不同活力煙草種子抗氧化酶活性差異與相關(guān)性分析

王國平， 潘 威， 牛永志， 古 吉， 周東潔， 鄭昀曄,2

(1.玉溪中煙種子有限責(zé)任公司，云南省煙草種子工程技術(shù)中心， 云南 玉溪 653100；2.云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院， 云南 玉溪 653100)

種子功能的一個關(guān)鍵組成部分是種子活力。種子活力決定了種子發(fā)芽迅速、整齊的能力。高活力的種子表現(xiàn)出發(fā)芽率高、萌發(fā)速度快、出苗整齊度高、幼苗生長旺盛、抗逆性強(qiáng)等特點，對于提高作物資源利用率和保障后期產(chǎn)質(zhì)量具有重要意義[1]。

煙草是重要的經(jīng)濟(jì)作物，在我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中具有重要地位，為發(fā)展地方經(jīng)濟(jì)、增加國家財政收入做出了巨大的貢獻(xiàn)。煙草種子是煙葉生產(chǎn)的源頭，提高種子質(zhì)量，保障“兩煙”生產(chǎn)，一直是行業(yè)普遍關(guān)心的問題。目前，煙草種子活力主要是通過萌發(fā)過程中的發(fā)芽指標(biāo)(發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù))來評價，這也是最普遍最直接的評價方法之一。但該方法也存在檢測時間較長，不能全面、準(zhǔn)確反映種子質(zhì)量的缺陷，因此，開展煙草種子活力評價方法的篩選十分必要。

活性氧(ROS)是指分子氧的單電子還原后產(chǎn)生的一類代謝產(chǎn)物和衍生物，主要包括超氧陰離子自由基(O2·-)、羥基自由基(·OH)、過氧化氫(H2O2)等[2]。ROS參與種子休眠、萌發(fā)、逆境脅迫等生物學(xué)過程[3]。作為信號分子，ROS與脫落酸(ABA)和赤毒素(GA)存在交互作用[4-5]。而ABA和GA的平衡在調(diào)控種子休眠與萌發(fā)中發(fā)揮主導(dǎo)作用，ABA促進(jìn)和維持種子休眠，GA促進(jìn)種子萌發(fā)和拮抗ABA的抑制作用[6]。此外，ROS與其他激素，如：細(xì)胞分裂素(CKs)、水楊酸(SA)、茉莉酸(JA)、乙烯也存在交互作用，間接調(diào)控種子萌發(fā)[7]。植物體細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生和清除處于一種動態(tài)平衡，當(dāng)ROS水平過高時，又會轉(zhuǎn)變?yōu)槎竞Ψ肿樱斐赡ぶ^氧化，導(dǎo)致膜的組分和結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。過量的ROS可以通過包括超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、過氧化物酶(POD)、抗壞血酸過氧化物酶(APX)等的抗氧化酶系統(tǒng)清除[8]。

ROS在種子生活史發(fā)揮重要作用，關(guān)于種子成熟[9]、萌發(fā)[10-11]、貯藏[12]等階段的抗氧化酶的變化研究也有很多報道。本研究從不同活力種子角度，探討不同活力種子萌發(fā)和幼苗建成階段的抗氧化酶差異以及變化情況，期望篩選到抗氧化酶反映種子活力大小的最佳方法。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

選用不同活力的煙草種子，分別為2008年采收、精選的MS云煙85種子(編號：MS云煙85-H)和2001年采收、未精選的MS云煙85種子(編號：MS云煙85-L)。種子來源于玉溪中煙種子有限責(zé)任公司種子庫。

1.2 實驗方法

1.2.1發(fā)芽指標(biāo)測定

利用置種儀將種子播到墊有用自來水濕潤的海綿和濾紙的培養(yǎng)皿(加蓋)上，每皿100粒，3次重復(fù)。將培養(yǎng)皿置于25 ℃、光照為12 h的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14 d，培養(yǎng)過程中定期補充水分保持濾紙濕潤。從第4天開始，每天統(tǒng)計發(fā)芽數(shù)量。發(fā)芽的標(biāo)準(zhǔn)為：胚根長度達(dá)種子長度的兩倍。

發(fā)芽率(%)=(第14天供試種子的發(fā)芽數(shù)/供試種子總數(shù))×100%；

發(fā)芽勢(%)=(第7天供試種子的發(fā)芽數(shù)/供試種子總數(shù))×100%；

發(fā)芽指數(shù)=∑(Gt/Dt)，Gt為t日的發(fā)芽數(shù)，Dt為發(fā)芽天數(shù)。

1.2.2抗氧化酶活性測定

測定不同活力種子萌發(fā)1 d、2 d、3 d、4 d、5 d的CAT、SOD和POD活性。稱取0.05 g干種子，利用試劑盒(分光光度法)測定酶活性，試劑盒購買于北京索萊寶科技有限公司。生理生化指標(biāo)測定過程中因操作產(chǎn)生的誤差較大，應(yīng)多做重復(fù)，選擇穩(wěn)定性較好的3個重復(fù)作為最終實驗數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同活力煙草種子發(fā)芽特性分析

種子活力檢測最常用、最直接的方法是測定發(fā)芽特性。本研究檢測了不同活力煙草種子MS云煙85-H和MS云煙85-L的發(fā)芽情況。結(jié)果顯示，MS云煙85-H在第4天大部分已經(jīng)發(fā)芽，而MS云煙85-L在第4天剛剛開始發(fā)芽。從第4天到第7天每天的發(fā)芽數(shù)量變化較大，到第7天以后每天的發(fā)芽數(shù)量基本穩(wěn)定(圖1 B)。MS云煙85-H的發(fā)芽率為97.67%，發(fā)芽勢為96.33%，發(fā)芽指數(shù)為19.16；MS云煙85-L的發(fā)芽率為83.33%，發(fā)芽勢為79.00%，發(fā)芽指數(shù)為15.18(表1)。在發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)上，MS云煙85-H和MS云煙85-L之間均達(dá)到了極顯著差異，活力高的種子發(fā)芽率高、發(fā)芽速度快，在發(fā)芽指標(biāo)方面表現(xiàn)出明顯的優(yōu)勢。另外，活力高的種子胚根更長，幼苗更大(圖1 A)，在幼苗素質(zhì)方面也表現(xiàn)出優(yōu)勢。

注：A為不同活力煙草種子發(fā)芽過程；B為不同活力煙草種子每天發(fā)芽情況。

表1 不同活力煙草種子發(fā)芽指標(biāo)

2.2 種子萌發(fā)過程中抗氧化酶活性分析

在萌發(fā)過程中，MS云煙85-H的CAT酶活性整體呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，在第2天略微下降，第4天達(dá)到頂峰，第5天迅速下降，第4天與其他處理差異顯著，第3天與第1、2、5天差異顯著，第1、2、5天之間差異不顯著。MS云煙85-L的CAT酶活性持續(xù)升高，第4天和第5天之間差異不顯著，與其他處理間差異顯著，第3天與第2天差異不顯著，與第1天差異顯著，第2天與第1天差異不顯著(圖2，表2)。MS云煙85-H的SOD酶活性呈先升高后降低的趨勢，第4天達(dá)到頂峰，第5天迅速下降，第4天與其他處理差異顯著，其他處理之間差異不顯著。MS云煙85-L的SOD酶活性持續(xù)升高，第5天與其他處理差異顯著，第4天與第3天差異不顯著，與第1、2天差異顯著，第3天與第1、2天差異不顯著(圖3，表2)。MS云煙85-H的POD酶活性呈持續(xù)升高，第5天與其他處理差異顯著，第4天與第1、2、3天差異顯著，第3天與第1、2天差異顯著，第1天和第2天差異不顯著。MS云煙85-L的POD酶活性呈持續(xù)升高，第5天和第4天差異不顯著，與其他處理差異顯著，其他處理間差異不顯著(圖4，表2)。

圖2 不同活力煙草種子萌發(fā)過程中CAT酶活性變化

圖3 不同活力煙草種子萌發(fā)過程中SOD酶活性變化

圖4 不同活力煙草種子萌發(fā)過程中POD酶活性變化

本研究中的萌發(fā)階段指的是從種子吸脹到幼苗子葉完全展開。按照萌發(fā)天數(shù)來看，活力較高的種子CAT和SOD酶活性前3 d內(nèi)先緩慢升高，第4天迅速升高，到第5天后迅速下降，POD酶活性前3 d內(nèi)先緩慢升高，到第4天和第5天迅速升高；活力較低的種子CAT、SOD和POD酶活性持續(xù)升高，速度相對平緩。按照種子發(fā)芽生物學(xué)過程來看，無論是第4天的高活力種子還是第5天的低活力種子，這一時期正是完成胚軸伸長和胚根突出的時期，所以，CAT和SOD酶活性在萌發(fā)過程中先不斷升高，直到完成胚軸伸長和胚根突出，而后下降，POD酶活性則不斷升高。

2.3 不同活力種子抗氧化酶活性分析

在不同活力種子方面(表2)，MS云煙85-H的CAT酶活性在前4天均高于MS云煙85-L，第1天差異極顯著，第2天差異不顯著，第3天和第4天差異顯著；MS云煙85-H的CAT酶活性在第5天低于MS云煙85-L，且達(dá)到顯著水平。在第4天，MS云煙85-H的CAT酶活性高于MS云煙85-L，且差異達(dá)到最大，所以可以選用第4天的CAT酶活性反映種子活力。MS云煙85-H的SOD酶活性在第1天和第5天低于MS云煙85-L，且第1天差異不顯著，第5天差異顯著；MS云煙85-H的SOD酶活性在第2、3天和第4天高于MS云煙85-L，且第2天差異顯著，第3天差異不顯著，第4天差異極顯著。在第4天，MS云煙85-H的SOD酶活性高于MS云煙85-L，且差異達(dá)到最大，所以可以用第4天的SOD酶活性反映種子活力。MS云煙85-H的POD酶活性在第1天低于MS云煙85-L，且差異不顯著；MS云煙85-H的POD酶活性在第2、3、4天和第5天高于MS云煙85-L，且第2天差異不顯著，第3、4、5天差異極顯著。在第5天，MS云煙85-H的POD酶活性高于MS云煙85-L，且差異達(dá)到最大，所以可以用第5天的POD酶活性反映種子活力。

表2 不同活力煙草種子抗氧化酶活性

2.4 種子活力與抗氧化酶活性的相關(guān)性分析

為了驗證CAT、SOD、POD酶是否可以作為種子活力評價的生理指標(biāo)，用MS云煙85-H和MS云煙85-L的發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)分別與CAT、SOD、POD酶活性做相關(guān)性分析。結(jié)果顯示(表3)，種子發(fā)芽指標(biāo)與第5天的CAT酶活性和SOD酶活性呈負(fù)相關(guān)，其余都是正相關(guān)。對于CAT酶，種子發(fā)芽指標(biāo)與第1、4天和第5天的酶活性復(fù)相關(guān)性系數(shù)(R2)均較高；對于SOD酶，種子發(fā)芽指標(biāo)與第4天和第5天的酶活性復(fù)相關(guān)性系數(shù)均較高；對于POD酶，種子發(fā)芽指標(biāo)與第3、4天和第5天的酶活性復(fù)相關(guān)性系數(shù)均較高。結(jié)合不同活力種子間抗氧化酶活力差異大小，可以選擇第4天的CAT和SOD酶以及第5天的POD酶活性反映種子活力。

表3 煙草種子發(fā)芽指標(biāo)與抗氧化酶活性的復(fù)相關(guān)系數(shù)

2.5 種子活力與抗氧化酶活性的線性回歸分析

根據(jù)種子活力與抗氧化酶活性的相關(guān)性分析結(jié)果，選擇相關(guān)性較大、抗氧化酶活性差異較大的第4天和第5天，以抗氧化酶活性為自變數(shù)，以種子發(fā)芽指標(biāo)為依變數(shù)，進(jìn)行線性回歸分析(表4)。優(yōu)選第4天的CAT和SOD酶活性以及第5天的POD酶活性反映種子活力。第4天的CAT酶活性表示種子活力的回歸方程分別為：發(fā)芽率Y=0.000 798 1X+63.20，發(fā)芽勢Y=0.001 048X+51.83，發(fā)芽指數(shù)Y=0.000 230 0X+9.302；第4天的SOD酶活性表示種子活力的回歸方程分別為：發(fā)芽率Y=0.076 66X+77.18，發(fā)芽勢Y=0.090 32X+71.97，發(fā)芽指數(shù)Y=0.021 12X+13.50；第5天的POD酶活性表示種子活力的回歸方程分別為：發(fā)芽率Y=0.000 410 4X+67.58，發(fā)芽勢Y=0.000 509 6X+59.20，發(fā)芽指數(shù)Y=0.000 116 0X+10.69。

表4 種子活力與抗氧化酶活性的線性回歸結(jié)果

3 討 論

干種子中ROS并不活躍，但種子開始萌發(fā)后，包括儲藏物質(zhì)的降解、蛋白質(zhì)的合成，能量的產(chǎn)生，初生和次生代謝物的生物合成等一系列的代謝過程激活。線粒體、質(zhì)膜上的過氧化物酶和NADPH氧化酶被認(rèn)為是ROS的主要來源。有研究表明，華中五味子種子萌發(fā)過程中SOD、POD、CAT活性均在種子萌發(fā)前期最低，在裂口率增長最快時(165 d)活性最大，除POD外，SOD、CAT活性在萌發(fā)末期再次下降[11]；小麥種子在吸脹6～30 h過程中，CAT呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢，POD呈現(xiàn)先下降后緩慢升高然后再下降的趨勢[14]。本研究中，煙草種子從吸脹開始到幼苗子葉完全展開，CAT和SOD酶活性先不斷升高，在完成胚軸伸長和胚根突出時達(dá)到頂峰，而后下降，POD酶活性則一直升高。根據(jù)定義，狹義的萌發(fā)開始于靜態(tài)干燥的種子吸水，完成于胚軸伸長和胚根突出[15]。所以，在萌發(fā)過程中，種子CAT、SOD和POD酶活性是不斷升高的。

種子活力的檢測主要從生理、生化、形態(tài)、物理等方面建立方法，傳統(tǒng)的方法有TTC染色法[16]、抗冷測定法[17]、電導(dǎo)率測定法[18]、Q 2檢測技術(shù)[19]等，近年來興起的基于機(jī)器視覺技術(shù)[20-21]、高光譜技術(shù)[22]、電子鼻技術(shù)[23]等的檢測方法。新的檢測技術(shù)具有靈敏度高、檢測速度快的優(yōu)勢，但也存在設(shè)備要求較高的缺點。對于普通的實驗室，傳統(tǒng)的方法仍是最佳的選擇?？寡趸甘且环N生理生化指標(biāo)，并且與種子活力緊密相關(guān)。本研究通過比較不同萌發(fā)時間及不同活力種子抗氧化酶活性差異，分析種子活力與抗氧化酶活性的相關(guān)性，結(jié)果表明，可以選用萌發(fā)第4天的CAT和SOD酶以及第5天的POD酶活性反映煙草種子活力差異。這一結(jié)論進(jìn)一步豐富了煙草種子活力檢測的方法，對于穩(wěn)定種子質(zhì)量，把控種子源頭，保障煙葉生產(chǎn)具有重要意義。

4 結(jié) 論

活力高的種子發(fā)芽率高、發(fā)芽速度快，在發(fā)芽指標(biāo)方面表現(xiàn)出明顯的優(yōu)勢；從種子吸脹開始到幼苗子葉完全展開，CAT和SOD酶活性先不斷升高，在完成胚軸伸長和胚根突出時達(dá)到頂峰，而后下降，POD酶活性則一直升高；可以選擇萌發(fā)第4天的CAT和SOD酶以及萌發(fā)第5天的POD酶活性反映煙草種子活力。