HPLC法同時(shí)測定七味廣棗散中4種成分的含量*

李書迪，于景華，齊和日瑪，馬 嵐，成日青

（1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010110；2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010050）

七味廣棗散又名七味芍（紹）沙散，是蒙醫(yī)用經(jīng)驗(yàn)方，于1977年被收入《中華人民共和國藥典》[1]。本方由廣棗、丁香、肉豆蔻等7味藥材組成，具有養(yǎng)心、益氣、安神之功效，常用于治療心赫依、心激蕩、心悸、氣短、失眠、心刺痛、癲狂等西醫(yī)診斷的冠心病、心絞痛、心肌梗死、心力衰竭等病，均可服用此藥[2-3]。目前關(guān)于七味廣棗散的研究主要集中在臨床應(yīng)用研究[4-7]，對于其質(zhì)量控制方面的報(bào)道較少，而2015年版《中華人民共和國藥典》中僅規(guī)定了顯微及薄層色譜鑒別方法，并不能很好地控制其產(chǎn)品質(zhì)量[8]。本課題組前期對七味廣棗散進(jìn)行了指紋圖譜研究[9]，通過對10批次樣品進(jìn)行相似度評價(jià)比較，共標(biāo)定出27個(gè)共有峰，并指認(rèn)了其中的6個(gè)成分。在此基礎(chǔ)上，本研究通過進(jìn)一步優(yōu)化色譜條件，建立了同時(shí)測定其中4種成分含量的HPLC法，以期為七味廣棗散（丸）的質(zhì)量評價(jià)和控制提供研究依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器LC-2030C3D高效液相色譜儀（日本島津公司）；KH-250DB型數(shù)控超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）；BSA124S電子天平[賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司]；800Y型多功能粉碎機(jī)（永康市鉑歐五金制品有限公司）；H1850型離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)試藥七味廣棗散由內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)藥劑實(shí)驗(yàn)室制備，批號：20190708，20190807，20190912；沒食子酸對照品（批號：181208，純度98%）購自北京中科質(zhì)檢生物技術(shù)有限公司；原兒茶酸對照品（批號：181007，純度98%）購自北京中科儀友化工技術(shù)研究院；5-羥甲基糠醛對照品（批號：111626-201912，純度99.2%）、丁香酚對照品（批號：110725-201716，純度99.6%）均購自中國食品藥品檢定研究院；乙腈為色譜純，水為超純水，其它試劑均為分析純。

廣棗（產(chǎn)地：湖南，批號：1807010519；產(chǎn)地：廣東，批號：C17082902）、丁香（產(chǎn)地：廣西，批號：193090101，151101）、木香（產(chǎn)地：云南，批號：1811001）、沉香（產(chǎn)地：海南，批號：181411001）、肉豆蔻（產(chǎn)地：廣西，批號：190920201）、牦牛心（產(chǎn)地：西藏，批號：170701）、楓香脂（產(chǎn)地：福建，批號：1811010589）均購自內(nèi)蒙古天康蒙中醫(yī)藥有限責(zé)任公司，并經(jīng)內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)渠弼教授鑒定。

2 方法與結(jié)果

2.1 七味廣棗散供試品的制備取處方中各單味藥材適量，分別用中藥粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎，過100目篩，得各單味藥材細(xì)粉。稱取廣棗細(xì)粉45 g，丁香、肉豆蔻、沉香、木香、楓香脂、牦牛心細(xì)粉各7.5 g，混勻，即得七味廣棗散供試樣品。

2.2 色譜條件色譜柱：SHIMADZU Shim-pack GIST（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.5%乙酸水（B）；梯度洗脫（0~5 min，5%~6%A；5~10 min，6%~11%A；10~20 min，11%~44%A；20~31 min，44%~55%A）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：254 nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.3 溶液的制備

2.3.1 混合對照品溶液的制備 精密稱取沒食子酸、5-羥甲基糠醛、原兒茶酸、丁香酚適量，用70%甲醇溶解，制成沒食子酸、5-羥甲基糠醛、原兒茶酸、丁香酚質(zhì)量濃度分別為121 μg/mL、144 μg/mL、56 μg/mL、5.10 mg/mL的混合對照品儲備液。

2.3.2 供試品溶液的制備 取七味廣棗散約1 g，精密稱定，置錐形瓶中，精密加入70%甲醇20 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理（溫度50℃，頻率100 Hz）1 h，放冷，再次稱質(zhì)量，用70%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，10 000 r/min離心5 min，取上清液，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。

2.3.3 陰性對照溶液的制備 按“2.1”項(xiàng)下七味廣棗散的配方比例及制備工藝，以及“2.3.2”項(xiàng)下供試品溶液的制備方法，分別制成缺廣棗、缺丁香的陰性對照溶液及缺廣棗、丁香的雙陰性對照溶液。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 專屬性試驗(yàn) 分別精密吸取混合對照品溶液、供試品溶液及陰性對照品溶液各10 μL，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，色譜圖見圖1。結(jié)果顯示各待測成分吸收峰的峰形良好，4種成分峰與相鄰色譜峰之間的分離度均大于1.5。七味廣棗散供試品溶液在與沒食子酸、5-羥甲基糠醛、原兒茶酸、丁香酚對照品相應(yīng)位置上，均有相同保留時(shí)間的色譜峰，而缺廣棗的陰性對照溶液無5-羥甲基糠醛及原兒茶酸色譜峰，缺丁香的陰性對照溶液無丁香酚色譜峰，缺廣棗、丁香的陰性對照品溶液無沒食子酸色譜峰。

圖1 HPLC色譜圖

2.4.2 線性關(guān)系考察 取“2.3.1”項(xiàng)下混合對照品儲備液，稀釋并配制成不同濃度的系列混合對照品溶液，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，以對照品濃度為橫坐標(biāo)（X），以其相對應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)（Y），進(jìn)行線性回歸，得回歸方程，結(jié)果見表1。

表1 線性關(guān)系考察結(jié)果

2.4.3 精密度試驗(yàn) 取七味廣棗散樣品（批號：20190912），按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，計(jì)算得到?jīng)]食子酸、5-羥甲基糠醛、原兒茶酸、丁香酚峰面積的RSD分別為0.39%、0.59%、0.44%、0.12%，表明儀器精密度良好。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取七味廣棗散樣品（批號：20190912），按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于制備后0、1、2、4、8、12、24 h按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積，計(jì)算得到?jīng)]食子酸、5-羥甲基糠醛、原兒茶酸、丁香酚峰面積的RSD分別為1.64%、2.31%、0.70%、0.22%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批七味廣棗散樣品（批號：20190912）6份，分別按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積，再按各成分回歸方程計(jì)算4種成分含量及其RSD值，結(jié)果沒食子酸、5-羥甲基糠醛、原兒茶酸、丁香酚含量的RSD分別為2.46%、2.00%、1.97%、2.40%，表明方法重復(fù)性良好。

2.4.6 加樣回收率試驗(yàn) 取“2.4.5”項(xiàng)下已測知含量的七味廣棗散6份，每份約0.5 g，精密稱定，置于錐形瓶中，按對照品加入量與供試品中待測成分量之比約為1:1的比例加入對照品，按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積，并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表2。

表2 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.5 含量測定取3個(gè)批次的七味廣棗散樣品，每批次精密稱取3份，按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計(jì)算4種成分的含量，結(jié)果見表3。

表3 樣品含量測定結(jié)果（±s，mg/g，n=3）

表3 樣品含量測定結(jié)果（±s，mg/g，n=3）

批號 沒食子酸 5-羥甲基糠醛 原兒茶酸 丁香酚20190708 0.533±0.003 0.567±0.001 0.194±0.001 6.495±0.007 20190807 0.521±0.002 0.423±0.002 0.193±0.001 11.165±0.016 20190912 0.574±0.002 0.607±0.010 0.213±0.001 9.456±0.001

3 討 論

本試驗(yàn)前期首先考察了甲醇及乙腈洗脫系統(tǒng)對色譜峰分離的影響，結(jié)果顯示乙腈和0.5%乙酸水溶液作流動(dòng)相時(shí)，出峰快，分離效果好；其次本試驗(yàn)利用二極管陣列檢測器對樣品進(jìn)行分析，觀察全譜的分離與吸收情況，結(jié)果顯示，在254 nm吸收波長處，各色譜峰信號響應(yīng)值大，基線平穩(wěn)，適合樣品的總體分析。

在制備供試品溶液時(shí)，本試驗(yàn)考察了超聲和回流兩種提取方式，發(fā)現(xiàn)其提取效率無明顯差別；又比較了不同濃度甲醇溶液（50%、70%、100%）的提取效果，結(jié)果顯示，70%甲醇提取的供試品溶液色譜峰響應(yīng)值更大。綜合考慮，選用70%甲醇超聲提取1 h作為供試品溶液的制備方法。

蒙藥復(fù)方制劑的功效是其所含成分整體作用的體現(xiàn)，是多種成分、多種機(jī)制綜合作用的結(jié)果，因此單個(gè)成分含量并不能反映其整體療效[10]。隨著分析技術(shù)的發(fā)展，同時(shí)測定多個(gè)有效成分的含量已成為控制復(fù)方制劑質(zhì)量的發(fā)展趨勢。據(jù)藥理學(xué)研究表明，沒食子酸具有抗炎、抗氧化生物活性，對心血管疾病具有防治作用[11-12]；原兒茶酸具有抗炎、抗氧化和抑制腫瘤的作用，對缺血、缺氧的神經(jīng)元細(xì)胞有一定保護(hù)作用[13]；丁香酚具有抗菌消炎、抗氧化、血管舒張及保護(hù)缺氧/復(fù)氧損傷心肌細(xì)胞等作用[14]。由藥理作用可推知，上述3種成分應(yīng)屬于七味廣棗散發(fā)揮臨床療效的物質(zhì)基礎(chǔ)，而5-羥甲基糠醛是小分子醛類化合物，既具有抗氧化、抗心肌缺血等生物活性，又具有細(xì)胞毒性、DNA損傷等毒副作用[15]，因此對這4種成分進(jìn)行定量研究對提高七味廣棗散（丸）的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)具有重要意義。

本研究建立的HPLC法同時(shí)測定了沒食子酸、5-羥甲基糠醛、原兒茶酸、丁香酚含量，簡便、可靠、重現(xiàn)性好，可為七味廣棗散（丸）的質(zhì)量控制及進(jìn)一步研究提供參考。