不同提取方法對(duì)陜產(chǎn)黃精多糖及其抗氧化活性的影響*

王 敏，趙重博，王 晶,4

（1.南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院，江蘇 南京 210008；2.南京臨床藥學(xué)中心，江蘇 南京 210008；3.陜西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，陜西 咸陽(yáng) 712046；4.陜西省中藥基礎(chǔ)與新藥研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 咸陽(yáng) 712046）

黃精來源于百合科植物滇黃精（Polygonatum KingianumColl.et Hemsl.）、黃精（Polygonatum sibiricumRed.）或多花黃精（polygonatum cyrtonemaHua）的干燥根莖[1]，其中第二種黃精主要分布在陜西漢中地區(qū)，以栽培為主，而野生資源遍布秦嶺山脈，因其外形似雞頭，又稱為“雞頭黃精”，是傳統(tǒng)的藥食兩用中藥，具有養(yǎng)陰潤(rùn)肺、滋陰填髓、補(bǔ)脾益氣的功效[2]。黃精含有甾體皂苷、黃酮類、蒽醌類和多糖等多種化學(xué)成分[3-4]。多糖不僅是其中藥用活性較高的一種成分，也是2020年版《中華人民共和國(guó)藥典》規(guī)定的唯一質(zhì)量控制指標(biāo)。黃精多糖主要由葡萄糖、甘露糖、巖藻糖、阿拉伯糖和半乳糖醛酸等組成，具有抗衰老、抗腫瘤、增強(qiáng)免疫力、降血脂血糖及抗氧化損傷等作用[5-7]。黃精多糖生物活性高，其具有重要開發(fā)價(jià)值。據(jù)此，筆者采用不同方法提取黃精多糖，并采用季銨鹽沉淀法分離不同性質(zhì)的多糖組分，研究其結(jié)構(gòu)特征和抗氧化活性，以期為黃精多糖的深入開發(fā)提供依據(jù)。

1 材 料

1.1 藥物與試劑 黃精藥材采自陜西漢中略陽(yáng)步長(zhǎng)集團(tuán)黃精種植基地，經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學(xué)趙重博副教授鑒定為百合科黃精屬植物黃精（Polygonatum sibiritumRed）的干燥根莖。

1-苯基-3-甲基-5-吡唑酮（PMP）（批號(hào)：Y27M11C 114179）、鼠李糖（批號(hào)：H29A10G96375）、木瓜蛋白酶（批號(hào)：P15J11B118475）、阿拉伯糖（批號(hào)：H24J11C116813）、甘露糖（批號(hào)：C25D8H51117）和半乳糖（批號(hào)：S09D11M133218）均購(gòu)自源葉生物有限公司；碳酸氫鈉（批號(hào)：20200713）、磷酸二氫鉀（批號(hào)：20200929）、乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-2Na）（批號(hào)：20200914）、氯化鈉（批號(hào)：20200922）、無水乙醇（批號(hào)：20201019）、硼酸（批號(hào)：20201126）和DPPH（批號(hào)：20200217）均購(gòu)自天津天麗化學(xué)試劑有限公司；葡萄糖（批號(hào)：20190726）、37.5%鹽酸（批號(hào)：20200216）、濃硫酸（批號(hào)：20190924）、維生素C（VC）（批號(hào)：20200104）、溴化鉀（批號(hào)：20200322）和溴代十六烷基三甲胺（CTAB）（批號(hào)：20190918）均購(gòu)自科密歐化學(xué)試劑有限公司。

1.2 主要儀器DIONEX UItimate3000高效液相色譜儀（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）；UV2550型紫外分光光度計(jì)（日本Shimadzu公司）；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；KH-400KDE型高功率數(shù)控超聲波清洗機(jī)（歐萊博科技有限公司）；XJY-2臺(tái)式高速離心機(jī)（上海滬粵明科學(xué)儀器有限公司）；DHG-9140型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（常州恒隆儀器有限公司）；GB5374-91型電子天平（艾安得儀器有限公司）；HH-X型數(shù)顯電熱恒溫水浴鍋（西安莫吉娜儀器制造有限公司）；MG-2200型氮吹儀（上海旦鼎國(guó)際貿(mào)易有限公司）；Tensor-27型博里葉變換紅外色譜儀（德國(guó)Bruker光譜儀器公司）。

2 方 法

2.1 黃精多糖含量的測(cè)定 參照2020年版《中華人民共和國(guó)藥典》[1]測(cè)定黃精多糖含量。

2.2 黃精多糖的提取

2.2.1 樣品預(yù)處理 取黃精藥材細(xì)粉（過五號(hào)篩）500 g加入5倍量的石油醚，于40℃水浴中回流2 h，過濾，揮干溶劑。殘?jiān)屑尤胨幉牧?0倍量的80%乙醇，于80℃水浴中回流2 h，趁熱過濾，殘?jiān)?0%乙醇洗滌2次后，揮干溶劑備用。

2.2.2 回流法提取制備黃精多糖粗品參考文獻(xiàn)[8]，取“2.2.1”項(xiàng)下的脫脂黃精100 g，加入15倍量的蒸餾水回流2次，每次1 h，合并濾液并濃縮至約200 mL，隨后加入95%乙醇至醇量為80%，過夜放置后抽濾，揮干得黃精多糖粗品。

2.2.3 超聲法提取制備黃精多糖粗品參考文獻(xiàn)[9]，取“2.2.1”項(xiàng)下的脫脂黃精100 g加入15倍量的蒸餾水超聲（功率：250 W，頻率：40 kHz，溫度：50℃）2次，1 h/次，合并濾液并濃縮至約200 mL，隨后加入95%乙醇至醇量為80%，過夜放置后抽濾，揮干得黃精多糖粗品。

2.2.4 酶法提取制備黃精多糖粗品參考文獻(xiàn)[10]，取“2.2.1”項(xiàng)下的脫脂黃精100 g，加入15倍量的蒸餾水，加入1.5%木瓜蛋白酶，在pH值為6.0和65℃條件下酶解2次，1 h/次，合并濾液并濃縮至約200 mL，隨后加入95%乙醇至醇量為80%，過夜放置后抽濾，揮干得黃精多糖粗品。

2.3 黃精多糖的分離純化

2.3.1 黃精多糖半精品的制備 黃精多糖粗品裝入截留量為3 500 Da的透析袋，依次用超純水和蒸餾水透析24 h和48 h以去除小分子雜質(zhì)。隨后，將所得到的黃精多糖減壓濃縮，并且按體積比5∶1加入Sevage試劑[V（氯仿）∶V（正丁醇）=4∶1]，渦旋20 min后靜置，3 000 r/min離心10 min，移取上層水相。重復(fù)4次，向所得水相中加入95%乙醇至含醇量為80%，過夜放置后抽濾，揮干得黃精多糖半精品。

2.3.2 黃精多糖酸性組分的提取 黃精多糖半精品2 g溶于60 mL蒸餾水中，加入50 mL的5%的CTAB，靜置2 h后，抽濾收集沉淀。沉淀用10%NaCl溶液溶解后，加入3倍體積95%乙醇后，抽濾收集沉淀。沉淀經(jīng)溶解、透析和真空冷凍干燥得到黃精多糖酸性組分AP1。

2.3.3 黃精多糖中性組分的提取 將CTAB處理后的上清液用1% H3BO3調(diào)至pH值為6.0，再用2 mol/L NaOH溶液調(diào)至pH值為11.0，靜置2 h，抽濾收集沉淀并用10% NaCl溶液溶解，然后用2%乙酸調(diào)至pH值為7.0，加入3倍體積95%乙醇后，抽濾收集沉淀。沉淀經(jīng)溶解、透析和真空冷凍干燥得到黃精多糖中性組分AP2。

2.3.4 黃精多糖堿性組分的提取 用乙酸將提取AP2后的上清液調(diào)至pH值為4.4，加入3倍體積95%乙醇后，抽濾收集沉淀。沉淀經(jīng)溶解、透析和真空冷凍干燥得到黃精多糖堿性組分AP3。

2.4 黃精多糖的抗氧化活性研究參考文獻(xiàn)[10]，分別取系列質(zhì)量濃度的回流、超聲和酶法獲得的黃精多糖粗品和不同性質(zhì)的組分（0.5～8.0mg/mL），以及對(duì)照品Vc溶液（0.5～10.1 mg/mL）各0.2 mL，加入1.0×10-4mol/L DPPH自由基溶液7.8 mL混勻，于515nm處測(cè)定吸光度，所有樣本均做3個(gè)復(fù)孔取平均值計(jì)算DPPH自由基清除率。DPPH自由基清除率=[1-Ai/AO]×100%。其中Ai為樣品加DPPH溶液的吸光度，AO為空白溶液加DPPH溶液的吸光度。

2.5 黃精多糖的結(jié)構(gòu)分析參考文獻(xiàn)[11]，黃精多糖粗品20 mg于西林瓶中，加入0.05 mol/L三氟乙酸溶液3 mL，氮?dú)庵脫Q瓶中空氣后封口后110℃水解5 h，繼而加入甲醇旋蒸，去除三氟乙酸后，再加入超純水2 mL溶解即得黃精多糖水解樣品。向黃精多糖水解樣品加入0.3 mol/L NaOH溶液和0.5 mol/L的PMP甲醇溶液各1 mL，混勻后70℃反應(yīng)30 min，冷卻后加入0.3 mol/L的HCl調(diào)節(jié)至中性，隨后使用三氯甲烷反復(fù)萃取過量的PMP，移取水層并稀釋至5 mL供HPLC進(jìn)樣分析。

HPLC分析條件如下：色譜柱為CAPCELL PAK C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），進(jìn)樣量為10 μL，pH 6.8 0.05 mol/L磷酸緩沖液-乙腈（體積比為82∶18）等度洗脫，柱溫為30℃，流速為0.6 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為245 nm。

3 結(jié) 果

3.1 多糖含量的測(cè)定結(jié)果 去除小分子雜質(zhì)和蛋白的黃精多糖半精品190～600 nm波長(zhǎng)范圍的紫外光譜圖見圖1，回流、超聲和酶法獲得的黃精多糖半精品在260 nm和280 nm處均無吸收峰，表明不同提取方法所得到的黃精多糖半精品均不含有蛋白質(zhì)和核酸[12-13]。

圖1 黃精總多糖紫外掃描圖

黃精藥材經(jīng)不同提取方法所得的黃精粗品、半精品和不同性質(zhì)組分的黃精多糖得率見表1。當(dāng)采用酶法提取時(shí)，黃精多糖粗品和半精品得率最高，而回流法對(duì)黃精多糖粗品、半精品和不同性質(zhì)的3個(gè)組分得率均最低。

表1 不同提取方法黃精多糖得率（%）

3.2 黃精多糖抗氧化活性結(jié)果 以DPPH清除率表征黃精多糖的抗氧化活性[14]。黃精藥材經(jīng)不同提取方法所得的黃精粗品、半精品和不同性質(zhì)組分的抗氧化結(jié)果見圖2，其中超聲法所得黃精粗品和半精品的抗氧化活性最高，而回流法得到的黃精多糖粗品、半精品和不同性質(zhì)的3個(gè)組分的抗氧化活性均最低。

圖2 黃精藥材經(jīng)不同提取方法所得的黃精粗品（A）、半精品（B）和不同性質(zhì)組分（C）的抗氧化結(jié)果

3.3 多糖結(jié)構(gòu)研究

3.3.1 單糖組成結(jié)果 回流法、超聲法和酶法獲得的黃精多糖的單糖組成結(jié)果見圖3、表2。超聲法獲得的黃精多糖粗品含有甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖和巖藻糖，回流法獲得的黃精多糖粗品不含葡萄糖和半乳糖，酶法獲得的黃精多糖粗品不含有葡萄糖。3種提取方法均以巖藻糖單糖摩爾比最高。

圖3 空白對(duì)照（A）、混合多糖對(duì)照品（B）以及回流法（C）、超聲法（D）和酶法（E）獲得的黃精多糖的單糖組成HPLC譜圖

表2 不同提取方法黃精多糖的單糖組成及摩爾比

3.3.2 紅外測(cè)定結(jié)果 回流法、超聲法和酶法獲得的黃精多糖粗品的紅外光譜圖見圖4，結(jié)果表明黃精多糖主要有糖環(huán)上的C-H振動(dòng)吸收峰、O-H振動(dòng)吸收峰、糖醛酸振動(dòng)吸收峰、吡喃環(huán)的醚鍵C-O-C振動(dòng)吸收峰及吡喃糖骨架吸收峰。此外回流法和酶法提取的多糖有水合振動(dòng)吸收峰，而超聲法沒有此吸收峰；回流法和超聲法提取的黃精多糖存在苷鍵為β-構(gòu)型的吸收峰，而酶法提取的多糖不含此吸收峰。

圖4 回流法（A）、超聲法（B）和酶法（C）獲得的黃精多糖紅外光譜圖

4 討 論

黃精為藥食同源的中草藥，具有健脾、潤(rùn)肺、益腎、生津等功效，相繼被《名醫(yī)別錄》《本草綱目》和《新修本草》等歷代本草所記載。多糖是黃精的主要成分，具有多種生物活性，如抗衰老、抗腫瘤、增強(qiáng)免疫力、降血脂、降血糖及抗氧化損傷等。

筆者通過比較回流法、超聲法和酶法3種方法黃精多糖的結(jié)構(gòu)特征和抗氧化活性，以期為黃精多糖的研究開發(fā)提供依據(jù)。已有文獻(xiàn)報(bào)道[10]顯示，分別采用果膠酶、纖維素酶、木瓜蛋白酶提取黃精多糖，木瓜蛋白酶處理后的多糖含量最高，并且有利于后續(xù)除去蛋白質(zhì)雜質(zhì)，故本實(shí)驗(yàn)選擇木瓜蛋白酶進(jìn)行黃精多糖的提取。研究表明，3種方法中酶法所獲得的黃精多糖的含量和抗氧化活性均高于超聲法，而回流法所得的黃精多糖含量和抗氧化活性最低。無論是單糖組成，還是糖環(huán)形式和糖苷鍵類型，3種提取方法所獲得的黃精多糖粗品均比較相似，但略有差別。黃精多糖粗品經(jīng)季銨鹽沉淀法分離得到不同性質(zhì)多糖，3種提取方法純化后均以堿性AP3組分的含量最高，超聲法所獲得的AP3組分抗氧化活性最高。超聲提取是利用超聲波輻射產(chǎn)生強(qiáng)烈的空化效應(yīng)、機(jī)械振動(dòng)、擾動(dòng)效應(yīng)、擴(kuò)散和擊碎等多種作用，增加物質(zhì)分子振動(dòng)的頻率和速度、溶劑的穿透力，從而擊破黃精細(xì)胞壁的破裂促進(jìn)多糖進(jìn)入溶劑，實(shí)現(xiàn)多糖的快速、高效提取。與回流提取和酶法相比，超聲提取具有無需加熱、提取率高、成本低、操作簡(jiǎn)便，且不破壞化學(xué)成分的結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)[15-16]。

綜上所述，出于對(duì)黃精多糖提取效率、抗氧化活性和工藝成本的綜合考慮，可選擇超聲法作為優(yōu)選的提取方法。