不同時間點兩性霉素B聯(lián)合氟康唑抗真菌效果研究

朱乘光， 葉星辰， 任彪， 周學(xué)東， 程磊

1.口腔疾病研究國家重點實驗室 國家口腔疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心 四川大學(xué)華西口腔醫(yī)院牙體牙髓病科，四川成都（610041）； 2.口腔疾病研究國家重點實驗室 國家口腔疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，四川 成都（610041）

近年來，隨著抗生素的廣泛使用、免疫缺陷疾病的發(fā)病率增高，我國侵襲性念珠菌病發(fā)病率呈現(xiàn)增高趨勢［1］。白色念珠菌（Candida albicans，C.albicans）是人類主要的致病性真菌之一，可導(dǎo)致念珠菌血癥及侵襲性念珠菌感染等諸多真菌感染性疾病，是臨床上病死率最高的致病真菌，在免疫功能低下的人群中更為嚴(yán)重［2-3］。在抗真菌治療應(yīng)用中，多烯類藥物，如兩性霉素B（amphotericin B，AmB）和氮唑類藥物，如氟康唑（fluconazole，F(xiàn)LC）是目前最為常用的抗真菌藥［4］。臨床上常將AmB與氮唑類藥物聯(lián)合應(yīng)用以達(dá)到更好的治療效果，減少副作用發(fā)生［5-7］，但兩者聯(lián)用的作用機制仍存在較多爭議［8-10］。本實驗將探討AmB 與FLC 在體外的時間依賴性相互作用，為揭示兩者不同條件下的相互作用關(guān)系提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗菌株、培養(yǎng)條件及藥物準(zhǔn)備

白色念珠菌標(biāo)準(zhǔn)株SC5314 購自美國標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心（保藏號：ATCC MYA-2876，American Type Culture Collection）。使用平板畫線法于酵母膏胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（yeast extract peptone dextrose medium，YPD）活化菌株，配方：酵母提取物1%，蛋白胨2%，葡萄糖2%，瓊脂2%，于35 ℃，5%CO2的條件下過夜孵育。于上述培養(yǎng)條件下的白色念珠菌，在RPMI 1640 培養(yǎng)基中制備菌懸液，菌液終濃度為（0.5 ～2.5）× 104CFU/mL。將AmB 和FLC 分別溶于二甲基亞砜（DMSO）中以制備藥物儲備液，濃度分別為10 mg/mL 與2 mg/mL，冷藏待用。

1.2 兩倍稀釋法測定最小抑菌濃度（minimal inhibitory concentration，MIC）

根據(jù)美國臨床與實驗室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會（CLSI）文件M27，在96 孔板中，使用微量肉湯兩倍稀釋法在RPMI 1640 培養(yǎng)基中進行抗真菌活性試驗。于上述培養(yǎng)條件下的白色念珠菌，在RPMI 1640 培養(yǎng)基中制備菌懸液，菌液終濃度為（0.5～2.5）× 104CFU/mL。在96 孔板中依次加入80 μL 菌懸液與1μL 兩倍連續(xù)稀釋后的藥物（AmB 或FLC）或溶媒對照DMSO，使藥物在96 孔板各孔終濃度分別為2、1、0.5、0.25、0.12、0.06、0.03、0 μg/mL。使用空白RPMI 1640 培養(yǎng)基作陰性對照，將孔板置于35 ℃孵育24 h。將各孔菌液吹打均勻，多功能酶標(biāo)儀檢測OD 600 nm 條件下濁度值，MIC 是在實驗條件下觀察不到真菌生長的最低濃度。所有實驗重復(fù)3 次。

1.3 平板復(fù)蘇實驗及不同時間點藥物相互作用觀察

1.3.1 DMSO 對AmB、FLC 作用效果影響 為排除溶媒對照（DMSO）及基礎(chǔ)DMSO 環(huán)境對AmB、FLC的作用效果影響，取3 塊無菌96 孔板，分別加入80 μL 菌懸液及1 μL DMSO，此后在不同的時間點（0、2、4、6 h），分別加入：①1 μL AmB，使AmB 終濃度分別為0.25、0.125 μg/mL；②1 μL FLC，使FLC 終濃度分別為0.06、0.03 μg/mL；③1 μL DMSO。

1.3.2 低濃度AmB 對FLC 的作用效果影響 向96孔板中依次加入80 μL 菌懸液與1 μL FLC，使FLC終濃度為2、1、0.50、0.25、0.12、0.06、0.03、0.016、0.008、0.004 μg/mL［3］，此后在不同的時間點（0、2、4、6 h）加 入1 μL AmB，使AmB 終 濃 度 為0.25、0.125 μg/mL。同時，另設(shè)陰性對照組加入1 μL DMSO。

1.3.3 低濃度FLC 對AmB 的作用效果影響 向96孔板中依次加入80 μL 菌懸液與1 μL AmB，使AmB 終 濃 度 為2、1、0.50、0.25、0.12、0.06、0.03、0.016 μg/mL，此后在不同的時間點（0、2、4、6 h）分別加入1 μL FLC，使FLC終濃度為0.06、0.03 μg/mL。同時，另設(shè)陰性對照組加入1 μL DMSO。

將以上96 孔板于35 ℃孵育，過夜培養(yǎng)。將96孔板各孔菌液吹打混勻，從每孔菌懸液中抽取2 μL，滴加于新鮮的YPD 平板上以復(fù)蘇菌液。復(fù)蘇平板于35 ℃孵育，過夜培養(yǎng)，通過比較不同時間點及不同濃度AmB 與FLC 處理組菌懸液是否可在YPD 平板上復(fù)蘇，及處理組復(fù)蘇菌落較陰性對照組復(fù)蘇菌落的大小來初步判斷藥物之間相互作用。

1.4 菌落計數(shù)實驗

于上述培養(yǎng)條件下的白色念珠菌，在RPMI 1640 培養(yǎng)基中制備菌懸液，菌液終濃度約為（0.5～2.5）× 104CFU/mL。本實驗分為以下兩組，分別觀察AmB 及FLC 相互作用對抗真菌效果的影響。

1.4.1 低濃度AmB 對FLC 抗真菌效果的影響 向96 孔板中依次加入80 μL 菌懸液與1 μL FLC，使各孔FLC 均達(dá)到抑菌濃度（0.25 μg/mL），分別在在不同的時間點（0、2、4、6 h）各孔加入1 μL AmB，使各孔AmB 終濃度為0.125、0.25 μg/mL，加入等體積DMSO 設(shè)置為單藥對照。

1.4.2 低濃度FLC 對AmB 抗真菌效果的影響 向96 孔板中依次加入80 μL 菌懸液與1 μL AmB，使各孔AmB 均達(dá)到抑菌濃度（1 μg/mL），分別在不同的時間點（0、2、4、6 h）各孔加入1 μL FLC，使各孔FLC 終濃度為0.03、0.06 μg/mL，加入等體積DMSO設(shè)置為單藥對照。

將以上孔板孵育于35 ℃孵育，過夜培養(yǎng)。將96 孔板各孔菌液吹打混勻，從每孔菌懸液中抽取20 μL，滴加于新鮮的YPD 平板上使用無菌推棒涂勻。于35℃孵育，過夜培養(yǎng)，于次日進行菌落計數(shù)，計算菌落形成單位（colony-forming units，CFU），使用在后續(xù)時間點（0、2、4、6 h）未滴加藥物的菌液CFU 均數(shù)作標(biāo)準(zhǔn)化，分別計算各孔CFU 的差異倍數(shù)［5］，各時間點的CFU 差異倍數(shù)計算公式如下：Fold Changes by CFU ＝CFU藥物處理組/CFU陰性對照組均數(shù)。每組實驗進行3 次平行重復(fù)。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 19.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進行相關(guān)數(shù)據(jù)結(jié)果分析，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用單因素方差分析處理所得結(jié)果，P＜0.05 認(rèn)為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 AmB、FLC 對白色念珠菌的藥敏結(jié)果

結(jié)果顯示，隨著藥物濃度升高，處理后白色念珠菌濁度逐漸降低，提示白色念珠菌真菌濃度逐漸降低，藥物的抑菌能力逐漸提高，AmB 對白色念珠菌的MIC 為1 μg/mL、FLC 的MIC 為0.25 μg/mL。見圖1。

2.2 DMSO 與低濃度AmB 或FLC 無相互作用

結(jié)果顯示，使用溶媒DMSO 處理后，在不同時間點加入DMSO、低濃度AmB（0.25 或0.125 μg/mL）或FLC（0.06、0.03 μg/mL），白色念珠菌的生長并不受影響（圖2a）。FLC 是一種抑菌藥物，真菌在高濃度藥物處理后依舊可以復(fù)蘇，而AmB 為殺菌藥物，只有少量真菌能夠在1 μg/mL 藥物處理后存活，當(dāng)AmB 濃度達(dá)2 μg/mL，能夠完全抑制真菌生長（圖2b）。以上溶媒陰性對照組及單藥對照組結(jié)果說明DMSO 不會影響白色念珠菌生長，同時不會影響兩種藥物對白色念珠菌的作用。

2.3 不同時間點低濃度AmB 對FLC 抑制白色念珠菌效果無影響

Figure 1 Antifungal activities of AmB and FLC圖1 AmB 與FLC 對白色念珠菌的抑菌效果

Figure 2 Interactions between DMSO and low concentrations of AmB or FLC圖2 DMSO 與低濃度AmB 或FLC 無相互作用

本結(jié)果中，在不同時間點加入低濃度AmB（0.25、0.125 μg/mL）均 未 改 變 不 同 濃 度FLC（0.004～0.5 μg/mL）的抑制真菌能力，未能表現(xiàn)出明顯的相互作用。進一步通過菌落計數(shù)進行定量檢測分析加入AmB 的不同時間點對FLC 抗真菌性的影響，發(fā)現(xiàn)在加入FLC 后的不同時間點（0、2、4、6 h）加入低濃度AmB 均未顯著改變FLC 的抑菌作用（P＞0.05）。分析AmB 低濃度處理后不同時間點對FLC 抗真菌性能的影響，觀察不同時間點（0、2、4、6 h）FLC 抑菌效果的改變，結(jié)果顯示FLC 的抑菌作用并未發(fā)生改變（P＞0.05）。見圖3。

2.4 不同時間點低濃度FLC 對AmB 抗菌能力具有不同影響

平板復(fù)蘇結(jié)果顯示，不同時間點加入低濃度FLC（0.06、0.03 μg/mL）對AmB 抗菌能力具有不同影響。使用AmB 處理真菌后立即以及6 h 后加入低濃度FLC（0.06、0.03 μg/mL），真菌的數(shù)量均減少，而在2、4 h 加入低濃度FLC，在AmB 殺菌濃度（1 μg/mL）下，真菌的數(shù)量與單獨使用AmB 時效果相似。見圖4a。

菌落計數(shù)實驗結(jié)果顯示，在0 h 加入低濃度FLC，各組菌落計數(shù)倍數(shù)無統(tǒng)計學(xué)差異（F＝0.27，P＝0.775）；在2 h 加入等量FLC，各組菌落計數(shù)FC值差異顯著（F＝439.71，P＜0.001）；4 h 加入等量FLC 結(jié)果與2 h 一致（FC＝1.74～1.93，F(xiàn)＝141.58，P＜0.001）；在6 h 加入等量FLC，各組菌落計數(shù)無明顯差異（FC＝1.03～1.16，F(xiàn)＝1.55，P＝0.286）。以上結(jié)果證明在2 h 與4 h 低濃度FLC 均可降低AmB 抗真菌性能。見圖4b。

以FLC 濃度（0、0.03、0.06 μg/mL）分組評價其作用效果的時間依賴性。各時間點加入0 μg/mL FLC 對菌落計數(shù)未見顯著差異（FC＝0.84～1.09，F(xiàn)＝1.05，P＝0.422）。2、4 h 加入0.03 μg/mL FLC，菌落計數(shù)與0 h 加入時顯著升高（2 h：FC＝1.77-1.84，F(xiàn)＝1354.38，P＜0.001；4 h：FC＝1.74～1.93，F(xiàn)＝216.10，P＜0.001），而6 h 時與0 h 加入相比無顯著差異（FC＝1.03～1.12，F(xiàn)＝7.12，P＞0.05）。加入0.06 μg/mL FLC 結(jié)果與加入0.03 μg/mL 相似，F(xiàn)LC 對AmB 的抗真菌性能影響表現(xiàn)出明顯的時間依賴性（F＝289.92，P＜0.001）。見圖4c。

Figure 3 Low concentrations of AmB showed no effect on the antifungal activity of FLC at different time points圖3 不同時間點低濃度AmB 對FLC 無相互作用

3 討 論

白色念珠菌是人類最主要、致病率最高的機會性致病真菌，可導(dǎo)致念珠菌血癥等嚴(yán)重疾病，即便予以抗真菌治療，其病死率也高達(dá)40%［11］。白色念珠菌是一種雙相菌，酵母相和菌絲相之間自由轉(zhuǎn)換的能力是其最常被研究的毒力因素之一［12］。Khodavandi 等［13］檢測FLC 與AmB 聯(lián)合應(yīng)用下白色念珠菌生物膜形成情況，通過XTT 實驗及結(jié)晶紫染色發(fā)現(xiàn)二者聯(lián)合應(yīng)用可抑制白色念珠菌酵母相向菌絲相轉(zhuǎn)化，這一現(xiàn)象在Khodavandi 等對熱帶念珠菌的相關(guān)實驗中也得到了證實［8］，同時在Kawai 等通過實時成像技術(shù)對AmB 與熱帶念珠菌的抗菌效果研究中發(fā)現(xiàn)，AmB 可在早期（6 h 以內(nèi)）有效抑制其增殖，而6 h 后給藥僅能抑制生物膜進一步生長而不能殺滅念珠菌［14］，提示AmB 的作用效果具有時間依賴性，與本實驗研究結(jié)果一致。

本實驗結(jié)果證明了AmB 與FLC 的相互作用具時間依賴性。當(dāng)這兩種藥物聯(lián)合使用時存在以下情況，AmB 處理2 h 內(nèi)，低濃度FLC 對AmB 作用無顯著影響，但有降低趨勢；但2 h 到4 h 過程中，低濃度FLC 會顯著降低AmB 殺菌效果；然而，在6 h后，低濃度FLC 對AmB 的抗真菌活性無影響。然而，低濃度AmB 對FLC 的作用效果并沒有影響。這一差異可能是由于兩種藥物作用的時效關(guān)系引起。Mansfield 等［15］通過H3標(biāo)記標(biāo)記FLC 以檢測FLC 的藥物分布與時間之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)FLC 可在3 h 內(nèi)呈線性快速實現(xiàn)廣泛的分布，作用迅速，因此證明FLC 可快速實現(xiàn)對白色念珠菌的麥角甾醇合成的抑制［9］。同樣，Khan 等［16］通過檢測AmB 對白色念珠菌殺菌曲線，發(fā)現(xiàn)其在2～4 h 菌落計數(shù)下降最為明顯，提示在2～4 h 這一時間段系A(chǔ)mB與靶點結(jié)合率達(dá)到穩(wěn)定，是主要發(fā)揮作用的時間段。此外，Oliveira 等［17］通過制作殺菌曲線，發(fā)現(xiàn)AmB 可在6 h 內(nèi)快速實現(xiàn)對部分隱球菌的殺滅，這一作用時間在熱帶念珠菌的研究過程中也得到證實，而6 h 后給藥僅能抑制生物膜形成，卻無法進步一殺滅殘留念珠菌［14］，以上提示AmB 系快速殺菌類抗真菌藥物，其可在6 h 內(nèi)快速發(fā)揮抗真菌效果，而6 h 后可能由于作用靶點麥角甾醇與AmB 的結(jié)合達(dá)到飽和，多數(shù)麥角甾醇已被破壞，因此，靶點的缺失導(dǎo)致AmB 無法繼續(xù)發(fā)揮效果。因此，在不同時間點，加入低劑量FLC 可表現(xiàn)出對AmB 抗真菌效能不同的影響。在臨床抗真菌治療應(yīng)用過程中，若兩種藥物到達(dá)感染部位的時間出現(xiàn)差異，尤其是在2～4 h 這一時間窗口，可能會導(dǎo)致該兩種抗真菌藥物存在拮抗效應(yīng)，導(dǎo)致藥物抗真菌能力降低。

Figure 4 Low concentrations of FLC had different effects on the antifungal activity of AmB at different timepoints圖4 不同時間點低濃度FLC 對AmB 抗真菌能力具不同影響

綜上所述，AmB 與FLC 聯(lián)用具有時間依賴性，早期聯(lián)用無相互作用，在2～4 h 低濃度的FLC 可減弱AmB 的殺菌效果，該相互作用在6 h 后消失。在治療念珠菌感染過程中，需謹(jǐn)慎考慮不同抗真菌藥物作用窗口時間，避免藥物拮抗作用，對進一步促進多烯類與氮唑類藥物相互作用的理解及其各自對真菌的關(guān)鍵作用機制具重要意義。