組學(xué)技術(shù)在遺傳代謝病篩查、診斷及發(fā)病機(jī)制探索中的應(yīng)用研究進(jìn)展

王朝，張瑄

1 天津市兒童醫(yī)院（天津大學(xué)兒童醫(yī)院） 天津市兒科研究所 天津市兒童出生缺陷防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300134；2 天津市兒童醫(yī)院（天津大學(xué)兒童醫(yī)院）腎臟內(nèi)科

遺傳代謝?。↖MDs）是一類由基因缺陷導(dǎo)致的內(nèi)源性物質(zhì)代謝紊亂性疾病，常伴隨著身體的多系統(tǒng)受損和多種臨床表現(xiàn)，包括有機(jī)酸血癥、尿素循環(huán)缺陷、溶酶體貯積癥（LSD）和氨基酸代謝障礙等，大多數(shù)呈常染色體隱性或X連鎖隱性遺傳，其發(fā)生率較低，但危害性較大。大多數(shù)IMDs患者臨床表現(xiàn)各不相同，通常伴有非特異性癥狀，如生長發(fā)育障礙、肌張力減退、腎臟和肝臟疾病以及智力障礙等［1］。許多IMDs是嚴(yán)重的早發(fā)性疾病，早期治療可改善臨床結(jié)果，若未及時(shí)發(fā)現(xiàn)并進(jìn)行干預(yù)，其結(jié)果可能是災(zāi)難性的，因此在癥狀出現(xiàn)之前進(jìn)行篩查至關(guān)重要。組學(xué)技術(shù)是指利用高通量、高分辨率、高靈敏度和高效率的技術(shù)手段對(duì)生物體內(nèi)不同層面物質(zhì)的分子組成進(jìn)行全面、系統(tǒng)、定量或半定量地檢測和分析的技術(shù)，是研究生物體內(nèi)全套DNA、RNA、蛋白質(zhì)或代謝物等的一類學(xué)科，最常見的四種組學(xué)技術(shù)是基因組學(xué)技術(shù)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)、蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)和代謝組學(xué)技術(shù)。不同組學(xué)反映機(jī)體不同層面的信息，相互之間關(guān)系密切，既可以單獨(dú)應(yīng)用也可以聯(lián)合使用。具備大數(shù)據(jù)分析能力后，組學(xué)技術(shù)進(jìn)一步發(fā)展和普及，將多種組學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行整合分析的多組學(xué)分析技術(shù)已成為疾病研究的新的有力工具，而機(jī)器學(xué)習(xí)和人工智能的出現(xiàn)又推動(dòng)了組學(xué)技術(shù)的發(fā)展。隨著高通量測序技術(shù)和質(zhì)譜技術(shù)的出現(xiàn)和成熟，組學(xué)技術(shù)逐漸應(yīng)用到了IMDs的臨床和科研中，現(xiàn)將組學(xué)技術(shù)在IMDs篩查、診斷以及發(fā)病機(jī)制探索中的應(yīng)用研究進(jìn)展綜述如下。

1 基因組學(xué)技術(shù)在IMDs診斷和篩查中的應(yīng)用

基因組學(xué)是對(duì)生物體中全部DNA序列進(jìn)行研究的學(xué)科，以DNA變異為主要研究內(nèi)容。基因組中的變異分為單核苷酸變異（SNV）和結(jié)構(gòu)變異（SV）。SNV中頻率大于1%者被稱為單核苷酸多態(tài)性（SNP）。編碼區(qū)基因變異可能影響蛋白質(zhì)序列，而非編碼區(qū)的變異則可能影響基因表達(dá)和剪接。目前檢測DNA變異的技術(shù)有Sanger測序、二代測序（NGS）和基因芯片等。臨床應(yīng)用最廣泛的是用于基因變異篩查的NGS和用于基因變異確證的Sanger測序。實(shí)際應(yīng)用中，NGS又包括全基因組測序（WGS）和全外顯子組測序（WES），前者多用于復(fù)雜疾病的遺傳學(xué)分析，后者多用于致病基因明確的遺傳病的檢測。全基因組關(guān)聯(lián)分析（GWAS）一般用于較大規(guī)模人群的基因型檢測［2］。

在IMDs實(shí)際應(yīng)用中，基因組學(xué)技術(shù)可應(yīng)用于產(chǎn)前診斷、新生兒篩查（NBS）、疾病診斷和基因變異攜帶者篩查等。在產(chǎn)前診斷的應(yīng)用中，有研究者應(yīng)用外顯子組測序?qū)?27例不明原因的非免疫性胎兒水腫進(jìn)行分析，在大約三分之一的病例中發(fā)現(xiàn)了診斷性遺傳變異［3］。在NBS應(yīng)用中，迄今為止對(duì)IMDs人群進(jìn)行的最大規(guī)模的測序計(jì)劃中，基于450萬嬰兒人群的IMDs病例數(shù)據(jù)分析顯示，WES的總體敏感性為88%，特異性為98.4%，而串聯(lián)質(zhì)譜（MS/MS）分別為99.0%和99.8%［4］，僅從敏感性和特異度講，WES低于質(zhì)譜，無法作為NBS中IMDs的主要篩查方法，但它可以作為MS/MS篩查異常嬰兒的二級(jí)檢測，進(jìn)一步減少假陰性結(jié)果，促進(jìn)疑難病例及時(shí)解決。在IMDs診斷應(yīng)用中，一項(xiàng)單中心研究借助于NGS和Sanger測序，對(duì)最常見有機(jī)酸血癥——甲基丙二酸血癥（MMA）基因變異譜進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示中國天津地區(qū)MMA常見變異為MMACHC基因c.609G＞A、c.658_660delAAG和c.80A＞G，與中國既往研究相一致［5］。利用基因組學(xué)技術(shù)進(jìn)行群體變異篩查也對(duì)IMDs研究有幫助。影響尿液代謝物水平的罕見遺傳變異就和IMDs關(guān)系密切，CHENG等研究了4864名受試者中罕見的外顯子遺傳變異對(duì)尿液中1487種代謝產(chǎn)物和53714種代謝產(chǎn)物比率的影響，檢測到了涉及30個(gè)基因的128個(gè)重要關(guān)聯(lián)，其中16個(gè)基因已知是IMDs的致病基礎(chǔ)［6］。

2 轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)在IMDs診斷和發(fā)病機(jī)制研究中的應(yīng)用

轉(zhuǎn)錄組學(xué)是對(duì)生物體全部RNA產(chǎn)物進(jìn)行研究的學(xué)科。轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析提供了有關(guān)mRNA質(zhì)量和數(shù)量的全面信息，不僅可以在mRNA序列水平上檢測遺傳變異，而且能夠通過評(píng)估諸如基因表達(dá)水平、異常剪接或基因融合等直接分析遺傳變異的影響，例如同義變異也可以引起異常的剪接，對(duì)異常剪接的檢測不僅可以為外顯子變異提供關(guān)鍵信息，而且可以驗(yàn)證非編碼區(qū)變異的致病性。轉(zhuǎn)錄組分析不僅能夠幫助分析部分WES結(jié)果陰性患者的分子診斷，更重要的是，基于RNA測序（RNA-seq）的轉(zhuǎn)錄組分析還可以幫助尋找治療干預(yù)點(diǎn)，如最近報(bào)道的對(duì)脊髓性肌肉萎縮癥中剪接缺陷的反義寡核苷酸治療［7］。

在疾病診斷的探索性研究中，研究者利用RNAseq對(duì)205例WES檢測結(jié)果陰性的孟德爾遺傳病病例進(jìn)行分析，對(duì)其中16%的病例做出了基因診斷，主要診斷依據(jù)是異常的mRNA表達(dá)量，其中表達(dá)量減少50%者提示只有單一等位基因表達(dá)，符合顯性遺傳病中單倍劑量不足的發(fā)病機(jī)制［8］。有研究者［9］通過RNA-seq實(shí)驗(yàn)性診斷Sanger測序陰性的4名男性黏多醣貯積癥（MPS）Ⅱ患者，結(jié)果顯示患者IDS基因表達(dá)水平明顯下降，IDS基因第8、9外顯子出現(xiàn)跳讀，此項(xiàng)研究驗(yàn)證了轉(zhuǎn)錄組分析在MPS Ⅱ中的診斷價(jià)值。在疾病機(jī)制探索的應(yīng)用中，OUSSALAH等［10］利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析未找到病因的MMA的發(fā)病機(jī)制，發(fā)現(xiàn)PRDX1基因剪接位點(diǎn)變異激活了包含雙向啟動(dòng)子的MMACC/CCCD163P和TESK2的反義轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而導(dǎo)致MMACHC和TESK2基因的沉默，這是MMA新致病機(jī)制的重要發(fā)現(xiàn)。在MPS研究中，為了研究與行為相關(guān)的基因表達(dá)是否在MPS中發(fā)生了變化，研究者對(duì)所有MPS類型的細(xì)胞系進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，評(píng)估了與行為相關(guān)的基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)MPS不同類型在這方面存在顯著差異，MPS ⅢA型的變化最嚴(yán)重，而MPS ⅣA和MPS Ⅵ型的變化最低［11］。PIERZYNOWSKA等還使用RNA-seq分析了MPS患者是否更容易感染COVID-19，在對(duì)MPS細(xì)胞系中可能參與SARS-CoV-2發(fā)展的基因的表達(dá)水平進(jìn)行檢測后，發(fā)現(xiàn)在大多數(shù)MPS類型中，可能促進(jìn)病毒進(jìn)展的4個(gè)基因（GTF2F2、RAB18、TMEM97、PDE4DIP）表達(dá)下調(diào)，而可能干擾病毒繁殖的2個(gè)基因（FBN1、MFGE8）的表達(dá)則上調(diào)。盡管MPS的特征——呼吸道狹窄和出現(xiàn)黏稠黏液是COVID-19的危險(xiǎn)因素，但最終的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析表明MPS細(xì)胞對(duì)SARS-CoV-2感染的敏感性可能更低，而不是更高［12］。在金屬離子代謝病研究方面，研究者使用RNA-seq比較了暴露于銅的野生型HepG2細(xì)胞和ATP7B基因敲除細(xì)胞之間的基因表達(dá)模式，結(jié)果表明細(xì)胞通過激活自噬以應(yīng)對(duì)銅過載，防止銅誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。在缺乏ATP7B的疾病，如肝豆?fàn)詈俗冃曰颊叩闹委熤?，旨在激活這種自噬途徑的藥物可能會(huì)降低患者的銅毒性［13］。

3 蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在IMDs發(fā)病機(jī)制研究中的應(yīng)用

蛋白質(zhì)組學(xué)可以揭示在疾病狀態(tài)中起著至關(guān)重要作用的蛋白質(zhì)的合成、穩(wěn)定性、降解和信號(hào)傳遞水平的異常。然而目前IMDs的蛋白質(zhì)組學(xué)研究仍然較少，多數(shù)研究集中在特定的細(xì)胞器或功能上。用于研究蛋白質(zhì)組學(xué)的主要技術(shù)有兩大類，一類是質(zhì)譜技術(shù)，另一類是基于抗體的技術(shù)，如ELISA、Western blot等?；谫|(zhì)譜的定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在方法上可分為標(biāo)記和無標(biāo)記兩大類，根據(jù)檢測物的不同通常又分為非靶向蛋白質(zhì)組學(xué)和靶向蛋白質(zhì)組學(xué)。根據(jù)研究目的的不同，蛋白質(zhì)組學(xué)又可以分為三個(gè)不同的類別：表達(dá)蛋白質(zhì)組學(xué)、結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)組學(xué)和功能蛋白質(zhì)組學(xué)［14］。近年來，基于液相MS/MS的蛋白質(zhì)組學(xué)分析被更廣泛地用于IMDs，這種既可以分析組織也可以分析體液的技術(shù)，可以同時(shí)對(duì)數(shù)千種蛋白質(zhì)的表達(dá)譜進(jìn)行定性和定量分析。蛋白質(zhì)組學(xué)分析已經(jīng)成為表征患者分子特征的強(qiáng)大工具。

在對(duì)MMA的發(fā)病機(jī)制研究中，COSTANZO等［15］利用蛋白質(zhì)組學(xué)揭示甲基丙二酰-CoA變位酶（MUT）調(diào)節(jié)細(xì)胞結(jié)構(gòu)和增加對(duì)應(yīng)激的敏感性。該研究對(duì)MUT變異的HEK 293細(xì)胞進(jìn)行了無標(biāo)記的定量蛋白質(zhì)組學(xué)和生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)了變異的細(xì)胞結(jié)構(gòu)和形態(tài)的改變以及ROS的過量產(chǎn)生。此外，他們還觀察到參與細(xì)胞骨架、細(xì)胞粘附、細(xì)胞運(yùn)輸、線粒體和氧化過程的蛋白質(zhì)的改變。MUT-KO細(xì)胞通過線粒體功能障礙和氧化還原過程失衡增加對(duì)丙酸和H2O2誘導(dǎo)的應(yīng)激的敏感性。在對(duì)LSD的研究中，DOYKOV等［16］對(duì)法布里?。‵D）患者尿樣進(jìn)行了蛋白質(zhì)組學(xué)分析，將早期或無癥狀FD患者的尿樣與健康對(duì)照組的尿樣進(jìn)行了比較，結(jié)果顯示，在早期或無癥狀FD疾病組中，6種尿蛋白水平升高。據(jù)此推測，尿白蛋白水平升高可能提示癥狀前狀態(tài)。ZHANG等［17］使用免疫捕獲和基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)相結(jié)合的方法定量分析干血斑和頰拭子樣本中的麥芽糖酶蛋白和α-L-艾杜糖醛酸酶蛋白，發(fā)現(xiàn)這兩種蛋白的缺失分別與嬰兒龐貝病和嚴(yán)重MPS Ⅰ相關(guān)。

4 代謝組學(xué)技術(shù)在IMDs篩查、新標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)和發(fā)病機(jī)制研究中的應(yīng)用

代謝組學(xué)的研究對(duì)象是生物體內(nèi)相對(duì)分子量小于1000的小分子物質(zhì)。代謝組學(xué)分為非靶向代謝組學(xué)和靶向代謝組學(xué)。非靶向代謝組學(xué)可對(duì)樣本中提取的所有代謝物進(jìn)行分析，這在新生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)中非常重要。與傳統(tǒng)篩查方法相比，非靶向代謝組學(xué)的診斷率可以提高5倍，可識(shí)別更廣泛的IMDs譜系［18］。非靶向代謝組學(xué)的缺點(diǎn)是目前數(shù)據(jù)庫中可能沒有足夠的可供使用的相關(guān)注釋。靶向代謝組學(xué)只對(duì)預(yù)先設(shè)定的代謝物進(jìn)行檢測和分析?？偟膩碚f，在單一酶缺陷如何影響多種途徑以及如何通過治療的形式克服這一缺陷方面，代謝組學(xué)可以提供多通路變化的綜合信息，具有很大的發(fā)揮空間。目前代謝組學(xué)出現(xiàn)一些新的方法策略，如基于通路的非靶向代謝物富集分析方法在IMDs診斷中可以發(fā)揮重要作用。有研究者［19］利用批外參考人群改進(jìn)IMDs篩查中的非靶向代謝組學(xué)篩選，提高了通量和檢測準(zhǔn)確性，為在臨床環(huán)境中使用大量批外參考樣本提供了可能性。此外自動(dòng)化數(shù)據(jù)處理也被應(yīng)用到了代謝組學(xué)，有潛力促進(jìn)非靶向代謝組學(xué)在代謝病診斷篩查中的應(yīng)用［20］。新的分析平臺(tái)也促進(jìn)了代謝組學(xué)的發(fā)展，如Renata DX篩選系統(tǒng)是一個(gè)完全集成的流動(dòng)注射MS/MS系統(tǒng)，經(jīng)過性能評(píng)估可用于常規(guī)實(shí)驗(yàn)室NBS項(xiàng)目中的高通量干血斑分析。

在臨床應(yīng)用中IMDs與代謝組學(xué)的關(guān)系最為密切，從代謝組學(xué)中獲益最多，其中最常見的應(yīng)用就是代謝病篩查，NBS項(xiàng)目多使用靶向代謝組學(xué)技術(shù)。非靶向代謝組學(xué)也可以用于IMDs的診斷，比如以無偏倚診斷方法用于診斷戊糖磷酸途徑非氧化分支疾病。代謝組學(xué)另一重要應(yīng)用是探索發(fā)現(xiàn)新的疾病標(biāo)志物，這當(dāng)中主要用到非靶向代謝組學(xué)。有研究者應(yīng)用非靶向代謝組學(xué)分析揭示了尿素循環(huán)障礙的多途徑干擾和新的臨床生物標(biāo)志物。與紅外離子光譜學(xué)聯(lián)合使用，非靶向代謝組學(xué)確定了吡哆醇依賴性癲癇的新標(biāo)記物2S，6S-/2S，6R-氧丙基哌啶-2-羧酸（2-OPP）［21］。代謝組學(xué)分析也是疾病機(jī)制探索的重要手段，例如代謝組學(xué)分析結(jié)果顯示，經(jīng)典半乳糖血癥不僅損害Leloir途徑，還涉及其他代謝途徑，包括糖酵解、磷酸戊糖途徑和紅細(xì)胞中的核苷酸代謝。整合代謝組分析揭示了妊娠期糖尿病孕婦糞便代謝組和新生兒血液代謝組之間的新聯(lián)系。

5 其他組學(xué)技術(shù)在IMDs診斷中的應(yīng)用

除了上述廣泛應(yīng)用而被熟知的組學(xué)技術(shù)外，還有一些比較少見的組學(xué)分析技術(shù)也被應(yīng)用到了IMDs的研究中。表型組學(xué)是研究一種或一類疾病所有臨床表型的學(xué)科，結(jié)合IMDs生化表型的基于文本的表型譜分析促進(jìn)了IMDs的診斷。糖組學(xué)旨在識(shí)別特定疾病中產(chǎn)生的全部聚糖的結(jié)構(gòu)和功能，也識(shí)別編碼糖蛋白的所有基因。有研究者以糖組學(xué)方法分析先天性糖基化障礙和LSD。除此之外，還有其他一些研究IMDs的組學(xué)技術(shù)，如放射組學(xué)和脂質(zhì)組學(xué)等。

6 多組學(xué)技術(shù)整合在IMDs篩查、診斷及發(fā)病機(jī)制探索中的應(yīng)用

前文所述均為單一組學(xué)的研究，都是在一個(gè)層面上對(duì)疾病生理和病理進(jìn)行分析。隨著組學(xué)技術(shù)的不斷涌現(xiàn)和高通量數(shù)據(jù)分析能力的提高，將多個(gè)組學(xué)聯(lián)合起來應(yīng)用于IMDs研究的綜合分析方法成為一種突破單一組學(xué)局限性的重要方法。例如NBS一般利用MS/MS法鑒定血液中升高的代謝物來檢測IMDs，這是一種經(jīng)濟(jì)而快速的測試，然而這類檢測可能會(huì)遺漏部分疾病，而且對(duì)一些非特異性的分析物的后續(xù)檢測可能耗時(shí)且復(fù)雜，而基因組技術(shù)有可能更準(zhǔn)確地識(shí)別不適用于MS/MS檢測的疾病，因此將基因組學(xué)與代謝組學(xué)整合的方法就很有必要，這也是多組學(xué)整合中最常見的。兩者結(jié)合首先可以明顯提高IMDs識(shí)別，例如以先代謝物篩查后高通量測序的方法對(duì)3-羥基異戊?；鈮A代謝異常新生兒進(jìn)行診斷和遺傳學(xué)分析［22］，非靶向代謝組學(xué)與基因組學(xué)整合的方法還可以顯著增強(qiáng)IMDs中對(duì)基因變異致病性的確認(rèn)。此外，利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)可以幫助提高基因組學(xué)應(yīng)用過程中的基因診斷，如使用WES和RNA-seq聯(lián)合策略可以診斷以視網(wǎng)膜營養(yǎng)不良為主要臨床癥狀的過氧化物酶體生物發(fā)生障礙患者。更多組學(xué)結(jié)合如利用基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和代謝組學(xué)與功能基因組學(xué)整合的方法診斷了6例疑難IMDs病例，分別是半乳糖血癥、Ⅰ型黏多糖病、楓糖漿尿病、高苯丙氨酸血癥、瓜氨酸血癥和尿素循環(huán)缺乏癥。在機(jī)制探索方面，通過整合基因組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組和代謝組數(shù)據(jù)以及表型特征的分析顯示，三羧酸循環(huán)障礙和谷氨酰胺代謝失調(diào)是單純型MMA的重要發(fā)病機(jī)制，以此為靶點(diǎn)篩選的化合物酮戊二酸二甲酯是一種有前景的治療藥物。

綜上所述，隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的不斷發(fā)展，組學(xué)技術(shù)在IMDs的應(yīng)用中得到了廣泛的關(guān)注和探索。從基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)到多組學(xué)等多個(gè)角度，組學(xué)技術(shù)已經(jīng)為研究IMDs提供了全面的視角和深入的分析。這些研究成果不僅深化了人們對(duì)IMDs發(fā)生機(jī)理的認(rèn)識(shí)，而且也為疾病的早期診斷、治療和預(yù)防提供了新的思路和方法。