肌抗體（anti-smooth muscle antibody，ASMA），用自身抗體譜IgG檢測(cè)試劑盒在Sprinter-XL全自動(dòng)分析儀上進(jìn)行檢測(cè)。按試劑說(shuō)明書(shū)，滴度≥1∶100判為陽(yáng)性。ANA熒光核型判讀依據(jù)ICAP所定義的30種熒光核型（AC-0～AC-29）。

用免疫印跡法檢測(cè)ALD相關(guān)特異性抗體，采用ALD IgG類抗體檢測(cè)試劑盒在全自動(dòng)免疫印跡儀EUROLineMaster Plus-A進(jìn)行檢測(cè)和結(jié)果判讀。特異性抗體譜包括：線粒體抗體M2亞型（AMA-M2）、肝溶質(zhì)抗原1型（LC-1）抗體、肝腎微粒體抗體（LKM-1）、2－丙酮酸脫氫酶（M2-3E）抗體、早幼粒細(xì)胞白血病蛋白（PML）抗體、Ro52抗體、可溶性肝抗原／肝胰抗原（SLA／LP）抗體、斑點(diǎn)蛋白（Sp100）抗體和糖蛋白210（gp210）抗體，結(jié)果判定依據(jù)試劑說(shuō)明書(shū)。

用酶聯(lián)免疫法檢測(cè)抗F-肌動(dòng)蛋白抗體，用抗肌動(dòng)蛋白IgG抗體檢測(cè)試劑盒在Sprinter-XL全自動(dòng)分析儀上進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果判定依據(jù)試劑說(shuō)明書(shū)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 用SPSS 22.0、GraphPad Prism 5.01軟件進(jìn)行。計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)用例數(shù)（n）、百分率（%）進(jìn)行描述，皮爾森卡方檢驗(yàn)或Fisher確切概率法分析；正態(tài)分布計(jì)量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ˉ±s）表示，用t檢驗(yàn)分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ANA檢出率及主要核型分析 PBC和AIH患者ANA檢出率分別為91.5%（97／106）和68.8%（95／138）。PBC患 者 中 單 一 核 型 占37.7%（40／106），混合核型占53.8%（57／106）。單一核型中，檢出率前三位是胞漿網(wǎng)狀／線粒體樣型（AC-21）［13.2%（14／106）］、粗顆粒型（AC-5）［4.7%（5／106）］以及均質(zhì)型（AC-1）、細(xì)顆粒型（AC-4）、點(diǎn) 狀 核 膜 型（AC-12）［均 為3.8%（4／106）］；混合核型檢出率最高的為著絲點(diǎn)型（AC-3）合并AC-21［13.2%（14／106）］。

AIH患者中單一核型占43.5%（60／138），混合核型占25.4%（35／138）。單一核型中，檢出率最高的是細(xì)顆粒型（AC-4）［14.5%（20／138）］；混合核型檢出率最高的為AC-12合并AC-21［8.0%（11／138）］。

PBC和AIH患者不同單一核型中的檢出率見(jiàn)表1。熒光核型在PBC和AIH患者中檢出率（包括在單一核型和復(fù)合核型中出現(xiàn)情況）見(jiàn)圖1。

圖1 不同熒光核型在106例PBC和138例AIH患者中的檢出率

表1 不同熒光核型在PBC和AIH患者中分布

2.2 胞漿網(wǎng)狀／線粒體樣型和胞漿顆粒型與AMA 用106例PBC患者中，以鼠腎為基質(zhì)的IFA法檢測(cè)AMA的檢出率為61.3%（65／106），而以HEp-2為基質(zhì)的IFA熒光核型表現(xiàn)為胞漿網(wǎng)狀／線粒體樣型（AC-21）的檢出率為50.9%（54／106），兩者檢出率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。IFA熒光核型判讀為AC-21的樣本中AMA（IFA法）檢出率為90.7%（49／54），其中滴度1∶100、1∶320和1∶1 000分別為18.5%（10／54）、40.7%（22／54）和31.5%（17／54）。LIA法檢測(cè)AMA-M2與抗M2-3E抗體在AC-21核型中檢出率分別為87.0%（47／54）和94.4%（51／54）。AC-21核型中，AMA（IFA法）、AMA-M2和抗M2-3E抗體均陰性樣本占1.9%（3／54）。

其他胞漿顆粒型熒光核型，包括胞漿散點(diǎn)型（AC-18）、胞漿致密顆粒型（AC-19）和胞漿細(xì)顆粒型（AC-20），AMA（IFA法）檢出率分別為0、100.0%（2／2）和25.0%（1／4）。AMA-M2（LIA法）在AC-18、AC-19和AC-20熒光核型中檢出率分別為0、50.0%（1／2）和25.0%（1／4）；抗M2-3E抗體（LIA法）在上述3種核型中檢出率分別為0、100.0%（2／2）和25.0%（1／4）。

除AC-21核型以及3種胞漿顆粒型熒光核型以外，其他熒光核型和ANA陰性（AC-0）樣本AMA（IFA法）檢出率分別為36.8%（14／38）和0；AMA-M2（LIA法）檢出率分別為15.8%（6／38）和11.1%（1／9）；抗M2-3E抗體（LIA法）檢出率分別為34.2%（13／38）和0。AMA在上述各種ANA核型中檢出率結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 PBC患者中AMA在AC-21熒光核型與其他核型中的檢出率分布

138例AIH患者中，AMA（IFA法）檢出率為19.6%（27／138），而熒光核型表現(xiàn)為AC-21的檢出率為50.9%（25／138），兩者檢出率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.758）。熒光核型判讀為AC-21的樣本中AMA（IFA法）檢出率為88.0%（22／25），其中滴度1∶100、1∶320和1∶1 000分別為12.0%（3／25）、44.0%（8／25）和32.0%（8／25）。LIA法 檢 測(cè)AMA-M2與抗M2-3E抗體在AC-21核型樣本中檢出率分 別為72.0%（18／25）和88%（22／25）。AC-21核型中，AMA（IFA法）、AMA-M2和M2-3E均陰性樣本占12%（3／25）。

其他胞漿顆粒型熒光核型（AC-18、AC-19和AC-20），AMA（IFA法）檢出率分別為100.0%（1／1）、25.0%（1／4）和20.0%（1／5）。AMA-M2（LIA法）在AC-18、AC-19和AC-20熒光核型中檢出率分別為0、25.0%（1／4）和40.0%（2／5）；抗M2-3E抗體（LIA法）在上述3種核型中檢出率分別為100.0%（1／1）、0和33.3%（2／5）。

除AC-21以及3種胞漿顆粒型熒光核型以外，其他熒光核型和ANA陰性（AC-0）樣本，AMA（IFA法）檢出率分別為3.3%（2／60）和0；AMA-M2（LIA法）檢出率分別為3.3%（2／60）和0；抗M2-3E抗體（LIA法）檢出率分別為3.3%（2／60）和0?？咕€粒體抗體在上述各種ANA核型中檢出率結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 AIH患者中AMA在AC-21熒光核型與其他核型檢出率分布

2.3 核點(diǎn)型與抗Sp100和抗PML抗體 106例PBC患者中，10.4%（11／106）ANA熒光核型為核多點(diǎn)型（AC-6），3.8%（4／106）為核少點(diǎn)型（AC-7）?？筍p100抗體和抗PML抗體在AC-6檢出率均明顯高于AC-7以及除AC-6和AC-7以外的其他ANA核型。138例AIH患者中，1.4%（2／138）ANA熒光核型為核多點(diǎn)型（AC-6），0.7%（1／138）為核少點(diǎn)型（AC-7）?？筍p100抗體在AC-6檢出率均明顯高于AC-7以及除AC-6和AC-7以外的其他ANA核型。見(jiàn)表4。

表4 PBC患者中抗Sp100抗體和抗PML抗體在AC-6熒光核型與其他核型檢出率分布

2.4 點(diǎn)狀核膜型與抗gp210抗體 106例PBC患者中，24.5%（26／106）ANA熒光核型為點(diǎn)狀核膜型（AC-12），光滑核膜型（AC-11）未檢出?？筭p210抗體在AC-12檢出率明顯高于其他ANA核型。138例AIH患者中，16.0%（17／106）ANA熒光核型為點(diǎn)狀核膜型（AC-12），光滑核膜型（AC-11）未檢出。抗gp210抗體在AC-12檢出率明顯高于AC-11及除AC-11和AC-12以外其他ANA核型。見(jiàn)表5。

表5 PBC患者中抗gp210抗體在AC-12熒光核型與其他核型檢出率分布

2.5 胞漿纖維型與ASMA和抗F－肌動(dòng)蛋白抗體 106例PBC患者中，未檢出胞漿線性／肌動(dòng)蛋白型（AC-15）熒光核型。138例AIH患者中，1.5%（2／138）ANA熒光核型為胞漿線性／肌動(dòng)蛋白型（AC-15），0.7%（1／138）為 胞 漿 絲 狀／微 管 型（AC-16），胞漿節(jié)段型（AC-17）未檢出。ASMA和抗F－肌動(dòng)蛋白在AC-15中的檢出率明顯高于AC-16和除AC-15、16和17以外的其他核型。見(jiàn)表6。

表6 AIH患者中ASMA和抗F－肌動(dòng)蛋白抗體在AC-15熒光核型與其他核型檢出率分布

3 討論

IFA法檢測(cè)抗核抗體對(duì)自身免疫病篩查具有重要作用，其檢測(cè)結(jié)果中包括抗體滴度和熒光核型。其中，抗體滴度與患者體內(nèi)ANA含量呈一定相關(guān)性，雖然一般人群中也存在低滴度ANA［5］，但系統(tǒng)性自身免疫病患者體內(nèi)一般為中、高滴度抗體；而熒光核型則與特定樣本中所含的特異性自身抗體有關(guān)，有助于自身免疫病的診斷與鑒別診斷。ICAP目前共定義了30種熒光核型，且依據(jù)判讀的難易程度將30種核型分為必報(bào)核型和選報(bào)核型［2］。而2018年由中國(guó)醫(yī)師協(xié)會(huì)風(fēng)濕免疫科醫(yī)師分會(huì)自身抗體檢測(cè)專業(yè)委員會(huì)發(fā)布的《抗核抗體檢測(cè)的臨床應(yīng)用專家共識(shí)》［6］中明確指出，由于ALD在我國(guó)發(fā)病率較高，建議將ICAP所規(guī)定核膜型（AC-11／12）和胞漿線性／肌動(dòng)蛋白型（AC-15）熒光核型，由選報(bào)核型變?yōu)楸貓?bào)核型。因此，本研究通過(guò)分析PBC和AIH患者中ANA熒光核型和特異性自身抗體檢測(cè)的相關(guān)性，評(píng)估熒光核型在ALD篩查中的作用。

本研究中，PBC患者ANA檢出率91.5%，且陽(yáng)性樣本中大部分為混合核型，而AIH患者ANA檢出率僅68.8%，陽(yáng)性樣本中以單一核型為主。Wei等［7］對(duì)中國(guó)137名PBC患者和57名AIH患者進(jìn)行ANA熒光核型分析，其中PBC患者混合核型占33.6%，而AIH患者混合核型僅3.5%，與本研究結(jié)果相似。另外，AC-21核型是PBC患者中最常見(jiàn)的ANA核型，且在AIH患者中也有18.1%的檢出率，而其他胞漿顆粒型（包括AC-18／19／20）檢出率僅0～3.8%。在PBC患者中AC-21熒光核型血清中AMA（IFA法）、AMA-M2和M2-3E檢出率分別為90.7%、87.0%和94.4%，明顯高于胞漿顆粒型AMA檢出率（25.0%）和其他熒光核型（除外AC-18／19／20／21）AMA檢出率（15.8%～36.8%）。因此，實(shí)驗(yàn)室對(duì)AC-21核型的準(zhǔn)確判讀，對(duì)后續(xù)進(jìn)行AMA抗體檢測(cè)具有重要提示作用。臨床實(shí)驗(yàn)室應(yīng)將該核型作為實(shí)驗(yàn)室必報(bào)熒光核型，并與其他胞漿顆粒型（包括AC-18／19／20）進(jìn)行區(qū)分。

核膜型在ICAP定義中分為光滑核膜型（AC-11）和點(diǎn)狀核膜型（AC-12），兩者對(duì)應(yīng)靶抗原不同。前者主要靶抗原為核纖層蛋白，臨床尚無(wú)商品化檢測(cè)試劑盒，可于健康人中檢出且無(wú)疾病特異性［2］；后者主要靶抗原為抗核孔復(fù)合體抗體，如gp210、nup62和Tpr，其中抗gp210抗體是PBC患者特異性診斷標(biāo)志，可在9.4%～41.2%的PBC患者中檢出，而健康人群和其他疾病人群中檢出率僅0～0.4%［8］。本研究中，AC-12在PBC患者中檢出率24.5%，位居第二，且未檢出光滑核膜型（AC-11）；PBC患者中AC-12樣本抗gp210抗體檢出率高達(dá)95.2%，而非核膜型抗gp210抗體檢出率僅21.1%。因此，準(zhǔn)確識(shí)別AC-12核型，對(duì)于后續(xù)PBC相關(guān)抗體檢測(cè)具有重要意義。但由于HEp-2間期細(xì)胞核通常呈細(xì)顆粒樣染色，AC-12易誤判為核顆粒型；另外胞漿網(wǎng)狀／線粒體樣型熒光核型也會(huì)對(duì)核膜型的判讀造成干擾。此時(shí)，以猴肝細(xì)胞為基質(zhì)的熒光片可以輔助判讀，通常情況下核膜型可在猴肝細(xì)胞核外圈有明顯核膜染色。

核多點(diǎn)型（AC-6）對(duì)應(yīng)的靶抗原主要為Sp100和PML，兩者常共同檢出于PBC患者；核少點(diǎn)型（AC-7）對(duì)應(yīng)的靶抗原主要為p80－螺旋蛋白，其對(duì)于對(duì)任何疾病的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值都較低［2］。本研究中，AC-6在PBC患者中檢出率為10.4%，位居第五，且AC-6陽(yáng)性樣本中抗Sp100抗體檢出率為90.9%，而AC-7中該抗體檢出率僅25.0%?？筍p100抗體對(duì)PBC診斷敏感性雖較低（20%～40%），但特異性高（＞95%）［9］，并且在AMA陰性PBC患者的診斷具有重要價(jià)值［10］。因此，臨床實(shí)驗(yàn)室判讀核點(diǎn)型時(shí)，區(qū)分核多點(diǎn)與核少點(diǎn)對(duì)于ALD篩查具有重要意義。

本研究中，PBC患者中并未檢出AC-15，而AIH患者中AC-15檢出率僅1.5%。2例AC-15樣本中，1例ASMA陽(yáng)性，2例抗F－肌動(dòng)蛋白抗體均陽(yáng)性，因此AC-15核型對(duì)ASMA有一定相關(guān)性。臨床實(shí)驗(yàn)室對(duì)ALD篩查人群進(jìn)行ANA核型判讀時(shí)，尤其需重視胞漿網(wǎng)狀／線粒體樣型、點(diǎn)狀核膜型、核多點(diǎn)型和胞漿線性／肌動(dòng)蛋白型熒光核型，并在報(bào)告中給予必要的臨床建議。