岳佳銘, 叢曉翔, 李曼莉
(中國農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,草業(yè)科學(xué)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京 100193)
種子是植物生長發(fā)育的最小單元,它的質(zhì)量直接影響后期幼苗的生長狀況及種子生產(chǎn)、加工、貯藏等。為了保證種子的質(zhì)量,在種子銷售前,通常會(huì)進(jìn)行種子含水量、發(fā)芽率和凈度等相關(guān)質(zhì)量指標(biāo)的檢測。傳統(tǒng)的種子質(zhì)量檢測方法不僅費(fèi)時(shí)費(fèi)力,而且對種子存在不同程度的破壞性。此外,人工操作帶來的誤差,也會(huì)造成測定結(jié)果準(zhǔn)確性欠佳。所以,如何能夠省時(shí)、省力、無損、準(zhǔn)確地對種子質(zhì)量進(jìn)行檢測,是亟待解決的問題。
如今,在多學(xué)科交叉合作的大趨勢下,計(jì)算機(jī)視覺技術(shù)已廣泛應(yīng)用于食品[1-5]、藥品[6-9]、植物[10-12]等領(lǐng)域。利用高速數(shù)字圖像檢測和計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)處理來改善傳統(tǒng)的種子質(zhì)量分析越來越多。圖像處理所用計(jì)算機(jī)硬件和軟件成本的降低及其性能的提高,使得圖像分析系統(tǒng)在質(zhì)量評估和分類過程的不同方面自動(dòng)檢測中更有優(yōu)勢[13]。圖像采集設(shè)備的改進(jìn),以及實(shí)現(xiàn)快速圖像處理程序的新算法,能夠量化許多種子的形態(tài)特征,這些特征對于多種作物種子的萌發(fā)和活力測試都是必要的[14]。因此,本研究概述了計(jì)算機(jī)視覺技術(shù)中的多光譜成像(Multispectral Imaging,MSI)技術(shù)在種子質(zhì)檢工作中的運(yùn)用,并對該領(lǐng)域未來研究熱點(diǎn)進(jìn)行展望,以期為種子質(zhì)檢工作提供更加快捷、精準(zhǔn)的方法。
多光譜成像系統(tǒng)的主要儀器為Videometer Lab,該設(shè)備是由內(nèi)部涂有白色鈦涂層的空心積分球組成,它能夠提供均勻的散射、高的擴(kuò)散效果和最小的鏡面反射率,沿著球體內(nèi)部赤道,安裝有20個(gè)非均勻分布波長的單色發(fā)光二極管(LED),波長分別為375、405、435、450、470、505、525、570、590、630、645、660、700、780、850、870、890、910、940、970nm(其中包括一個(gè)背景波長)。
一般情況下,Videometer Lab在獲取多光譜圖像前,系統(tǒng)會(huì)使用3個(gè)連續(xù)的平板進(jìn)行輻射和幾何校準(zhǔn):白板用于反射率校正,黑板用于背景校正,由點(diǎn)組成的板用于幾何像素位置校正,接下來便是對光設(shè)置進(jìn)行校準(zhǔn)。
在Videometer Lab工作過程中,具有這種窄帶光譜輻射的LED燈一個(gè)接一個(gè)地間歇性閃爍。樣品的單色圖像由其頂部安裝的CCD相機(jī)在特定波長處獲得,從而在每個(gè)波長產(chǎn)生一個(gè)具有32位浮點(diǎn)精度的每種LED燈的單色圖像。因此,當(dāng)一個(gè)樣品連續(xù)被20個(gè)LED燈照亮?xí)r,就會(huì)得到一個(gè)立方體圖像,其空間維度為2 056×2 056像素,光譜維度為20個(gè)波段,空間分辨率為0.043 2 mm/pixel[15]。
通過使用一些波長計(jì)算方法對多光譜成像數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,直接從整個(gè)光譜中提取與特征相關(guān)的波長波段,所選擇的波長為相關(guān)特征建立獨(dú)立多光譜成像系統(tǒng)的合適候選波段[16-18]。然后,需要通過化學(xué)計(jì)量學(xué)方法對提取的圖像數(shù)據(jù)進(jìn)行定性(分類)及定量(預(yù)測/回歸)的分析及建模。
分類建模方法可以分為監(jiān)督和非監(jiān)督建模方法。利用監(jiān)督技術(shù)建立分類模型,能夠?qū)⑿碌奈粗獦颖靖鶕?jù)其光譜特征劃分為已知其特征的類別;非監(jiān)督模型不需要關(guān)于樣本分組的先驗(yàn)信息。開發(fā)利用的模型具體分為線性和非線性。線性包括歸一化標(biāo)準(zhǔn)判別分析(nCDA)、線性判別分析(LDA)、偏最小二乘回歸分析(PLSR)、偏最小二乘判別分析(PLS-DA)、擴(kuò)展典型變量分析(ECVA)等;非線性包括支持向量機(jī)(SVM)、k-鄰近算法(K-NN)、反向傳播神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(BPNN)等[18-24]。通常,使用較多的是歸一化標(biāo)準(zhǔn)判別分析,它作為一種監(jiān)督變換構(gòu)建方法,將圖像劃分為具有不同光譜特征的感興趣區(qū)域。當(dāng)兩個(gè)不同的品種具有不同的光譜特征時(shí),在歸一化標(biāo)準(zhǔn)判別分析變換后的圖像中會(huì)出現(xiàn)兩個(gè)不同的感興趣區(qū)域,便于解釋、分割以及后續(xù)的數(shù)據(jù)分析[18]。其原理是最小化類內(nèi)觀測距離,最大化類間觀測距離[25]。即便可供使用的建模方法較多,不同試驗(yàn)所用的最適計(jì)算方法卻不同。
種子質(zhì)量不是單一概念,它包含了品種和分析純度、發(fā)芽能力、活力、生活力、種子健康和均勻性[26]。如今,多光譜成像技術(shù)已開始應(yīng)用于種及品種測定、種子凈度分析、種子轉(zhuǎn)基因檢測、種子健康鑒定、種子生活力及活力測定中。
在種子質(zhì)量檢測工作中,種的測定能夠有效鑒別其真實(shí)性,避免種植過程中的種間混雜,保證種子純度。對品種進(jìn)行分離,確定其顯著性、均勻性和穩(wěn)定性標(biāo)準(zhǔn)等關(guān)鍵屬性,對于品種登記、植物育種者的知識(shí)產(chǎn)權(quán)以及在市場上開發(fā)新品種都具有極其重要的意義[27]。傳統(tǒng)測定方法有形態(tài)測定、化學(xué)測定、生化測定(聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)測定、超薄層等電聚焦電泳(UTLIEF)測定)等[28-29]。與傳統(tǒng)方法相比,多光譜成像技術(shù)能夠在不破壞種子的前提下對其進(jìn)行測定,并且通過拍照,減緩了操作人員的視覺疲勞,省去了復(fù)雜的樣品準(zhǔn)備工作,對于種及品種的鑒定是較好的方法。
目前,多光譜成像技術(shù)對種的測定主要有小麥(TriticumaestivumL.)、紫花苜蓿(MedicagosativaL.)、玉米(ZeamaysL.)種子。制作意大利面的硬粒小麥摻假率檢測的傳統(tǒng)方法為DNA檢測,該方法耗時(shí)、需要大量的樣品,并且會(huì)對種子造成損傷[30]。多光譜成像技術(shù)能夠快速、有效區(qū)分硬粒小麥和摻假小麥,避免了傳統(tǒng)方法對種子造成的傷害[31]。為了快速區(qū)分紫花苜蓿和草木樨(Melilotusofficinalis(L.) Pall.)種子,Hu等[19]利用多光譜成像技術(shù)結(jié)合主成分分析(PCA)、線性判別分析、偏最小二乘判別分析、AdaBoost和支持向量機(jī)等方法,根據(jù)紫花苜蓿和草木樨種子的形態(tài)特征和光譜特征或兩者的組合進(jìn)行分類。研究結(jié)果顯示,線性判別分析模型檢驗(yàn)效果最好,驗(yàn)證集的正確率高達(dá)99.58%。對單倍體及雜交玉米的基因型進(jìn)行DNA標(biāo)記后,再利用多光譜成像技術(shù)進(jìn)行區(qū)分,結(jié)果發(fā)現(xiàn)對于大多數(shù)基因型,單倍體鑒定的準(zhǔn)確率都在50%以上[32]。
此外,多光譜成像技術(shù)也能應(yīng)用在番茄(LycopersiconesculentumM.)、水稻(OryzasativaL.)、小麥的品種鑒別中。Shrestha等[27]運(yùn)用多光譜成像技術(shù)對11個(gè)品種的番茄種子進(jìn)行鑒別,并采用歸一化標(biāo)準(zhǔn)判別分析對11個(gè)栽培品種進(jìn)行配對判別分析,正確判別率達(dá)100%,僅少數(shù)對低于85%。之后,再利用偏最小二乘判別分析對所有品種進(jìn)行分類,結(jié)果顯示,該模型對7個(gè)高敏感品種和4個(gè)低敏感品種的分類準(zhǔn)確率分別提高到96%和86%。同樣,對5個(gè)番茄品種種子進(jìn)行快速無損分類的可行性進(jìn)行研究后發(fā)現(xiàn),偏最小二乘判別分析和支持向量機(jī)判別分析的分類精度都很好,從94%到100%不等[33]。利用多光譜成像技術(shù)對20個(gè)不同品種的水稻種子進(jìn)行成像并從圖像中提取特征信息,利用特征數(shù)據(jù)的多變量分析對種子進(jìn)行表型分類,結(jié)果發(fā)現(xiàn),水稻種子品種分類的正確率為93%[11]。Sumriddetchkajorn等[34]使用多光譜成像技術(shù)來鑒定8個(gè)不同品種的水稻種子,并提取水稻的像素?zé)晒鈴?qiáng)度,作為品種識(shí)別的依據(jù),得到了不錯(cuò)的結(jié)果。同樣,多光譜成像技術(shù)結(jié)合化學(xué)計(jì)量分析算法建立的最小二乘支持向量機(jī)模型也能夠以90%的正確率來預(yù)測水稻品種[12]。Vre?ak等[35]將多光譜成像技術(shù)應(yīng)用于冬小麥和黑小麥(TriticosecaleWittm. & Camus)品種鑒別中,結(jié)果表明,只有一個(gè)品種(Agostino)能夠被準(zhǔn)確分類,準(zhǔn)確率為97.4%,其余品種分類正確率均在67%以下。若根據(jù)視覺相似性(顏色、大小、種類)對小麥品種進(jìn)行分組,分類準(zhǔn)確率可大大提高至95.8%。許學(xué)等[36]也對不同品種的小麥進(jìn)行了鑒別,發(fā)現(xiàn)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)鑒定模型效果最佳,能夠有效的區(qū)分5個(gè)小麥品種,建模集和預(yù)測集的識(shí)別率分別為100%和91.25%。
種子凈度分析的對象是凈種子、其他植物種子和雜質(zhì),其目的是測定供驗(yàn)樣品組成及各成分的重量百分率[37-38]。在種子凈度分析中,首先要對大型混雜物(如石塊、土塊或小粒種子中混有大粒種子等)進(jìn)行檢查,再從重型混雜物中分離出其他植物種子及雜質(zhì)。然后對凈種子和其他植物種子分別檢測。凈種子的檢測須根據(jù)種子的明顯特征借助器具或者鑷子試壓,在不損傷發(fā)芽力的基礎(chǔ)上進(jìn)行檢查[39]。測定需要用到凈度分析臺(tái)、篩子、吹風(fēng)機(jī)、放大鏡、天平等[41]。傳統(tǒng)的方法需要有經(jīng)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)員,并且步驟繁瑣,而多光譜成像技術(shù)則會(huì)大大減少工作量,且結(jié)果較準(zhǔn)確。
目前,多光譜成像技術(shù)在種子凈度分析中的應(yīng)用主要針對雜質(zhì)并對其分類。甜菜(BetavulgarisL.)種子收獲后,需要對其進(jìn)行處理,使其形狀和大小保持一致[41]。而在此過程中,種子幾乎都會(huì)受到損傷,種子壽命縮短,產(chǎn)量、發(fā)芽率降低等,所以識(shí)別出機(jī)械損傷的種子并丟棄是非常重要的[42]。Salimi和Boelt[43]利用多光譜成像技術(shù)對甜菜種子5種損傷類型進(jìn)行分類并建立了模型,該模型對5種損傷類別中的200粒種子進(jìn)行分類的平均準(zhǔn)確率達(dá)82%。具體來看,第1~5類的分類準(zhǔn)確率分別為59%、100%、77%、77%和89%,由此認(rèn)為,基于多光譜成像技術(shù)的甜菜種子機(jī)械損傷分類是未來種子質(zhì)量評估的一個(gè)潛在工具。
種子轉(zhuǎn)基因檢測也是種子質(zhì)檢工作的一部分,非轉(zhuǎn)基因種子中混入轉(zhuǎn)基因種子會(huì)影響種子的凈度,同時(shí)也會(huì)威脅食品生物安全。傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因檢測方法有定性PCR法、實(shí)時(shí)熒光定量PCR法、特異蛋白檢測法、生物表現(xiàn)型檢測法等[44-46]。實(shí)時(shí)熒光定量PCR法所用試劑和探針價(jià)格較昂貴,實(shí)驗(yàn)步驟較繁瑣,并且必須破壞種子才能夠完成測定。而多光譜成像技術(shù)避免了轉(zhuǎn)基因生物對環(huán)境的污染,同時(shí)也不會(huì)損壞種子,是進(jìn)行種子轉(zhuǎn)基因測定的一種高效、便捷的方法。
對轉(zhuǎn)基因蘇云金芽孢桿菌水稻種子運(yùn)用多光譜成像技術(shù),結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)的方法進(jìn)行無損鑒定發(fā)現(xiàn),非轉(zhuǎn)基因水稻種子和轉(zhuǎn)基因水稻種子之間差異能夠清晰地顯示出來,試驗(yàn)獲得了很好的分類效果;而且對于多種化學(xué)計(jì)量學(xué)方法進(jìn)行對比后發(fā)現(xiàn),最小二乘支持向量機(jī)模型具有較好的標(biāo)定和預(yù)測能力,精度可達(dá)100%[47]。多光譜成像技術(shù)運(yùn)用在鑒別轉(zhuǎn)基因大豆(GlycinemaxL.)種子中也獲得了不錯(cuò)的結(jié)果,試驗(yàn)采用主成分分析、偏最小二乘判別分析、最小二乘支持向量機(jī)和反向傳播神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)等方法對大豆種子進(jìn)行了分類。結(jié)果表明,傳統(tǒng)大豆和草甘膦除草劑處理的轉(zhuǎn)基因大豆種子及其雜交后代之間的差異明顯,BPNN模型的分類正確率可達(dá)98%[20]。
種子健康檢測的目的是全面提高種子質(zhì)量,防止和控制種傳病害。種子健康檢測包括種子是否攜帶病原體(如真菌、細(xì)菌及病毒等)和有害動(dòng)物(包括線蟲和昆蟲),也包括微量元素缺乏癥等生理狀況的檢測。其方法包括直接檢驗(yàn)法、吸脹種子檢驗(yàn)、洗滌物檢驗(yàn)、剖粒檢驗(yàn)、染色檢驗(yàn)、比重檢驗(yàn)、軟X射線檢驗(yàn)、胚檢驗(yàn)、吸水紙法檢驗(yàn)、瓊脂皿法檢驗(yàn)、砂床、人工堆肥及類似的培養(yǎng)基法檢驗(yàn)、生長植株的檢驗(yàn)[48]。由此來看,雖然每種方法都具有針對性,但仍然需要破壞種子。多光譜成像技術(shù)雖然在前期模型建立的過程中會(huì)對種子造成損傷,然而模型一旦建立,就能夠做到準(zhǔn)確、無損地檢測,并且針對不同的種子健康狀況,可以建立有針對性的模型,避免了傳統(tǒng)方法的繁瑣步驟。
在菠菜(SpinaciaoleraceaL.)種子中,多光譜成像技術(shù)已被用于真菌感染與否及感染類型的區(qū)分,包括葉枯病菌、枝孢菌、鐮刀菌、黃萎病菌和煙草赤星病菌,分類正確率為80%~100%[49]。黑燕麥(AvenasativaL.)種子的孺孢菌也能夠通過多光譜成像技術(shù)進(jìn)行檢測,對接種24 h、72 h、120 h后種子顏色和紋理特征的預(yù)測精確度為86%,預(yù)測正確率分別為78%、83%和100%,試驗(yàn)證明,多光譜成像技術(shù)對于檢測黑燕麥孺孢菌特別是接種120 h的種子十分精準(zhǔn),并且獨(dú)立檢驗(yàn)中的正確率達(dá)86%[50]。Weng等[51]試圖利用多光譜成像技術(shù)對患有稻曲病的水稻種子進(jìn)行檢測,分別對2個(gè)易感品種進(jìn)行接種,結(jié)果表明,460、520、660、740、850、940 nm的光譜特征與水稻稻曲病能夠很好的建立聯(lián)系,采用最小二乘支持向量機(jī)法進(jìn)行鑒定,總準(zhǔn)確率分別為98.7%,91.4%,假陰性率分別為3.2%和6.7%。同樣,豇豆(VignaunguiculataL.)種子感染了3種不同類型的真菌后,利用多光譜成像技術(shù)結(jié)合線性判別模型的方法對其進(jìn)行鑒別,健康種子和接種之后的種子正確率分別在92%和99%以上,證明多光譜成像技術(shù)在豇豆種子健康狀況鑒定中十分有效[52]。在白三葉(TrifoliumrepensL.)種子的生產(chǎn)過程中,其副產(chǎn)品中夾雜有活的擬寄生物幼蟲,Shrestha等[53]利用多光譜成像技術(shù)對苜蓿葉象甲姬蜂幼蟲繭進(jìn)行識(shí)別,而且獲得了不錯(cuò)的結(jié)果。用典型判別分析模型對活的和死的蟲繭進(jìn)行識(shí)別,訓(xùn)練集的準(zhǔn)確率分別為91%和80%(錯(cuò)誤率為14%),測試集的預(yù)測準(zhǔn)確率為89%和81%(錯(cuò)誤率為15%)。此外,多光譜成像技術(shù)同樣適用于對向日葵(HelianthusannuusL.)種子蟲害、發(fā)霉、異色和酸敗的無損鑒別,該技術(shù)結(jié)合主成分分析-聚類分析(PCA-CA)可以對不同酸敗程度的完整向日葵種子進(jìn)行精確聚類;利用Wilks’lambda逐步法從原始的19個(gè)波長中選取10個(gè)特征波長后,再利用Fisher’s線性判別函數(shù)對完好無損的向日葵種子進(jìn)行分類,其準(zhǔn)確率為97%以上[54]。同樣,Boelt等[55]也介紹了多光譜成像技術(shù)在種子真菌檢測和鑒定中的應(yīng)用實(shí)例。
種子生活力及活力高低直接關(guān)乎種子能否存活,加強(qiáng)其測定的準(zhǔn)確性和實(shí)效性對種子檢驗(yàn)工作來說很有必要。傳統(tǒng)的檢測方法有種子萌發(fā)測定、電導(dǎo)率測定、四氮唑法及計(jì)算機(jī)技術(shù)測定(高光譜、近紅外光譜和氧傳感技術(shù))[56]。除計(jì)算機(jī)技術(shù)測定外,其他的方法均會(huì)對種子造成損傷,而且耗費(fèi)時(shí)間,準(zhǔn)確性欠佳。多光譜成像技術(shù)較高光譜和近紅外光譜技術(shù)來說,光譜波段范圍較少,圖像采集更快。所以,多光譜成像技術(shù)對種子生活力及活力測定來說,具有快速、省時(shí)、無損的優(yōu)點(diǎn)。
多光譜成像技術(shù)已經(jīng)較成熟的運(yùn)用于蓖麻(RicinuscommunisL.)種子生活力的預(yù)測。具體來看,Olesen等[57]對蓖麻活種子和死種子進(jìn)行區(qū)分,之后建立了基于活種子和死種子間歸一化標(biāo)準(zhǔn)判別分析轉(zhuǎn)化的監(jiān)督分類模型,并在一組新種子上進(jìn)行了檢驗(yàn),結(jié)果表明,蓖麻種子種皮的反射數(shù)據(jù)可用于預(yù)測種子生活力?;罘N子和死種子分類的準(zhǔn)確率達(dá)92%,對發(fā)芽能力進(jìn)行預(yù)測后,應(yīng)用四氮唑(TTC)法進(jìn)行驗(yàn)證,分類正確率為96%,該試驗(yàn)驗(yàn)證了多光譜成像技術(shù)在種子質(zhì)量檢測中的應(yīng)用潛力。此外,Baek等[58]在利用多光譜成像技術(shù)結(jié)合最小二乘判別分析的方法對大豆種子生活力進(jìn)行預(yù)測后,提出多光譜近紅外成像方法是一種有效、準(zhǔn)確的無損檢測大豆種子生活力的方法。在利用線性判別分析模型對豇豆種子的老化情況、活力高低進(jìn)行分類后,發(fā)現(xiàn)多光譜成像技術(shù)結(jié)合線性判別分析能夠較好的區(qū)分老化和未老化豇豆種子。高、中活力豇豆種子及死種子,其訓(xùn)練、交叉驗(yàn)證和獨(dú)立驗(yàn)證數(shù)據(jù)集的整體正確分類率分別為97.51%、96.76%和97%[59]。叢曉翔[60]將多光譜成像技術(shù)結(jié)合種苗評價(jià)的方法應(yīng)用于不同品種的多年生黑麥草(LoliumperenneL.)種子活力預(yù)測中,試驗(yàn)結(jié)果顯示,多年生黑麥草的歸一化標(biāo)準(zhǔn)判別分析轉(zhuǎn)換圖中的紅藍(lán)比例能夠以較高的準(zhǔn)確性預(yù)測出高、中、低活力的種子;平均光譜反射率圖能夠區(qū)分開不同活力的種子以及較弱活力的死種子、新鮮未發(fā)芽種子和發(fā)育成不正常種苗的種子;像素分布直方圖的雙峰性能夠鑒別出死種子。
多光譜成像技術(shù)應(yīng)用于種子質(zhì)檢工作中,基本取得了不錯(cuò)的結(jié)果,同時(shí)大大減少了傳統(tǒng)的人工質(zhì)檢方法的繁瑣步驟,也避免了種子樣品的損耗,并且通過模型的建立,能夠大大節(jié)省種子質(zhì)檢的時(shí)間。因此,多光譜成像技術(shù)在種子質(zhì)檢工作中具有廣闊的應(yīng)用前景。但值得注意的是,模型的建立需要大量的種子樣品來進(jìn)行反復(fù)測試和驗(yàn)證其可行性。同時(shí),用于建模的化學(xué)計(jì)量學(xué)方法也有多種,若要將多光譜成像技術(shù)推廣到實(shí)際種子質(zhì)檢工作中,需要將多種模型的建模效果進(jìn)行反復(fù)、詳細(xì)的比對,才能夠選出最佳方案進(jìn)行應(yīng)用。
除了關(guān)注種子質(zhì)量問題外,還會(huì)關(guān)注其內(nèi)部含有的營養(yǎng)成分及含量,也就是貯藏物質(zhì)的組分和含量。多光譜成像技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用于完整番茄中的番茄紅素和酚類化合物含量的測定,而且取得了較好結(jié)果[5]。同樣,種子中的貯藏物質(zhì)含量也會(huì)隨著種子生長發(fā)育及萌發(fā)進(jìn)行而發(fā)生相應(yīng)的變化。但目前多光譜成像技術(shù)尚未應(yīng)用于種子貯藏物質(zhì)含量的測定。除正常種子外,多光譜成像技術(shù)也同樣適用于劣變處理后的種子,種子在發(fā)生劣變后,其內(nèi)部發(fā)生的一系列生理生化變化,可能會(huì)使平均光譜反射率發(fā)生變化,并且可能會(huì)存在一個(gè)特定的波段范圍,能夠表征種子劣變的發(fā)生。綜上所述,多光譜成像技術(shù)對于種子質(zhì)檢工作無疑是一項(xiàng)高效、便捷、精準(zhǔn)的檢測技術(shù),并且對于種子貯藏物質(zhì)含量測定的可行性也值得探索。