大同黃花菜莖段組織培養(yǎng)研究

韓志平， 王麗君， 張海霞， 張 琨

(1.山西大同大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/設(shè)施農(nóng)業(yè)技術(shù)研發(fā)中心， 山西 大同 037009；2.大同黃花產(chǎn)業(yè)發(fā)展研究院， 山西 大同 037004； 3.山西大同大學(xué)后勤管理處， 山西 大同 037009)

黃花菜(HemerocalliscitrinaBaroni)為百合科萱草屬多年生草本植物，對(duì)環(huán)境條件的適應(yīng)性很強(qiáng)，在我國(guó)南北都有栽培[1]。黃花菜是我國(guó)特有的蔬菜，其花蕾含有豐富的蛋白質(zhì)、糖類(lèi)、維生素、氨基酸和鈣、磷、鐵等礦物質(zhì)[2]，還富含卵磷脂、甾類(lèi)、硒等物質(zhì)[3]，加上花型優(yōu)美、色澤鮮艷，根系發(fā)達(dá)，具有食用、藥用、綠化觀賞、水土保持等多種用途[4-5]。

大同市云州區(qū)是我國(guó)第二大黃花菜主產(chǎn)區(qū)，位于北緯39°45′～40°13′，屬最適宜作物生長(zhǎng)的黃金緯度帶范圍[6-7]。由于當(dāng)?shù)毓庹粘渥?、晝夜溫差大，加上大同火山群下土壤肥沃疏松[8]，這里的黃花菜色澤金黃、角大肉厚、營(yíng)養(yǎng)豐富、香味濃郁，外觀品質(zhì)和食用品質(zhì)均為全國(guó)最優(yōu)，還是大同市首個(gè)國(guó)家地理標(biāo)志保護(hù)產(chǎn)品、全國(guó)百?gòu)?qiáng)農(nóng)產(chǎn)品區(qū)域公用品牌產(chǎn)品[9]。目前，大同黃花菜種植規(guī)模已達(dá)1.73萬(wàn)hm2，僅云州區(qū)就有1.13萬(wàn)hm2，已經(jīng)成為云州區(qū)“一區(qū)一業(yè)”的主導(dǎo)產(chǎn)業(yè)和脫貧攻堅(jiān)的支柱產(chǎn)業(yè)。但是，目前采用的分株、切片、芽塊等黃花菜種苗繁殖方法，受母株生長(zhǎng)年限、自然生長(zhǎng)環(huán)境和氣候條件的限制很大，存在種苗成本高、純度難以保證、繁殖系數(shù)低、周期長(zhǎng)、繁殖時(shí)間受限、易帶病蟲(chóng)草害等問(wèn)題[10-11]，難以滿足種苗批量生產(chǎn)的需求。植物組織培養(yǎng)技術(shù)具有繁殖系數(shù)高、繁殖周期短、利于保持品種的優(yōu)良性狀、無(wú)病蟲(chóng)草害等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于蔬菜、果樹(shù)、花卉、園林植物等的快速繁殖[12]。20世紀(jì)80年代起，一些學(xué)者采用黃花菜的根、根狀莖、葉、花等不同部位進(jìn)行了黃花菜的組織培養(yǎng)研究[13-16]，但至今黃花菜的組織培養(yǎng)技術(shù)仍不成熟，組織培養(yǎng)體系尚未建立，難以在生產(chǎn)上大規(guī)模應(yīng)用。為此，本試驗(yàn)以大同黃花菜種子為材料，培養(yǎng)獲得無(wú)菌苗后，以其根、莖、葉為外植體，初步研究了大同黃花菜組織培養(yǎng)的再生系統(tǒng)，為大同黃花菜組織培養(yǎng)體系的建立及其在生產(chǎn)中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)在山西大同大學(xué)生命科學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心的植物學(xué)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。材料為采集自生命科學(xué)試驗(yàn)基地的大同黃花菜種子。供試激素包括生長(zhǎng)素類(lèi)的2,4-D和NAA、細(xì)胞分裂素類(lèi)的6-BA。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1種子滅菌和萌發(fā)預(yù)試驗(yàn)

為確定種子滅菌和萌發(fā)的適宜方法，設(shè)置4個(gè)處理：

1) 種子在水分充足的發(fā)芽盒中自然萌發(fā)；

2) 種子用無(wú)菌水浸泡12 h，吸干表面水分后直接接種于MS培養(yǎng)基上；

3) 種子用無(wú)菌水浸泡12 h，再用75%乙醇浸泡30 s，用無(wú)菌水沖洗3～4次，然后用0.1%升汞浸泡10 min，再用無(wú)菌水沖洗3～4次，用無(wú)菌濾紙吸干表面水分，接種于MS培養(yǎng)基上；

4) 種子用無(wú)菌水浸泡12 h，用無(wú)菌濾紙吸干表面水分后剝?nèi)シN皮，按處理 3) 方法滅菌后接種于MS培養(yǎng)基上，培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)發(fā)霉的種子再次滅菌后重新接種。

1.2.2無(wú)菌苗培養(yǎng)與外植體的獲取和培養(yǎng)

選取飽滿、整齊的種子，按預(yù)試驗(yàn)處理4)方法浸種、去皮、滅菌、接種。種子萌發(fā)后待幼苗第1片葉長(zhǎng)3～5 cm時(shí)，用無(wú)菌刀片將根、莖、葉分別切為長(zhǎng)1 cm左右的節(jié)段，接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。培養(yǎng)1周后將形成不定芽的材料轉(zhuǎn)移到繼代培養(yǎng)基上，每隔1周轉(zhuǎn)瓶繼代1次。當(dāng)?shù)?片葉長(zhǎng)達(dá)1 cm時(shí)，轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基上。

種子去皮、滅菌及各階段材料的接種均在超凈工作臺(tái)上進(jìn)行，每個(gè)階段每瓶接種4～5個(gè)材料，每次接種后立即置于人工氣候培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為溫度(25±2)℃、光照強(qiáng)度2 000～2 500 lx、光照時(shí)間12 h·d-1[17]。定期用75%酒精擦拭氣候箱消毒，同時(shí)觀察和記錄種子萌發(fā)、無(wú)菌苗生長(zhǎng)、芽分化、葉抽生、根誘導(dǎo)等生長(zhǎng)情況。

1.3 培養(yǎng)基和激素成分

根、莖、葉3種外植體在誘導(dǎo)培養(yǎng)階段均設(shè)置4種基本培養(yǎng)基單獨(dú)處理：①M(fèi)S；②1/2 MS；③N 6；④1/2N 6，但同種外植體的4種基本培養(yǎng)基上添加的激素種類(lèi)和用量均相同(表1)。繼代培養(yǎng)階段3種外植體均采用MS培養(yǎng)基，但培養(yǎng)基上添加的激素種類(lèi)和用量各不相同。

表1 不同外植體各培養(yǎng)階段所用培養(yǎng)基和激素成分

2 結(jié)果與分析

2.1 種子滅菌和萌發(fā)預(yù)試驗(yàn)

黃花菜種子堅(jiān)硬，吸水和萌發(fā)困難。為使種子順利萌發(fā)并獲得能夠切取根、莖、葉等外植體的健壯無(wú)菌苗，用4種方法對(duì)種子進(jìn)行處理。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，1) 發(fā)芽盒自然萌發(fā)的種子培養(yǎng)2周后大部分種子仍未萌發(fā)，少數(shù)萌發(fā)的幼苗長(zhǎng)勢(shì)較弱、葉片細(xì)長(zhǎng)。 2) 無(wú)菌水浸泡后直接接種于MS培養(yǎng)基上的種子，全部被黑色霉菌污染。 3) 無(wú)菌水浸泡后再用乙醇和升汞滅菌后接種于MS培養(yǎng)基上的種子，也全部被黑色霉菌污染。 4) 無(wú)菌水浸泡后去皮，再用乙醇和升汞滅菌，然后接種到MS培養(yǎng)基上的種子，污染率降低到37.5%；污染的種子再次滅菌后接種，污染率降低到0，種子萌發(fā)率達(dá)100%。因此，后續(xù)試驗(yàn)采用4) 處理方法進(jìn)行無(wú)菌苗的培養(yǎng)。

2.2 種子萌發(fā)與無(wú)菌苗的形成

種子經(jīng)浸種、去皮、滅菌后接種于MS培養(yǎng)基上，約5 d后開(kāi)始萌發(fā)，萌發(fā)率100%。再經(jīng)約3 d開(kāi)始形成葉片，同時(shí)根系不斷伸長(zhǎng)。培養(yǎng)約2周后，無(wú)菌苗第1片葉長(zhǎng)3～5 cm、根3～5條，即可取其根、莖、葉3部分，分別切成約1 cm長(zhǎng)的節(jié)段備用(圖1)。

注：A為接種；B為萌發(fā)；C為無(wú)菌苗。

2.3 外植體誘導(dǎo)培養(yǎng)

2.3.1不同外植體切段誘導(dǎo)結(jié)果

無(wú)菌苗的根、莖、葉切段分別接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，莖段培養(yǎng)1 d后開(kāi)始形成不定芽，4 d后有不定芽形成葉片；培養(yǎng)8 d后，多數(shù)莖段誘導(dǎo)產(chǎn)生了不定芽，并有部分抽生葉片，將形成不定芽的莖段轉(zhuǎn)移到繼代培養(yǎng)基上。根和葉的切段在誘導(dǎo)培養(yǎng)過(guò)程中沒(méi)有任何形態(tài)變化，既沒(méi)有產(chǎn)生愈傷組織，也沒(méi)有形成不定芽(圖2)。結(jié)果說(shuō)明，莖段比根、葉的切段更容易被誘導(dǎo)，且不經(jīng)過(guò)愈傷組織階段，直接誘導(dǎo)形成不定芽。

注：A為莖段接種；B為莖段突出；C為莖段出芽并抽葉；D為葉段接種；E為根段接種。

2.3.2不同培養(yǎng)基上莖段的誘導(dǎo)培養(yǎng)結(jié)果

莖段在4種誘導(dǎo)培養(yǎng)基上分別培養(yǎng)8 d后，均誘導(dǎo)形成了不定芽，并有部分抽生第1片葉，沒(méi)有形成愈傷組織(表2和圖3)。其中MS培養(yǎng)基誘導(dǎo)率最高，1/2 MS和N 6培養(yǎng)基誘導(dǎo)率次之，1/2 N 6培養(yǎng)基誘導(dǎo)率最低；從不定芽的形態(tài)和長(zhǎng)勢(shì)看，MS和1/2 MS培養(yǎng)基上形成的不定芽均較壯，N 6和1/2 N 6培養(yǎng)基上形成的不定芽長(zhǎng)勢(shì)一般，但4種培養(yǎng)基上形成的不定芽均無(wú)畸形。綜合比較，莖段在MS培養(yǎng)基上誘導(dǎo)形成不定芽的幾率最高且長(zhǎng)勢(shì)良好，是莖段誘導(dǎo)培養(yǎng)的最適培養(yǎng)基，1/2 N 6培養(yǎng)基誘導(dǎo)效果最差，不宜用于莖段的誘導(dǎo)培養(yǎng)。

表2 不同培養(yǎng)基上莖段的誘導(dǎo)培養(yǎng)結(jié)果

注：A為MS培養(yǎng)基；B為1/2 MS培養(yǎng)基；C為N 6培養(yǎng)基；D為1/2 N 6培養(yǎng)基。

2.4 繼代培養(yǎng)

在繼代培養(yǎng)過(guò)程中，已經(jīng)抽葉的莖段材料葉片進(jìn)一步生長(zhǎng)，其他具有不定芽的材料也陸續(xù)抽生葉片，抽葉率100%，而后開(kāi)始抽生第2片葉(圖4)。部分已經(jīng)抽葉的材料在培養(yǎng)過(guò)程中被污染，培養(yǎng)基表面著生黃色霉菌，材料軟化腐爛。經(jīng)過(guò)2次繼代，最終形成葉片的莖段材料存活率為86.96%。繼代培養(yǎng)2周，當(dāng)?shù)?片葉長(zhǎng)1 cm時(shí)，將存活的莖段材料接種于生根培養(yǎng)基上誘導(dǎo)生根。根和葉的切段在繼代培養(yǎng)基上仍沒(méi)有任何形態(tài)變化，繼代培養(yǎng)2次后丟棄。

注：A為第一次繼代；B為第二次繼代；C為誘導(dǎo)生根；D為完整組培苗。

2.5 誘導(dǎo)生根

具有葉片的無(wú)根苗在生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)約2周后開(kāi)始形成乳白色的幼根，再培養(yǎng)2周后生根率達(dá)45%，但根系較細(xì)，長(zhǎng)勢(shì)較弱。培養(yǎng)過(guò)程中，莖段材料繼續(xù)抽生新葉，葉片不斷伸長(zhǎng)增寬。培養(yǎng)約1個(gè)月形成完整的試管苗，此時(shí)多數(shù)幼苗僅發(fā)生主根，根長(zhǎng)約1 cm，葉子2～3片，最大葉長(zhǎng)約3 cm，少數(shù)幼苗具有3條根，第1片葉長(zhǎng)約5 cm。

3 討論與結(jié)論

3.1 培養(yǎng)過(guò)程和結(jié)果

黃花菜種子浸泡、去皮、滅菌后接種于MS培養(yǎng)基上，5 d后開(kāi)始萌發(fā)，再經(jīng)8 d形成完整的無(wú)菌苗。取無(wú)菌苗的根、莖、葉3部分，分別切為1 cm長(zhǎng)的切段后接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上；其中莖段材料8 d后產(chǎn)生不定芽，并抽生葉片，而后轉(zhuǎn)移到繼代培養(yǎng)基上；培養(yǎng)2周后，第1片葉伸長(zhǎng)至1 cm時(shí)，轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基上；培養(yǎng)約2周后開(kāi)始生根，再經(jīng)2周45%的莖段材料形成完整的組培苗。根和葉的切段材料在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上沒(méi)有形成愈傷組織或不定芽，繼代培養(yǎng)也無(wú)任何形態(tài)變化。

3.2 存在的主要問(wèn)題

3.2.1污染問(wèn)題

種子萌發(fā)階段出現(xiàn)了萌發(fā)率低、容易發(fā)霉的問(wèn)題。預(yù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，種子萌發(fā)率低的原因可能是種皮堅(jiān)硬，難以萌發(fā)；發(fā)霉的原因是種皮表面凹凸不平，帶有雜菌，滅菌消毒不徹底。去除種皮、并對(duì)種子進(jìn)行二次滅菌后種子全部萌發(fā)，也沒(méi)有發(fā)生霉變。繼代過(guò)程中也出現(xiàn)了部分材料被污染的問(wèn)題，可能是接種時(shí)器具或材料滅菌不徹底造成的[18]。應(yīng)特別加強(qiáng)材料和接種器具的滅菌消毒，并及時(shí)清理被污染的材料。

3.2.2玻璃化現(xiàn)象

生根培養(yǎng)階段有部分材料出現(xiàn)了玻璃化現(xiàn)象，葉片呈透明或半透明狀態(tài)。原因可能是：1) 繼代后期到生根階段人工氣候培養(yǎng)箱溫度和濕度過(guò)高，光照較弱[19]； 2) 培養(yǎng)基中無(wú)機(jī)鹽離子用量、激素種類(lèi)和配比不利于材料的生長(zhǎng)和光合作用[20]。將玻璃化材料移出氣候箱，在自然光照射下逐漸回綠，但1周后葉片仍然萎蔫，地上部死亡。因此，需要進(jìn)一步研究黃花菜組培苗玻璃化的原因和解決方法。

3.2.3弱根系問(wèn)題

試驗(yàn)中組培苗的生根率較低，發(fā)生的根系較細(xì)，根數(shù)也少，多數(shù)僅有主根，長(zhǎng)勢(shì)較弱?？赡苁且?yàn)榕囵B(yǎng)基中NAA濃度不適宜材料生根[16]，也可能是繼代培養(yǎng)后期葉片形成狀況一般抑制了根的發(fā)生[21]。今后需從培養(yǎng)基及其添加的激素種類(lèi)和濃度著手，探明根系發(fā)生少、生長(zhǎng)弱的原因，進(jìn)而解決該問(wèn)題。

3.3 研究結(jié)論

本研究以大同黃花菜種子萌發(fā)形成無(wú)菌苗，再以其根、莖、葉的切段為外植體接種培養(yǎng)，結(jié)果只有莖段材料誘導(dǎo)形成了不定芽，進(jìn)一步繼代抽葉和誘導(dǎo)生根形成了完整的試管苗。說(shuō)明黃花菜無(wú)菌苗的莖段可以再生為完整的組培苗，其培養(yǎng)途徑為：去皮種子→無(wú)菌苗→莖段→不定芽→抽葉→生根→試管苗。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，去皮的種子滅菌和萌發(fā)培養(yǎng)效果最好，MS培養(yǎng)基誘導(dǎo)不定芽的發(fā)生率最高。

試驗(yàn)中無(wú)菌苗的根段和葉段材料在4種培養(yǎng)基上單獨(dú)誘導(dǎo)培養(yǎng)均沒(méi)有任何形態(tài)變化，但植物細(xì)胞具有全能性，根和葉也具有培養(yǎng)成為完整植株的潛能[22]。今后可通過(guò)調(diào)整培養(yǎng)基激素種類(lèi)和濃度及溫、光、濕等條件，研究無(wú)菌苗的根、葉培養(yǎng)形成組培苗的方法和途徑。此外，本研究?jī)H對(duì)莖段誘導(dǎo)階段所用培養(yǎng)基進(jìn)行了篩選，繼代和生根培養(yǎng)中適宜的培養(yǎng)基和激素配比對(duì)葉片形成、根系發(fā)生都具有重要影響，下一步需要針對(duì)該問(wèn)題進(jìn)行研究。

黃花菜的適應(yīng)性很強(qiáng)，耐寒、耐旱、耐貧瘠，病蟲(chóng)害發(fā)生少，但生產(chǎn)中仍存在一些亟待改進(jìn)的性狀，如干旱時(shí)容易落蕾，對(duì)病毒和某些除草劑的抗性不強(qiáng)等[22]。利用組織培養(yǎng)技術(shù)可以提高花蕾品質(zhì)和產(chǎn)量[23]。前人以黃花菜的根狀莖、花器官等作為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)獲得成功[24-26]，但是這些材料的取材和培養(yǎng)效果受到生長(zhǎng)季節(jié)、材料的發(fā)育程度和生理狀況等的影響，很難用于工廠化生產(chǎn)。利用種子萌發(fā)形成的無(wú)菌苗進(jìn)行組織培養(yǎng)，不受時(shí)間限制，材料充足，能夠培養(yǎng)形成完整植株，是一種簡(jiǎn)便易行的黃花菜植株再生方法，可進(jìn)一步研究并建立其組織培養(yǎng)體系，為黃花菜的快速繁殖和工廠化育苗奠定基礎(chǔ)。