非核苷類NEDD8活化酶抑制劑的設(shè)計、合成與活性研究

羅 川，喻支梁，張萬年，繆震元（. 安徽華潤金蟾藥業(yè)股份有限公司，安徽 淮北 35000；. 海軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院藥物化學(xué)教研室，上海 00433）

神經(jīng)前體細(xì)胞發(fā)育性表達(dá)下調(diào)8 (neural precursor cell-expressed developmentally downregulated 8，NEDD8)是細(xì)胞中具有重要生物學(xué)功能的類泛素蛋白，能調(diào)節(jié)cullin-ring E3連接酶的活性，控制多種腫瘤細(xì)胞生長相關(guān)蛋白CDT1、cyclin E、p27和NRF2等的轉(zhuǎn)歸。NEDD8活化酶 (NEDD8-activating enzyme，NAE)是NEDD8信號通路的關(guān)鍵酶，能催化NEDD8蛋白與ATP的結(jié)合。抑制NAE的活性，能夠降低泛素-蛋白酶體系統(tǒng)(UPS)通路的活性和相關(guān)蛋白的降解，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[1-3]。MLN4924是首個報道的選擇性小分子NAE抑制劑，目前已進(jìn)入臨床Ⅰ期研究，用于治療黑素瘤、急性髓細(xì)胞性白血病和實體瘤。MLN4924的成功發(fā)現(xiàn)使得基于NEDD8信號通路進(jìn)行抗腫瘤藥物研究成為研究熱點之一，先后報道多個全新骨架的小分子抑制劑，其中包括源于天然產(chǎn)物的磺酰胺化合物2和三環(huán)類化合物3[4-7](圖1)。近年來，NAE突變(A171T)的發(fā)現(xiàn)使得有必要研發(fā)新型的NAE抑制劑[8]。

骨架躍遷策略是藥物設(shè)計領(lǐng)域的常見思路之一，也已獲得很多成功的案例。筆者基于MLN4924的結(jié)構(gòu)，采用骨架躍遷策略將藥物中的優(yōu)勢骨架吲唑環(huán)引入到MLN4924的結(jié)構(gòu)中，設(shè)計出一類非核苷類NAE抑制劑。

1 儀器與試劑

核磁共振儀為Bruker 300或600型，TMS為內(nèi)標(biāo)，CD3OD、DMSO-d6或者CDCl3為溶劑?；瘜W(xué)位移（δ）和偶合常數(shù)（J）分別以ppm和Hz為單位，在API-3000LC-MS型質(zhì)譜儀上完成ESI質(zhì)譜。TLC分析所用硅膠板為GF254（中國青島海洋化學(xué)）；硅膠柱層析采用60G硅膠（中國青島海洋化學(xué)）。商品化溶劑皆為市售分析純或化學(xué)純。

2 實驗方法

2.1 4-硝基-1H-吲唑 (5)的合成

將1.51 g（9.8 mmol）2-甲基-3-硝基苯胺溶于37.5 ml冰醋酸。然后，將0.82 g亞硝酸鈉（12.0 mmol）溶于3.5 ml 水，加入上述反應(yīng)液中，室溫反應(yīng)8 h。將反應(yīng)液倒入冰水中，析出固體，過濾，干燥后重結(jié)晶得1.07 g黃色晶體，收率66.9%。1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 13.92 (s, 1H), 8.54 (s, 1H), 8.16(d,J= 7.68 Hz, 1H), 8.10 (d,J= 8.14 Hz, 1H), 7.61( t,J= 8.02 Hz, 1H)；ESI-MS (m/z): 164.2 (M+H+)。

2.2 N-(4-氟芐基)-1H-吲唑-4-胺 (7)的合成

將4.02 g 4-硝基-1H-吲唑（5）溶于60 ml甲醇，加入1.02 g 10%鈀碳，室溫催化氫化反應(yīng)2 h，過濾，濃縮得3.20 g 4-氨基吲唑（6）。將1.6 g（12.0 mmol）化合物6溶于25 ml甲醇，然后滴加1.93 ml（18.0 mmol）4-氟苯甲醛，室溫反應(yīng)1 h，然后，緩慢加入909.5 mg（24.1 mmol）硼氫化鈉，室溫下反應(yīng)30 min，蒸去溶劑，二氯甲烷萃取3次，合并有機(jī)層，用飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉干燥，蒸去溶劑，柱層析得1.2 g褐色固體，收率41.6%。1H NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ 12.70 (s, 1H), 8.19 (s,1H), 7.40 (t,J= 6.0 Hz, 2H), 7.12(t,J=15.0 Hz, 2H),6.91～7.00（m,2H）,6.64(d,J=12.0 Hz,1H),5.93(d,J=9.0 Hz,1H),4.40(d,J=6.0 Hz,2H)；ESI-MS (m/z):242.9 (M+H+)。

2.3 (1R,3S,5R)-2-叔丁氧基-3-(((叔丁基二苯基硅基)氧基)甲基)-5-(4-((4-氟芐基)氨基)-1H-吲唑-1-基)環(huán)戊-1-醇 (9)的合成

將0.33 g (2 mmol)N-(4-氟芐基)-1H-吲咗-4-胺7和0.53 g (2 mmol) 18-冠-6加入到無水THF(30 ml)中，氮氣保護(hù)下，緩慢加入0.08 g (2 mmol)60%鈉氫，室溫攪拌5 min，然后，升溫至80 ℃，攪拌20 min后加入(3aS, 5S, 6aS)-4-叔丁氧基-5-((叔丁基二苯基硅基氧基)甲基)四氫-4H-環(huán)戊-[d][1,3,2]-二氧硫雜-2,2-二氧化物 8 (2 mmol)，繼續(xù)反應(yīng)8 h，冷卻至0 ℃，用20%硫酸調(diào)pH為3，在50 ℃下攪拌30 min。用10%氫氧化鈉水溶液調(diào)pH為中性后，二氯甲烷萃取(10 ml×3)，合并有機(jī)層，干燥，蒸去溶劑后柱色譜純化得到534 mg藍(lán)色油狀物9，收率53.3%。1H NMR (300 MHz,DMSO-d6)δ: 7.96 (s, 1 H), 7.84 - 7.74 (m, 4 H), 7.46 -7.41 (m, 9 H), 7.37 (q,J= 5.4, 8.8 Hz, 1 H), 7.25 (q,J= 7.6, 8.3 Hz, 1 H), 6.94 (d,J= 8.4 Hz, 1 H),6.25(d,J=7.6 Hz, 1 H), 4.93 - 4.89(m, 1 H), 4.69 (s,1 H), 4.52 (s, 2 H), 4.47 (d,J= 5.7, 8.0 Hz, 1 H), 4.15(brs, 1 H), 3.82 (ddd,J= 7.0, 10.4, 17.0 Hz, 2 H),3.58 (d,J= 5.3 Hz, 1 H), 2.71 - 2.64 (m, 1 H), 2.58 -2.51 (m, 1 H), 2.40 - 2.34 (m, 1 H), 1.22 (s, 9 H),1.15 (s, 9 H)； ESI-MS (m/z): 666.3 (M+H+)。

2.4 硫代碳酸苯基(1R,3S,5R)-2-叔丁氧基-3-(((叔丁基二苯基硅基)氧基)甲基)-5-(4-((4-氟芐基)氨基)-1H-吲唑-1-基)環(huán)戊酯(10)的合成

向0.8 g (1.2 mmol)化合物9的二氯甲烷(20 ml) 溶液中加入N,N-二甲氨基吡啶0.44 g (3.6 mmol) 和硫代氯甲酸苯酯0.41 g (2.4 mmol)，室溫反應(yīng)12 h，用甲醇 (1 ml) 淬滅，飽和食鹽水洗滌，干燥，蒸去溶劑，柱色譜分離得211 mg 黃色油狀物10，收 率21.9%。1H NMR (300 MHz, CDCl3)δ:8.05 (s, 1 H), 7.76 - 7.72 (m, 4 H), 7.51 - 7.42 (m, 8 H), 7.35 (t,J= 7.6 Hz, 2 H), 7.26 (t,J= 7.6 Hz, 2 H),7.13 - 7.08 (m, 2 H), 6.94 - 6.89 (m, 3 H), 6.26 (d,J=7.6 Hz, 1 H), 6.09 (q,J= 3.8 Hz, 1 H), 5.37 - 5.30(m, 2 H), 4.61 (t,J= 4.0 Hz, 1 H), 4.53 (s, 2 H), 3.82(dq,J= 7.0, 10.1, 17.2 Hz, 2 H), 2.81 - 2.72 (m, 1 H),2.35 - 2.23 (m, 2 H), 1.26 (s, 9 H), 1.12 (s, 9 H)； ESIMS(m/z): 802.3 (M+H+)。

2.5 1-((1R,4S)-3-叔丁氧基-4-(((叔丁基二苯基硅基)氧基)甲基)環(huán)戊基)-N-(4-氟芐基)-1H-吲唑-4-胺 (11)的合成

向0.56 g (0.7 mmol) 化合物10的無水甲苯(20 ml) 溶液中加入三正丁基氫化錫1.05 g (3.6 mmol) 和偶氮二異丁腈0.39 g (2.4 mmol)，110 ℃反應(yīng)1.5 h，蒸去溶劑，柱色譜分離得141 mg 黃色油狀物11，收率31.0%。1H NMR (300 MHz,CDCl3)δ: 7.97 (s, 1 H), 7.78 - 7.68 (m, 4 H), 7.49 -7.35 (m, 8 H), 7.25 - 7.16 (m, 1 H), 7.06 (t,J= 8.8 Hz, 2 H), 6.96 - 6.84 (m, 1 H), 6.80 (d,J= 8.4 Hz, 1 H), 6.19 (d,J= 7.6 Hz, 1 H), 5.28 - 5.14 (m, 1 H),4.53 - 4.41 (m, 3 H), 3.83 (dq,J= 6.0, 10.0, 16.3 Hz,2 H), 2.64 - 2.50 (m, 1 H), 2.47 - 2.35 (m, 1 H), 2.35 -2.18 (m, 3 H), 1.18 (s, 9 H), 1.09 (s, 9 H)； ESI-MS(m/z): 650.3 (M+H+)。

2.6 ((1S,4R)-2-叔丁氧基-4-(4-((4-氟芐基)氨基)-1H-吲唑-1-基)環(huán)戊基)甲醇 (12) 的合成

將0.13 g (0.2 mmol) 化合物11溶于THF (3 ml) 和吡啶 (3 ml)混合溶劑中，冷卻至室溫，滴加0.21 g (2.1 mmol) 吡啶氫氟酸鹽，滴完后室溫反應(yīng)1 h。飽和碳酸鈉溶液調(diào)pH為中性，用乙酸乙酯和水分層，有機(jī)層用飽和食鹽水洗滌，干燥，蒸去溶劑，柱色譜分離得81 mg 黃色油狀物12，收率97.9%。1H NMR (300 MHz, CDCl3)δ: 7.91 (s, 1 H),7.38 (dd,J= 5.4, 8.4 Hz, 2 H), 7.19 (t,J= 8.1 Hz, 1 H), 7.43 - 7.32 (m, 2 H), 6.82 (d,J= 8.4 Hz, 1 H),6.19 (d,J= 7.5 Hz, 1 H), 5.22 - 5.10 (m, 1 H), 4.62(q,J= 6.4 Hz, 1 H), 4.47 (s, 2 H), 3.89 (dd,J= 2.6,11.4 Hz, 1 H), 3.72 (dd,J= 5.6, 11.4 Hz, 1 H), 3.48(br s, 1 H), 2.60 - 2.47 (m, 2 H), 2.47 - 2.34 (m, 1 H),2.30 - 2.08 (m, 2 H), 1.26 (s, 9 H)； ESI-MS (m/z):412.2 (M+H+)。

2.7 ((1S,4R)-2-叔丁氧基-4-(4-((4-氟芐基)氨磺酰胺)-1H-吲唑-1-基)環(huán)戊基)甲基 磺酰胺 (13) 的合成

將82 mg (0.2 mmol) 化合物12和0.14 ml (1.0 mmol) 三乙胺加入到乙腈(5 ml)中，冷卻至0 ℃，加入2.0 mol/L氯磺酰胺乙腈溶液 (0.6 mmol)，室溫反應(yīng)70 min。用甲醇 (2 ml) 淬滅，蒸去溶劑，柱色譜分離得45 mg 棕色油狀物13，收率40.7%。1H NMR (300 MHz, CDCl3)δ: 7.99 (s, 1 H), 7.32 (d,J=8.1 Hz, 1 H), 7.25 - 7.11 (m, 3 H), 7.04 (d,J= 7.0 Hz, 1 H), 6.85 (t,J= 8.8 Hz, 2 H), 5.24 (s, 2 H), 5.07(s, 1 H), 4.84 (s, 2 H), 4.43 - 4.30 (m, 2 H), 4.28 -4.16 (m, 1 H), 2.80 - 2.65 (m, 1 H), 2.43 - 2.30 (m, 1 H), 2.27 - 2.16 (m, 1 H), 2.16 - 2.03 (m, 2 H), 1.86(s, 2 H), 1.19 (s, 9 H)； ESI-MS (m/z): 570.2(M+H+)。

2.8 ((1S,4R)-4-(4-((4-氟芐基)(氨磺酰胺)-1H-吲唑-1-基)-2-羥基環(huán)戊基)甲基磺酰胺 (14) 的合成

將57 mg (0.1 mmol) 化合物13溶于70%三氟乙酸溶液，室溫反應(yīng)1.5 h，用甲醇 (5 ml) 淬滅，蒸去溶劑，柱色譜分離得25 mg 深藍(lán)色油狀物14，收率62.1%。1H NMR (600 MHz, CD3OD)δ: 8.05 (s, 1 H), 7.51 (d,J= 8.5 Hz, 1 H), 7.37 (dd,J= 7.3, 8.4 Hz, 1 H), 7.30 - 7.27 (m, 2 H), 7.20 (d,J= 7.3 Hz, 1 H), 6.93 - 6.89 (m, 2 H), 5.45 - 5.37 (m, 1 H), 4.54(t,J= 4.0 Hz, 1 H), 4.39 (dd,J= 7.6, 9.8 Hz, 1 H),4.23 (dd,J= 7.2, 9.8 Hz, 1 H), 2.86 - 2.76 (m, 1 H),2.48 - 2.40 (m, 1 H), 2.32 (ddd,J= 1.6, 7.8, 9.7 Hz, 1 H), 2.25 - 2.11 (m, 2 H), 2.10 - 2.04 (m, 1 H), 1.68 -1.59 (m, 1 H)； ESI-MS (m/z): 514.1 (M+H+)。

2.9 體外抗腫瘤活性測試[9]

選用人肺腺癌細(xì)胞H1299、人腸癌細(xì)胞HCT116、人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231、人肝癌細(xì)胞HepG2、人胰腺癌細(xì)胞PANC-1、人骨肉瘤細(xì)胞Saos-2 及U-2 OS，均由上海醫(yī)藥工業(yè)研究院藥理室凍存和傳代。樣品用DMSO（Merck）溶解后，加入PBS配成1 000 μg/ml的溶液或均勻的混懸液，然后用含DMSO的PBS稀釋。向96孔板每孔加入濃度為（5～6）×104個/ml的細(xì)胞懸液100 μl，置37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)。24 h后，加入樣品液，每孔10 μl，設(shè)雙復(fù)孔，37 ℃，5% CO2作用72 h。每孔加入5 mg/ml的MTT溶液20 μl，作用4 h后加入溶解液，每孔100 μl，置培養(yǎng)箱內(nèi)，溶解后用MK-2全自動酶標(biāo)儀測570 nmOD值。

2.10 蛋白質(zhì)免疫印跡實驗[10]

選用12孔4%～12% Bis/Tris SDS-PAGE膠，每孔上樣40 μg提取蛋白。第一泳道加6 μl marker，上樣蛋白按濃度從高到低或從低到高排列加樣。用MES SDS電泳液在80 V條件下作用30 min，調(diào)節(jié)電壓至150 V跑膠約1 h。在NuPAGE轉(zhuǎn)膜液中，在50 V電壓下轉(zhuǎn)膜2 h。然后室溫封閉2 h，洗膜3次，每次15 min。在4℃條件下孵育一抗，過夜。洗膜3次，避光撫育二抗50 min，洗膜3次，用LI-COR掃膜儀掃膜。

2.11 細(xì)胞凋亡試驗

向6孔板中分別加入HCT116和PANC-1細(xì)胞(5×105個/ml)和10 μmol/L的化合物14后，分別孵育12、24和48 h，胰蛋白酶消化后用PBS冷溶液洗滌2次。離心去除上清液后，將細(xì)胞懸浮于400 μl緩沖液，加入5 μl的annexin V-FITC，室溫孵育15 min。然后加入10 μl的碘化丙啶，室溫避光繼續(xù)孵育15 min，收集細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀(BD Accuri C6)檢測。

2.12 細(xì)胞周期試驗

向HCT116和PANC-1細(xì)胞中加入10 μmol/L的化合物14后，分別孵育12、24和48 h。收集細(xì)胞，PBS溶液洗滌2次，用75%乙醇固定過夜。PBS溶液洗滌后，懸浮于100 μl PBS溶液，加入200 mg/ml Rnase，反應(yīng)30 min消除RNA干擾。然后，加入20 μg/ml的碘化丙啶，孵育30 min，洗滌，用流式細(xì)胞儀檢測。

3 結(jié)果與討論

3.1 化學(xué)合成

目標(biāo)化合物的合成經(jīng)過23步反應(yīng)得到，合成路線見圖2。以2-甲基-3-硝基苯胺4為原料，環(huán)合生成4-硝基吲唑5。經(jīng)10% Pt/C催化還原硝基生成4-氨基吲唑6后，與4-氟苯甲醛在甲醇中室溫反應(yīng)，硼氫化鈉還原后得到關(guān)鍵中間體7。參考文獻(xiàn)以D-核糖為原料，經(jīng)12步反應(yīng)，以16.0%的總收率獲得另一個關(guān)鍵中間體8[11]。在18-冠-6催化下，化合物7與中間體8反應(yīng)后，水解生成化合物9，收率為53.3%。將化合物9與硫代氯甲酸苯酯反應(yīng)后，在AIBN催化下用n-Bu3SnH還原成胺11。然后，用吡啶氟化氫鹽脫去TBDPS保護(hù)，得到5'-羥基化合物12。最后，與氯磺酰胺反應(yīng)生成5'-氯磺酰胺13，脫去叔丁氧基保護(hù)得到目標(biāo)化合物14，反應(yīng)總收率為0.1%。

表1 雙磺酰胺吲唑14的體外抗增殖活性

3.2 體外抗腫瘤活性研究

課題組選擇 (H1299、HCT116、MDA-MB-231、HepG2、PANC-1、Saos-2和U2 OS)7種腫瘤細(xì)胞株，以多柔比星為陽性對照，采用MTT法開展了體外抗腫瘤活性研究，結(jié)果見表1。相對陽性對照藥多柔比星，化合物14對所有腫瘤細(xì)胞株均表現(xiàn)出中等程度的活性，但也顯示出一定的選擇性。對H1299、HCT116、PANC-1、Saos-2和U2 OS活性優(yōu)于其他2種腫瘤細(xì)胞株，如對Saos-2細(xì)胞株的IC50達(dá)3.45 μmol/L，相比MDA-MA-231細(xì)胞株提高23倍，以上結(jié)果初步說明化合物14具有一定的廣譜抗腫瘤活性。

3.3 NAE抑制活性研究

為考察化合物14對HCT116腫瘤細(xì)胞的NAE抑制活性，課題組進(jìn)行免疫蛋白印跡實驗，結(jié)果見圖3A。不同濃度化合物14作用24 h后，UBC12-NEDD8水平得到明顯抑制，并且呈劑量依賴性導(dǎo)致UBC12蛋白的累積，與陽性對照藥MLN4924的作用一致(圖3B)。結(jié)果表明，化合物14能有效抑制NAE活性。

3.4 細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)作用和細(xì)胞周期阻滯研究

為進(jìn)一步研究化合物14的抗腫瘤機(jī)制，課題組選擇較為敏感的2種腫瘤細(xì)胞株P(guān)ANC-1 和HCT116進(jìn)行了細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期阻滯研究。10 μmol/L化合物14作用48 h后，在PANC-1細(xì)胞株中顯示出明顯的細(xì)胞凋亡作用(圖4A)。相比空白組的1.80%，凋亡細(xì)胞率上升至23.83%，并且呈時間依賴性?；衔?4作用12 h后，能明顯導(dǎo)致G2期細(xì)胞阻滯(圖4B)。初步表明化合物14通過細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期阻滯作用抑制PANC-1細(xì)胞增殖作用。但是，對HCT116細(xì)胞株，化合物14作用48 h后能明顯導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，但對細(xì)胞周期影響較小(圖5A、圖5B)。

4 結(jié)論

采用骨架躍遷的藥物設(shè)計策略，以吲唑骨架代替MLN4924的吡咯并嘧啶骨架，得到一類非核苷的NAE抑制劑，顯示出廣譜的抗腫瘤活性。機(jī)制研究表明，雙磺酰胺類化合物14能顯著誘導(dǎo)PANC-1細(xì)胞的凋亡作用，導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯，是值得進(jìn)一步研究的NAE抑制劑先導(dǎo)化合物。